專利名稱：快速篩選嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物高產(chǎn)乙醇菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于特定微生物生理性狀的突變和化學(xué)誘變篩選領(lǐng)域，具體是采用定向進(jìn) 化和化學(xué)誘變相結(jié)合的手段，對(duì)嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物進(jìn)行突變，通過顯色反應(yīng)，快速篩選 高產(chǎn)乙醇菌株。
背景技術(shù)：
隨著全球經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，石油、煤炭、天然氣等不可再生能源日益耗竭，并且燃 燒化石能源排放的大量溫室氣體嚴(yán)重的破壞了生態(tài)環(huán)境([Cifuentes，L.，Borja-Aburto, V. H. , Gouveia, N. , Thurston, G. , Davis, D. L. 2001. Climate change. Hidden health benefits of greenhouse gas mitigation. Science 293,1257-1259·]、[Lashof, D. A., Ahuja, D. R. 1990. RelativeContributions of Greenhouse Gas Emissions to Global Warming. Nature 344，529-531.])，世界各國不得不努力開發(fā)并利用綠色低碳的可再生能 源。生物乙醇作為一種新型清潔能源([Hahn-Hagerdal，B.，Galbe, M.，Gorwa-Grauslund, M. F. ,Liden,G. ,Zacchi,G. 2006. Bio-ethanol—the fuel oftomorrow from the residues of today. Trends Biotechnol 24，549-556.])，正逐步作為動(dòng)力燃料添加到汽油中，很大 程度上減少了人們對(duì)化石能源的依賴。美國和巴西是生物乙醇的主要生產(chǎn)國，由于使用玉 米、甘蔗等糧食作物作為原料，不僅存在與人爭糧的問題，還需要大面積的毀林開荒種植原 材料([Timothy Searchinger,R. H. ,R. A. Houghton,Fengxia Dong. AmaniElobeid, Jacinto Fabiosa，Simla TokgoziDermot Hayes,Tun-Hsiang Yu. .2008. Use of U. S.Croplands for biofuels increases greenhouse gases throughemissions from land-use change.. Science. 319，1238-1240.])，經(jīng)過幾年的研究探索后，人們逐漸意識(shí)到必須大力發(fā)展以非 糧食作物為原料的生物乙醇。木質(zhì)纖維素是世界上最豐富的可再生原料，纖維素乙醇正是利用了這些含有纖維 素、半纖維素的農(nóng)林廢棄物來發(fā)酵生產(chǎn)乙醇([Lynd，L. R. 1996. Overview and evaluation of fuel ethanol from cellulosic biomass -Technology,economics,the environment, and policy. Annual Review of Energy and theEnvironment 21,403-465·])。但是目前 在工業(yè)應(yīng)用中碰到的主要問題是成本過高，究其原因是加工過程繁瑣造成的，即首先需要 借助物理、化學(xué)或生物手段將纖維素降解為單糖，然后才能利用酵母等微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙 醇。因而若能夠?qū)⒗w維素的水解過程和糖發(fā)酵過程整合在一起，必能縮短生產(chǎn)周期，降低生 產(chǎn)成本。聯(lián)合生物加工(Consolidated Bioprocessing,CBP)技術(shù)解決了這一難題([Lynd， L. R. , van Zyl, W. H. , McBride, J. Ε. , Laser, Μ. 2005. Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass :an update. CurrOpin Biotechnol 16, 577-583.]),艮口在高溫厭氧的 條件下，采用一種或者多種微生物混合發(fā)酵，降解纖維素產(chǎn)生還原糖的同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇， 一步就可將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇。