專利名稱：假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白及其制 備方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是指一類由12 100個(gè)氨基酸組成、 帶有凈正電荷、表現(xiàn)兩親性的且具有抗菌活性的小分子多肽。有關(guān)抗菌肽的研究已經(jīng)有 50多年的歷史，迄今為止，已鑒定各種不同宿主來源的抗菌肽約有880種(Brogden K. A.， 2005)。抗菌肽由于其廣譜的抗菌活性(包括針對革蘭氏陽性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、 甚至病毒等)而受到許多研究者的關(guān)注。特別是近年來，隨著抗生素的濫用而導(dǎo)致帶有抗 生素抗性的致病菌的不斷出現(xiàn)，急需開發(fā)出新一代的抗菌藥物。許多研究者認(rèn)為，抗菌肽巨 大的藥用潛力將有望成為抗生素的替代品之一。因此，近年來有關(guān)抗菌肽的各種研究進(jìn)展 都非常迅速，其中包括從抗菌肽的純化、表征、基因克隆及重組表達(dá)到晶體結(jié)構(gòu)的解析、分 子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究，人們對抗菌肽的了解將更加廣泛和深入。2003年，Mygind等人(Mygind P. H.，et al.，2005)首次報(bào)道從絲狀真菌一假黑盤 菌(Pseudoplectania nigrella)中鑒定和純化出一種defensin家族的抗菌肽一假黑盤菌 素(plectasin)，并解析了該多肽的三維結(jié)構(gòu)(PDB ID :1ZFU)。假黑盤菌素的氨基酸序列和 結(jié)構(gòu)分析表明它具有哺乳動物抗菌肽defensins家族的特征，但它的二硫鍵排列方式又 不同于任何一種亞家族，而與昆蟲來源的一些defensins相同。通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)假 黑盤菌素對多種常見的人類革蘭氏陽性病原細(xì)菌一包括抗生素敏感型及其耐藥菌株都具 有較強(qiáng)的抗菌作用(如表1所示)，而且其抑菌濃度與殺菌濃度沒有顯著性差異。表1.假黑盤菌素可作用于多種革蘭氏陽性病原細(xì)菌
Mygind等人曾將假黑盤菌素基因?qū)朊浊够蚝谇怪械玫街亟M表達(dá)，其中米曲霉的表達(dá) 量較高，達(dá)到了 10 50mg/L。畢赤酵母(Pichia pastoris)是甲醇營養(yǎng)型酵母中的一種，它能夠在以甲醇為唯 一碳源的培養(yǎng)基中生長。甲醇營養(yǎng)型酵母還包括漢遜酵母、假絲酵母和球擬酵母等(熊向 華，2006)，而畢赤酵母是最為成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，目前已有上百種外源蛋白在 畢赤酵母中獲得表達(dá)。外源基因在畢赤酵母中的表達(dá)需要有幾個(gè)基本條件一是需要有高 效的啟動子和終止子；二是要有同源序列以便外源基因能夠有效地整合到畢赤酵母基因組 中；三是要有高通量的篩選方法。另外，影響外源基因在畢赤酵母中表達(dá)的還有培養(yǎng)條件、 密碼子的偏好性以及蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)等等。目前，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有一些啟動子和終止子可應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，其中應(yīng) 用最為廣泛的誘導(dǎo)型啟動子是畢赤酵母乙醇氧化酶(Alcohol Oxidase, A0X)啟動子，在畢 赤酵母中，有兩個(gè)不同的基因編碼乙醇氧化酶分別是A0X1和A0X2，二者之間有97%的氨 基酸序列同源性。在畢赤酵母細(xì)胞中，基因A0X1的表達(dá)對乙醇氧化酶活性起主要作用。甲 醇代謝的第一步是甲醇氧化，生成甲醛和氫過氧化物。為避免細(xì)胞氫過氧化物中毒，甲醇代 謝在過氧化物酶體中進(jìn)行。A0X1基因的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，而且受甲醇誘導(dǎo)時(shí)可以達(dá)到 很高的水平，典型的是當(dāng)畢赤酵母細(xì)胞在含甲醇的培養(yǎng)基中生長時(shí)，A0X1表達(dá)產(chǎn)物可占總 可溶性蛋白的30%以上。