專利名稱：脫細(xì)胞韌帶支架和種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脫細(xì)胞韌帶支架和種子細(xì)胞復(fù)合培
養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
韌帶和肌腱損傷后修復(fù)后愈合能力差是臨床上常見的問題，這使得多種替代物應(yīng) 用于韌帶和肌腱的修復(fù)重建。其中異體、異種韌帶和肌腱移植物材料支架有韌帶和肌腱支 架的固有特點(diǎn)，隨著脫細(xì)胞技術(shù)及滅菌技術(shù)的發(fā)展，宿主對(duì)異體、異種韌帶支架的免疫排斥 和疾病傳染已大大降低，使得韌帶和肌腱脫細(xì)胞支架在臨床應(yīng)用成為可能。目前韌帶和肌 腱脫細(xì)胞韌帶支架制備方法往往聯(lián)合應(yīng)用物理、化學(xué)和酶法行脫細(xì)胞，獲得的脫細(xì)胞韌帶 具有天然的韌帶細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且具有良好的生物相容性。但脫細(xì)胞韌帶支架目前并不能廣泛用于組織工程韌帶研究，究其原因如下首先， 獲得的韌帶脫細(xì)胞肌腱具有韌帶和肌腱固有的細(xì)胞外基質(zhì)和腱膜屏障，這不利于韌帶成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有完整腱膜的脫細(xì)胞肌腱植入體內(nèi)3周后，腱膜能阻擋炎癥 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞向支架內(nèi)部遷移，這雖然有利于維持組織工程肌腱的內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但 給種子細(xì)胞的植入帶來很大困難。體外復(fù)合培養(yǎng)時(shí)，完整的腱膜屏障作用使得種子細(xì)胞不 能接觸腱膜下結(jié)構(gòu)。其次，種子細(xì)胞代謝分裂活躍，如骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，其體 積大于韌帶和肌腱內(nèi)部代謝不活躍的韌帶纖維細(xì)胞和肌腱纖維細(xì)胞(參見文獻(xiàn)高英茂主 編，組織學(xué)與胚胎學(xué)，北京人民出版社，2005 :37-38.)，因此脫細(xì)胞支架內(nèi)的天然孔隙不 利于代謝活躍的種子細(xì)胞浸潤(rùn)。(參見文獻(xiàn)1. GRATZER PF, HARRISON RD, WOODS Τ. Matrix alteration and not residualsodium sulfate cytotoxicity affects the cellular repopulation of a decellularizedmatrix. Tissue-Eng. 2006 ； 12 (10) 2975-83. 2. Brown AL, Brook-Allred TT, Waddell JE, White J, Werkmeister JA, Ramshaw JA, Bagli DJ, Woodhouse KA. Bladder acellular matrix as a substrate for studying in vitro bladder smoothmuscle-urotheIial cell interactions. Biomaterials. 2005 ；26 (5) 529-43.)使用超聲波(見圖2)、多點(diǎn)注射(見圖3)、氧化等方法增加韌帶或肌腱脫細(xì)胞支 架的孔隙，但支架內(nèi)的種子細(xì)胞分布不均勻、量少且局限。這均使得韌帶脫細(xì)胞支架應(yīng)用受 限制。膠原、蠶絲等纖維材料制成的韌帶支架有足夠大的孔隙率，種子細(xì)胞可以隨著細(xì) 胞懸液的滲透進(jìn)入韌帶支架內(nèi)部進(jìn)行生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種脫細(xì)胞韌帶支架和種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)方法，該方法有 利于種子細(xì)胞隨著細(xì)胞懸液的滲透進(jìn)入韌帶支架內(nèi)部進(jìn)行生長(zhǎng)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)韌帶脫細(xì)胞支架孔隙率小，體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞不能遷移入支架內(nèi) 部生長(zhǎng)，這是脫細(xì)胞韌帶支架在韌帶組織工程中應(yīng)用受限制的主要原因。本發(fā)明人在制備韌帶脫細(xì)胞支架過程中發(fā)現(xiàn)，低溫干燥脫細(xì)胞韌帶支架的膠原纖維是可以分離的，膠原纖 維保留完整性，并且具有一定強(qiáng)度。這使得增加脫細(xì)胞韌帶支架膠原纖維的間隙成為可能。 通過Y射線進(jìn)行消毒，能有效殺滅細(xì)菌，使得無菌的脫細(xì)胞韌帶保持干燥，便于細(xì)胞懸液 的滲透。