但該方法目前的瓶頸是乙醇產(chǎn)量太低，不能投入生產(chǎn)。誘 變篩選高產(chǎn)乙醇菌株是解決這個(gè)問題最直接有效的辦法。目前高產(chǎn)乙醇菌株較為普遍的篩選方法是直接篩選乙醇耐受菌株，如酵母菌的高產(chǎn)乙醇菌株的篩選，通常采用化學(xué)或者紫外線誘變后涂布到高濃度乙醇平板上，然后挑 選能夠耐受高濃度乙醇的克隆([(侯麗華，馬平生。2007，一種構(gòu)建釀酒酵母乙醇高產(chǎn)菌 株的方法。CN 101323837A.])，再從中篩選高產(chǎn)乙醇菌株。此方法工作量大，耗時(shí)長，篩 選效率低，而且不適合嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物，原因是乙醇耐受性是制約酵母產(chǎn)醇的主要 因素，但對(duì)于嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物，如嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌([Wiegel J.，L.L.G. 1981. Thermoanaerobacter ethanolicus gen. nov. ,spec.nov.,a new,extreme thennophilic, anaerobic bacterium. Arch Microbiol. 128，343-348.])，其胞內(nèi)糖酵解途徑的產(chǎn)物種類 很多，在低底物濃度的時(shí)候，主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇，但底物濃度一旦超過(w/v)，發(fā)酵產(chǎn) 物則由乙醇轉(zhuǎn)向乙酸和乳酸等副產(chǎn)物。由此可見，高底物濃度時(shí)副產(chǎn)物的累積是制約乙醇 產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了如下兩個(gè)篩選平板乙醇-TTC(2，3，5-三苯基氯化四 氮唑)顯色平板和CaC03_高糖平板，以高效的篩選乙醇高產(chǎn)菌株。乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)是乙醇生成途徑中的關(guān)鍵酶，其活性的高低直接影響產(chǎn)物的產(chǎn)量，TTC 與ADH反應(yīng)，生成紅色物質(zhì)，其顏色深淺與ADH活性成正比。乙醇-TTC顯色平板可以篩選 出具有一定乙醇耐受性且ADH活性高的菌株。CaCO3可以和分泌到胞外的副產(chǎn)物乙酸、乳酸 生成可溶性的乙酸鈣和乳酸鈣，產(chǎn)酸越多消耗的CaCO3越多，CaCO3平板上形成的透明圈就 越大，即在相同菌落半徑的情況下，透明圈直徑的大小直接反映產(chǎn)酸的多少。CaCO3-高糖平 板可以篩選出高底物濃度下產(chǎn)酸少的菌株，為避免假陽性菌落，通過在菌落上滴加PH指示 劑提高篩選結(jié)果的可靠性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速篩選乙醇高產(chǎn)菌株的方法。 本發(fā)明的創(chuàng)新性在于把乙醇適應(yīng)性進(jìn)化和化學(xué)誘變相結(jié)合，篩選乙醇耐受菌株， 并且在篩選方法上從產(chǎn)酸途徑入手，聯(lián)合了乙醇-TTC顯色平板和CaC03-高糖平板，可在短 時(shí)間內(nèi)篩選出具有一定乙醇耐受性、乙醇脫氫酶活力高、且在高底物濃度下產(chǎn)酸少的菌株， 并通過在菌落上滴加PH指示劑提高篩選結(jié)果的可靠性。從而改變公知技術(shù)中對(duì)酵母的高 產(chǎn)乙醇菌株的篩選，是將低的乙醇耐受性作為主要制約因素，此法工作量大，耗時(shí)長，篩選 效率低，且不適用于嗜熱厭氧菌的缺陷。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的本發(fā)明快速篩選嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物乙醇高產(chǎn) 菌株的方法，包括如下步驟1)將野生型菌株在含有乙醇的液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，定向進(jìn)化嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇 微生物的乙醇耐受性；2)對(duì)耐受乙醇的菌株進(jìn)行甲基磺酸乙酯(EMS)誘變，將誘變后的菌液涂布到含有 乙醇的固體培養(yǎng)基上；3)待形成單菌落后，選擇菌落半徑大的單菌落滴加2，3，5_三苯基氯化四氮唑 (TTC)顯色液，用無菌牙簽蘸取顯色顏色深的單斑到含有高底物濃度的CaCO3平板上進(jìn)行復(fù) 篩；4)選擇菌落半徑大但透明圈半徑小的菌落，滴加pH指示劑排除假陽性；5)發(fā)酵后用氣相色譜或乙醇定量試劑盒測定乙醇濃度，選擇乙醇產(chǎn)量高的菌株在 非選擇條件下培養(yǎng)至少20代，仍能保持高乙醇產(chǎn)量的菌株即為目的菌株。