目前外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)一般是通過外源基因整合到畢赤酵母染色體 基因組中的方式，雖然也有一些攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒(如2 iO在畢赤酵母中能夠獨(dú)立 復(fù)制并表達(dá)外源蛋白的報(bào)道，但這種非整合型的表達(dá)方式存在著質(zhì)粒不穩(wěn)定和易丟失等缺 點(diǎn)，目前已很少有人應(yīng)用。外源基因整合到畢赤酵母染色體基因組中需要有同源序列，即外 源基因若要整合到酵母基因組中，載體中需要包含一段核苷酸序列，它們與酵母基因組中 某段DNA序列完全相同或基本一致，常用的同源序列有畢赤酵母來源的某個(gè)啟動子或終止 子等。有了同源序列還不夠，外源質(zhì)粒的狀態(tài)也會極大的影響整合的效率，線性質(zhì)粒的整合 效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于環(huán)形質(zhì)粒，而線性化的位點(diǎn)在不破壞外源基因的條件下，外源基因的整合既 可以發(fā)生在同源序列的內(nèi)部，也可以在外部，都不影響整合的效率。高通量的篩選方法對獲得高效表達(dá)外源基因的重組菌株來說也是十分重要的。通 常用于表達(dá)外源蛋白的畢赤酵母菌株都是基因缺陷型菌株，例如本實(shí)驗(yàn)中所使用的GS115 菌株就是組氨酸基因缺陷型的，當(dāng)攜帶有組氨酸合成酶基因的外源質(zhì)粒整合到該酵母基因 組中時(shí)，恢復(fù)了 GS115合成組氨酸合成酶的能力，使只有整合了外源質(zhì)粒的重組菌才能夠 在組氨酸缺陷的培養(yǎng)基中生長。除了使用缺陷型酵母菌株作為篩選標(biāo)記外，外源質(zhì)粒上還 應(yīng)攜帶有某種抗性基因以便使重組菌株產(chǎn)生相應(yīng)的抗生素抗性，例如G418抗性或Zeocin 抗性等，根據(jù)重組菌株對抗生素抵抗能力的不同，可對外源基因整合的拷貝數(shù)進(jìn)行粗略的 篩選?？截悢?shù)的多少對外源蛋白表達(dá)量的影響還需實(shí)驗(yàn)確定。質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化酵母后，可以 先利用缺陷型培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，能夠生長的重組菌株再轉(zhuǎn)接到含有不同濃度抗生素的培養(yǎng) 基進(jìn)行拷貝數(shù)多寡的的篩選，也可以將轉(zhuǎn)化后的菌液直接涂布在抗生素篩選平板上，由于 抗生素抗性物質(zhì)的積累需要一定時(shí)間，會使重組菌株的生長略為緩慢。畢赤酵母作為外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)有諸多的優(yōu)點(diǎn)，它屬于低等真核生物，兼具真核 生物和原核生物的特點(diǎn)。畢赤酵母是單細(xì)胞生物，遺傳背景的研究相對透徹，其生理生化特性已較為清楚，相對于植物或動物細(xì)胞來說，對于它的基因工程操作更加簡便和快捷，同 時(shí)，它作為真核生物又具備了原核生物所沒有的特性，如蛋白的翻譯后加工和修飾，包括二 硫鍵的形成、糖基化和脂?；?。對于有細(xì)胞毒性的外源重組蛋白，可以將它定位于畢赤酵 母的過氧化物酶體中，既可以保證宿主細(xì)胞不被毒性蛋白所傷害，又可以防止蛋白酶對外 源蛋白的降解。而對于胞外表達(dá)的蛋白來說，由于畢赤酵母本身的分泌蛋白很少，因此，利 于外源重組蛋白的分離和純化。畢赤酵母菌株及其代謝產(chǎn)物對于任何哺乳動物均沒有毒 性，而且它能夠進(jìn)行高密度發(fā)酵，培養(yǎng)成本低廉，操作簡單，極適合于工業(yè)化的大規(guī)模發(fā)酵 生產(chǎn)。多肽由于其分子量比較小，在酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)一般表達(dá)量非常低或根本就不 表達(dá)，為此，可采用融合蛋白的形式、增大分子量以防止其被酵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶所降解 (Faber K.N.，et al.，1996)，而且融合蛋白由于分子量增大也更加易于采用常規(guī)方法(如 SDS-PAGE等)對其表達(dá)量和純度進(jìn)行檢測。