本發(fā)明提供了一種脫細(xì)胞韌帶支架和種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟1)將脫細(xì)胞韌帶支架低溫干燥，溫度以-80°C至_40°C為宜，優(yōu)選_56°C ；2)通過物理方法將凍干的脫細(xì)胞韌帶結(jié)構(gòu)適當(dāng)松散，以不影響生物力學(xué)性質(zhì)為前 提，增加脫細(xì)胞韌帶結(jié)構(gòu)的空隙率；3)脫細(xì)胞韌帶的消毒將脫細(xì)胞韌帶包裝后使用Y射線消毒；4)種子細(xì)胞種植將韌帶成纖維細(xì)胞消化離心懸液滴在脫細(xì)胞韌帶表面，韌帶成 纖維細(xì)胞隨著懸液的滲透，達(dá)到脫細(xì)胞韌帶支架內(nèi)部，進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)。上述的物理方法如擠壓、錘擊、震蕩等方法，可以使低溫干燥脫細(xì)胞韌帶支架孔隙 率增大，物理方法的使用應(yīng)不明顯破壞脫細(xì)胞韌帶支架的生物力學(xué)為原則。上述方法，可以應(yīng)用于組織工程韌帶/肌腱的制備。γ射線進(jìn)行滅菌，照射總劑量15KGray，能有效滅菌。低溫干燥韌帶或肌腱脫細(xì)胞支架內(nèi)部不含水分，通過適當(dāng)?shù)奈锢矸椒?如擠壓、 錘擊、震蕩)處理可以使得膠原纖維致密程度降低，使得膠原纖維間的孔隙增大，有利于種 子細(xì)胞懸液的滲透，細(xì)胞進(jìn)入脫細(xì)胞支架內(nèi)部。組織學(xué)檢查表明(見圖1)，本方法能使成纖維細(xì)胞較均勻分布在脫細(xì)胞韌帶支架 內(nèi)部，并能貼附在膠原纖維生長(zhǎng)。本方法較相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道(見圖2、3)種子細(xì)胞植入方法， 膠原結(jié)構(gòu)破壞小，細(xì)胞滲透好，具有有明顯優(yōu)勢(shì)。


圖1本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)一周后HE染色組織切片圖(200倍)。
2 ^ id 自 Ingram JH, Korossis S, Howling G, Fisher J, Ingham Ε. The use ofultrasonication to aid receIlularization of acellular natural tissue scaffolds for usein anterior cruciate ligament reconstruction. Tissue-Eng. 2007 ； 13(7) :1561-72. (400倍，箭頭指的是肌腱細(xì)胞) 3 ^id 自 Tischer Τ, Vogt S, Aryee S, Steinhauser Ε, Adamczyk C, Milz S, Martinek V. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament :a new methodusing acellularized tendon allografts and autologous fbroblasts.Arch OrthopTrauma Surg 2007 ；127 :735_741其中c(X25)肌腱細(xì)胞培養(yǎng)4天，d(X25)肌腱細(xì)胞培養(yǎng)14天。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。實(shí)施例兔組織工程脫脫細(xì)胞韌帶支架和種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)方法和評(píng)價(jià)1、取材選用新西蘭家兔(約3kg，第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，下同)，完整切除髕韌帶及其脛腓骨止點(diǎn)，清除韌帶外滑膜組織，必須保證韌帶外膜完整，無菌PBS液中 4°C保存。2、脫細(xì)胞(I)IOmM的低滲tris緩沖液+絲氨酸蛋白酶抑制劑(0. 05%苯甲基磺酰氟化物乙 醇溶劑，35ml/L 50ml 乙醇 +25mgPMSF)，持續(xù) 48h。(2) 0. 01 % 胰蛋白酶 +0. 02 % EDTA 8h(3) 1 % 脫氧膽酸鈉(DCA) 24h(4) Hank' s 緩沖液 + 核酸酶(DNase I 200 μ g/ml+RNase I 20 μ g/ml) 5h(5) PBS沖洗4他后_80 V保存所有步驟均在搖床(150RPM)進(jìn)行，均加5ml/L青霉素/鏈霉素溶液(10000U/ml 10000mg/ml)溶液預(yù)防感染，完成每一步驟均使用PBS沖洗3邊。3、組織學(xué)檢查取脫細(xì)胞后兩組標(biāo)本給予石蠟包埋，切片(5 μ m)、HE染色觀察。觀察細(xì)胞核成分 (蘇木素染色)，膠原排列形態(tài)(伊紅染色)，見細(xì)胞成分完全脫除。4、脫細(xì)胞韌帶處理脫細(xì)胞韌帶低溫干燥后，使用物理方法將其適當(dāng)擠壓、錘擊，使膠原纖維變適當(dāng)松 軟，注意保持脫細(xì)胞韌帶支架外膜完整。注意不同韌帶或肌腱處理方式不一樣，過度處理容 易破壞膠原結(jié)構(gòu)而影響脫細(xì)胞韌帶力學(xué)。5、脫細(xì)胞韌帶消毒將脫細(xì)胞韌帶支架密封包裝，使用、射線(15KGray)消毒，將消毒的脫細(xì)胞韌帶 加入10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液24h后未見菌落生長(zhǎng)。