所述的方法中，步驟1中的嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物是指最適生長溫度高于50°C、 嚴(yán)格或兼性厭氧、存在產(chǎn)酸和產(chǎn)乙醇代謝途徑的革蘭氏陽性菌，主要包括嗜熱厭氧產(chǎn) Zi If If lif (Thermoanaerobacter ethanolicus) ^^ ^m ^ BiMiMM (Thermoanaerobium brockii)、嗜熱硫化氧梭菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)> 熱纖梭菌 (Clostridium thermocellum)禾口嗜熱角軍糖梭菌(Clostridium thermosaccharoIyticum)。所述的方法中，步驟1中乙醇定向進(jìn)化的耐受終濃度按體積濃度計(jì)為2% -15%。所述的方法中，步驟2中甲基磺酸乙酯工作濃度按體積濃度計(jì)為0. 1% -5%。所述的方法中，步驟3中2，3，5-三苯基氯化四氮唑中乙醇終濃度按體積濃度計(jì)為 3% -16%。所述的方法中，步驟3中2，3，5-三苯基氯化四氮唑濃度為l-100mg/ml。

所述的方法中，步驟3中復(fù)篩平板含有0. l-2g/L CaCO3, l-10g/L葡萄糖。所述的方法中，步驟5中非選擇條件下培養(yǎng)至少20代仍能保持乙醇產(chǎn)量按體積濃 度計(jì)在2%以上。本發(fā)明采用定向進(jìn)化和化學(xué)誘變相結(jié)合的手段，對(duì)嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物進(jìn)行突 變，通過顯色反應(yīng)，快速篩選乙醇高產(chǎn)菌株。本發(fā)明的方法適用于一切嗜熱、厭氧并且存在 產(chǎn)酸和產(chǎn)乙醇代謝途徑的革蘭氏陽性細(xì)菌。本發(fā)明能夠快速有效的篩選到高產(chǎn)乙醇菌株， 為生物乙醇工業(yè)提供優(yōu)良菌株。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任 何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例(以嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌為例)1)定向進(jìn)化乙醇耐受性將嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌按體積比1 10接種到已除氧的含(ν/ν)乙醇的RCM 培養(yǎng)基(配方見附件1)中，待菌液長濃后，再1 10接種到含(ν/ν)乙醇的RCM培養(yǎng) 基中，反復(fù)傳5-10代后；將菌液1 10接種到含1.5% (ν/ν)乙醇的RCM培養(yǎng)基中，反復(fù) 傳5-10代后；將菌液1 10接種到含2% (ν/ν)乙醇的RCM培養(yǎng)基中，反復(fù)傳5-10代后； 將菌液1 10接種到含2. 5% (ν/ν)乙醇的RCM培養(yǎng)基中，反復(fù)傳5-10代后，將菌液涂布 在含2. 5% (ν/ν)乙醇的RCM固體培養(yǎng)基上，挑取10-100個(gè)單克隆于含2. 5% (ν/ν)乙醇 的RCM培養(yǎng)基中，選取生長速度最快的克隆。附件1 不同種屬的厭氧微生物培養(yǎng)基配方不同，RCM培養(yǎng)基僅適合嗜熱厭氧產(chǎn)乙 醇桿菌(Themroanaerobacter ethanolicus)。對(duì)于特定的微生物，需要選用相應(yīng)的培養(yǎng)基。 僅需要按照上述步驟在培養(yǎng)基中添加乙醇即可，下同。RCM培養(yǎng)基配制酵母膏3g/L，牛肉 膏10g/L，蛋白胨10g/L，可溶性淀粉lg/L，葡萄糖5g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g/L,NaCl 3g/ L，NaAc3g/L，瓊脂0. 5g/L，刃天青2mg/L，加蒸餾水補(bǔ)至總體積為1L，調(diào)整pH值為6. 8，通隊(duì) 除氧，115°C濕熱滅菌15min。RCM固體培養(yǎng)基配制瓊脂1. 25%，其它同RCM培養(yǎng)基。2) EMS誘變乙醇耐受菌株(1)將活化的嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌乙醇耐受菌株1 100接種到含IOml已除氧的 ATCC 1190培養(yǎng)基(配方見附件2)的Himgate-tube中，60°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)至OD6tltl值約 0.4。