根據(jù)研究目的和方法的不同，蛋白融合的方式 也會有所不同。如在目的蛋白的N端或C端融合一段標(biāo)簽序列(如His-Tag、GST等)以 便于后續(xù)的外源蛋白純化操作、或在融合蛋白之間插入一蛋白酶切割序列，以便于下游體 外加工時(shí)目標(biāo)蛋白多肽的釋放。而在某些情況下，為了使融合后的兩個(gè)相同或不同的蛋白 仍能保持其各自的生物學(xué)活性，則需在它們之間插入一段連接序列，這段連接序列多為一 段短肽，它的設(shè)計(jì)對于保持融合蛋白的生物活性是十分重要的。連接序列需要保持一定的 柔性，使位于其兩端的蛋白可以靈活的運(yùn)動。其長度要根據(jù)具體的情況實(shí)驗(yàn)確定，若連接 序列過短，易造成空間位阻，影響其兩端蛋白正確三維結(jié)構(gòu)的形成；若過長，則可能由于蛋 白的相互作用從而影響其各自的活性和功能。目前已有許多成功采用連接序列重組表達(dá) 融合蛋白的報(bào)道，如凋亡抑制蛋白家族成員Survivin突變體與自殺基因胞嘧啶脫氨酶融 合蛋白在胃癌細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)，使用的連接序列是8個(gè)串聯(lián)起來的甘氨酸(Gly)(孫萍 胡等，2009)。貓來源的干擾素《3與胸腺肽al融合表達(dá)，其連接序列為(GGGGS)3序列 (許無恨等，2009)。黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶與葡萄糖淀粉酶融合，使用的連接序列為 (Gly-Ser) 5 (Ya-Feng Zhou, etal.，2001)，該序列也被用于連接大腸桿菌堿性磷酸酶和鏈霉 素識別肽(Wen-Hai Shao,et al.，2000)，經(jīng)SPDBV預(yù)測，該連接序列傾向于形成一個(gè)a-螺 旋結(jié)構(gòu)，Gly無側(cè)鏈，而絲氨酸(Ser)側(cè)鏈較小且只含有一個(gè)羥基，這樣使它既能夠減小空 間位阻，又具有一定的柔性，從而使融合蛋白保持了天然的生物活性。目前，還沒有關(guān)于對假黑盤菌素成熟多肽基因進(jìn)行優(yōu)化并人工合成假黑盤菌素成 熟多肽二聚體融合蛋白基因的報(bào)道，而且對于通過特定方式融合的假黑盤菌素成熟多肽二 聚體蛋白是否仍具有生物活性，以及將該融合蛋白基因?qū)氘叧嘟湍改芊襁M(jìn)行誘導(dǎo)性表達(dá) 和高密度發(fā)酵生產(chǎn)也未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明要解決的技術(shù)問題包括優(yōu)化假黑盤菌素成熟多肽基因、人工合成假黑盤菌 素成熟多肽二聚體融合蛋白基因、檢測以特定方式融合的假黑盤菌素成熟多肽二聚體蛋白 的生物活性，以及使假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白在畢赤酵母中獲得高效表達(dá)和高 密度發(fā)酵生產(chǎn)的方法。
(二)技術(shù)方案為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先公開一種假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋 白，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明還公開編碼所述假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的基因。優(yōu)選地，所 述基因的DNA序列如SEQ ID No. 3所示。進(jìn)一步地，本發(fā)明公開一種含有編碼假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的DNA 序列的表達(dá)載體，其包括酵母誘導(dǎo)型啟動子，位于啟動子下游的編碼a-因子分泌信號肽 的核苷酸序列以及所述編碼假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的基因，所述編碼假黑盤 菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的基因的5’端具有酵母Kex2基因表達(dá)產(chǎn)物切割識別序列 GAGAAAAGA。