6、種子細(xì)胞的培養(yǎng)髕韌帶成纖維細(xì)胞的分離新西蘭大白兔(3月戊巴比妥鈉靜脈麻醉后，在 無菌操作下取髕韌帶，PBS沖洗，并徹底清除髕韌帶滑膜及周圍軟組織。用膠原酶處理 15min(37°C )，PBS沖洗3邊后將髕韌帶剪成Imm3組織塊，間隔3mm鋪在培養(yǎng)皿(10X IOcm2) 上，加少量10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液。組織塊貼壁后(4h)加10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液覆 蓋組織塊，培養(yǎng)液沒3-4天更換一次。分離的第三代成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。7、種植方法將韌帶成纖維細(xì)胞消化離心懸液(細(xì)胞濃度106/ml)，滴在脫細(xì)胞韌帶表面，韌帶 成纖維細(xì)胞隨著懸液的滲透，達(dá)到脫細(xì)胞韌帶內(nèi)部。8、復(fù)合培養(yǎng)將滲透細(xì)胞懸液的脫細(xì)胞韌帶懸空培養(yǎng)4小時(shí)，使細(xì)胞貼壁，每隔Ih加細(xì)胞培養(yǎng) 液，保持韌帶濕潤(rùn)。而后移入培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)1周。9、組織學(xué)檢查培養(yǎng)1周后取組織工程韌帶，在室溫下OCT膠浸潤(rùn)lh，而后至于_20°C 30min,行冰 凍切片，取脫細(xì)胞韌帶支架中間層面行HE染色。如圖1所示，韌帶支架表面見種子細(xì)胞堆 積，支架內(nèi)部見韌帶成纖維細(xì)胞貼附膠原纖維表面，生長(zhǎng)形態(tài)(細(xì)胞核呈梭形)良好，膠原 纖維結(jié)構(gòu)無明顯破壞。
權(quán)利要求
一種脫細(xì)胞韌帶支架和種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟A)將脫細(xì)胞韌帶支架低溫干燥，溫度是-80℃至-40℃；B)通過物理方法將凍干的脫細(xì)胞韌帶結(jié)構(gòu)適當(dāng)松散，以不影響生物力學(xué)性質(zhì)為前提，增加脫細(xì)胞韌帶結(jié)構(gòu)的空隙率；C)脫細(xì)胞韌帶的消毒使用γ射線消毒；D)種子細(xì)胞種植將韌帶成纖維細(xì)胞消化離心懸液滴在脫細(xì)胞韌帶表面，韌帶成纖維細(xì)胞隨著懸液的滲透，達(dá)到脫細(xì)胞韌帶支架內(nèi)部，進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫細(xì)胞韌帶支架和種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)方法，其特征在于 該方法中步驟A)將脫細(xì)胞韌帶支架低溫干燥，溫度是_56°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種脫細(xì)胞韌帶支架和種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)方法，其特征 在于其中所述的物理方法是擠壓、錘擊或震蕩。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種脫細(xì)胞韌帶支架和種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)方法，其特 征在于該方法中步驟C)脫細(xì)胞韌帶的消毒將脫細(xì)胞韌帶支架密封包裝，使用Y射線 15KGray 消毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脫細(xì)胞韌帶支架和種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)方法。韌帶脫細(xì)胞支架孔隙率小，體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞不能向支架內(nèi)部生長(zhǎng)，這是脫細(xì)胞韌帶支架在韌帶組織工程中應(yīng)用受限制的主要原因。本發(fā)明將脫細(xì)胞韌帶低溫干燥后，通過擠壓等物理方法容易使得膠原纖維間隙適當(dāng)增大，而且干燥的脫細(xì)胞韌帶便于種子細(xì)胞懸液的滲透。這樣通過滲透方法直接使種子細(xì)胞進(jìn)入脫細(xì)胞韌帶支架內(nèi)部。通過體外培養(yǎng)1周，HE染色見細(xì)胞在脫細(xì)胞韌帶內(nèi)部貼附著膠原纖維生長(zhǎng)。本發(fā)明的方法有利于種子細(xì)胞隨著細(xì)胞懸液的滲透進(jìn)入韌帶支架內(nèi)部進(jìn)行生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101829359SQ201010149798
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者周盛源, 朱巍, 陳雄生 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)