(2) 6，OOOrpm離心5min收集菌體，重懸于500 μ 1沒有碳源的ATCCl 190培養(yǎng)基中， 取150 μ 1菌液重懸于3ml沒有碳源的ATCC1190培養(yǎng)基中，60°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2h。(3)在通風(fēng)櫥里，向菌液中加入 40 μ 1 EMS 和 100 μ 1 Tris-HCl (0. 1Μ, ρΗ7· 4，1 % 蔗糖)，漩渦震蕩混勻后，60°C搖床震蕩(120rpm)培養(yǎng)30分鐘。(4)向菌液中加入150 μ 1 2Μ的Na2S2O3中止反應(yīng)，6000rpm離心20min，棄上清， 用ATCC1190培養(yǎng)基洗兩遍，重懸于500μ 1 ATCC1190培養(yǎng)基中。備注ATCC1190培養(yǎng)基 配制=KH2PO4L 5g/L, Na2HPO4 · 12H20 4. 2g/L, NH4ClO. 5g/L, MgCl2 · 6H20 0. 18g/L，酵母浸 出物2. Og/L,葡萄糖5g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0. lg/L，Na2S 0. lg/L，維生素溶液0. 5ml/L, Wolfe' s礦物鹽溶液5. 0ml/L，刃天青(0. 1 % ) 1. 0ml/L，加蒸餾水補(bǔ)至總體積為1L，調(diào)整 PH值為7. 3，通隊(duì)除氧，115°C濕熱滅菌15min。附件2:會(huì)(500ml) :Biotin 20. Omg, p-Aminobenzoic acid 50. Omg, Folicacid 20. Omg, Pantothenic acid calcium salt 50. Omg, Nicotinic acid 50. Omg, Vitamin B12 1. Omg, Thiamine HCl 5. Omg, Pyridoxine hydrochloride 100. Omg, Thioctic acid 50. Omg, Riboflavin 5. Omg0Wolfe' s 礦物鹽溶液(IL) :Nitrilotriacetic acid 1. 5g，MgSO4 · 7H20 3. Og, MnSO4 · H2O 500. Omg, NaCl 1. Og, FeSO4 · 7H20 100. Omg, Co(NO3)2 · 6H20100. Omg, CaCl2 100. Omg, ZnSO4 · 7H20 100. Omg, CuSO4 · 5H20 10. Omg, ALK(SO4)2 10. Omg, Boric acid 10. Omg, Na2MoO4 · 2H20 10. Omg, Na2SeO3L Omg。3)初篩乙醇高產(chǎn)菌株將EMS誘變后的菌液稀釋1000倍，取50 μ 1涂布到含3% (ν/ν)乙醇的RCM固體 平板上，將平板倒置在無氧的厭氧罐中，于60°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待平板上形成單菌落 后，選擇菌落半徑大的單斑滴加10mg/ml的TTC溶液(pH7. 4，0. IM磷酸鹽緩沖液，0. 22 μ m 濾膜過濾除菌)，顯色10分鐘后，挑取顯色后呈深紅色的菌落進(jìn)行下一步復(fù)篩。4)復(fù)篩乙醇高產(chǎn)菌株用無菌牙簽蘸取深紅色菌落到復(fù)篩平板上，復(fù)篩平板為含有0.5g/LCaC0dni0g/L 葡萄糖的RCM固體平板，將平板倒置在無氧的厭氧罐中，60°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待平板上 形成單菌落后，挑取菌落半徑大但透明圈半徑小的菌落，滴加剛果紅PH指示劑，選擇偏紅 色的單菌落；或者滴加甲基紅PH指示劑，選擇偏黃色的單菌落。剛果紅pH指示劑配方稱取剛果紅0. 5g，溶解于100ml 10%的乙醇中(0. 22 μ m 濾膜過濾除菌)，變色范圍是PH 3.0 5.0，顏色由藍(lán)變紅。甲基紅pH指示劑配方稱取甲 基紅0. Ig,溶解于7. 4ml 0. 05mol/L的氫氧化鈉溶液中，再加水稀釋至200ml (0. 22 μ m濾膜 過濾除菌)，變色范圍是PH4. 2 6. 3，顏色由紅變黃。5)產(chǎn)物穩(wěn)定性檢測將篩選到的菌株和野生型菌株在含有l(wèi)g/L葡萄糖的ATCC1190培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵 實(shí)驗(yàn)，60°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)60小時(shí)，取樣用氣相色譜測定乙醇濃度。將乙醇產(chǎn)量顯著高 于野生型菌株的菌株連續(xù)培養(yǎng)20代，產(chǎn)量高且性狀穩(wěn)定的菌株即為乙醇高產(chǎn)菌株。利用上述方法可以在1個(gè)月之內(nèi)得到乙醇耐受性6% (體積比)以上，產(chǎn)量3%(體積比)以上的高產(chǎn)乙醇的菌株。
權(quán)利要求
一種快速篩選嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物高產(chǎn)乙醇菌株的方法，主要步驟如下1)將野生型菌株在含有乙醇的液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，定向進(jìn)化嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物的乙醇耐受性；2)對(duì)耐受乙醇的菌株進(jìn)行甲基磺酸乙酯誘變，將誘變后的菌液涂布到含有乙醇的固體培養(yǎng)基上；3)待形成單菌落后，選擇菌落半徑大的單菌落滴加2，3，5-三苯基氯化四氮唑顯色液，取顯色顏色深的單斑到含有高底物濃度的CaCO3復(fù)篩平板上進(jìn)行復(fù)篩；4)選擇菌落半徑大但透明圈半徑小的菌落，滴加pH指示劑排除假陽性；5)發(fā)酵后用氣相色譜或乙醇定量試劑盒測定乙醇濃度，選擇乙醇產(chǎn)量高的菌株在非選擇條件下培養(yǎng)至少20代，仍能保持高乙醇產(chǎn)量的菌株即為目的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟1中的嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物是指最適 生長溫度高于50°C、嚴(yán)格或兼性厭氧、存在產(chǎn)酸和產(chǎn)乙醇代謝途徑的革蘭氏陽性菌，主 要包括嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜熱厭氧細(xì)菌 (Thermoanaerobiumbrockii)、B譽(yù)熱硫化M1 梭菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)、 熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)禾口嗜熱角軍糖梭菌(Clostridiumthermosaccharoly ticum)ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟1中乙醇定向進(jìn)化的耐受終濃度按體積濃度 計(jì)為 2% -15%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟2中甲基磺酸乙酯工作濃度按體積濃度計(jì)為 0. 1% -5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟3中2，3，5-三苯基氯化四氮唑中乙醇終濃 度按體積濃度計(jì)為3% -16%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟3中2，3，5_三苯基氯化四氮唑濃度為 l-100mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟3中復(fù)篩平板含有0.l-2g/LCaC03, l-10g/L葡萄糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟5中非選擇條件下培養(yǎng)至少20代仍能保持 乙醇產(chǎn)量按體積濃度計(jì)在2%以上。
全文摘要
一種快速篩選嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物高產(chǎn)乙醇菌株的方法，主要步驟如下1)將野生型菌株在含有乙醇的液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，定向進(jìn)化嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇微生物的乙醇耐受性；2)對(duì)耐受乙醇的菌株進(jìn)行甲基磺酸乙酯誘變，將誘變后的菌液涂布到含有乙醇的固體培養(yǎng)基上；3)待形成單菌落后，選擇菌落半徑大的單菌落滴加2，3，5-三苯基氯化四氮唑顯色液，取顯色顏色深的單斑到含有高底物濃度的CaCO3復(fù)篩平板上進(jìn)行復(fù)篩；4)選擇菌落半徑大但透明圈半徑小的菌落，滴加pH指示劑排除假陽性；5)發(fā)酵后用氣相色譜或乙醇定量試劑盒測定乙醇濃度，選擇乙醇產(chǎn)量高的菌株在非選擇條件下培養(yǎng)至少20代，仍能保持高乙醇產(chǎn)量的菌株即為目的菌株。
文檔編號(hào)C12R1/145GK101845434SQ20101014912
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月19日
發(fā)明者宋厚輝, 徐健, 籍月彤 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所