優(yōu)選地，所述酵母誘導(dǎo)型啟動子為酵母醇氧化酶啟動子；優(yōu)選地，所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為pPIC9K。本發(fā)明還公開一種基因工程菌，其為含有前述表達(dá)載體的宿主；優(yōu)選地，所述宿主 為畢赤酵母；更優(yōu)選地，所述宿主為畢赤酵母GS115。本發(fā)明還公開前述基因工程菌的培養(yǎng)和表達(dá)方法，該方法包括如下步驟1)菌體培養(yǎng)在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，接種前用氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為 5. 7 6. 0，然后在每升基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4. 37mL PTM1溶液；按體積比10%的比例接 入種子液，28 30°C、372 380轉(zhuǎn)/分通氣攪拌培養(yǎng)22 24小時(shí)；2)飼喂碳源通過蠕動泵向步驟1)得到的發(fā)酵液中流加含有12mL PTM1/L發(fā)酵 液的50%甘油，流加量為17 18mL/h/L發(fā)酵液，28 30°C通氣攪拌培養(yǎng)4 5小時(shí)，在培 養(yǎng)過程中加入氨水調(diào)節(jié)PH值為5. 7 6. 0，調(diào)整通氣量使溶氧量大于20% ；3)誘導(dǎo)表達(dá)向步驟2)得到的發(fā)酵液中流加含有12mL PTM1/L發(fā)酵液的甲醇，使 甲醇的濃度為0. 2 0. 3%，調(diào)整通氣量使溶氧量大于20%，28 30°C通氣攪拌培養(yǎng)120 144小時(shí)。其中，所述基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為10XBasal Salts+4%甘油；所述PTM1含有0. 6%硫 酸銅、0. 008%碘化鈉、0. 3%硫酸錳、0. 02%鉬酸鈉、0. 002%硼酸、0. 05%氯化鈷、2%氯化 鋅、6. 5%硫酸亞鐵、0. 025%生物素和0. 5%硫酸。本發(fā)明更進(jìn)一步公開前述基因工程菌分泌的重組蛋白的純化方法，其包括離心除 菌、過濾和分子篩柱層析的步驟。本發(fā)明還公開一種在重組畢赤酵母中表達(dá)假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白 的方法，該方法包括如下步驟利用前述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得的重組畢赤酵母經(jīng) 過發(fā)酵培養(yǎng)，分泌產(chǎn)生假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白。本發(fā)明另外公開假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白在制備殺滅病原性細(xì)菌和 耐藥性菌株的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)以誘導(dǎo)型方式表達(dá)和生產(chǎn)假黑盤菌素成熟多肽二 聚體重組融合蛋白，該重組融合蛋白具有與天然多肽相類似的生物活性，即能夠抑制或殺 滅多種革蘭氏陽性病原細(xì)菌，甚至對某些具有抗生素抗性的致病菌也能產(chǎn)生抑制作用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了將兩個(gè)假黑盤菌素成熟多肽基因串聯(lián)成 二聚體融合蛋白基因的方法，首先將一個(gè)編碼假黑盤菌素成熟多肽單體的基因按照畢赤酵母所偏愛的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，繼而在兩個(gè)編碼假黑盤菌素成熟多肽單體的核苷酸序列之間 插入一個(gè)能編碼6個(gè)甘氨酸(Gly)殘基的短核苷酸序列，由此形成一個(gè)新的融合蛋白基因。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用上述獲得的融合蛋白基因轉(zhuǎn)化酵母，隨著重組酵 母菌體的生長，假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因能夠得到高效表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將上述獲得的融合蛋白基因插入到一個(gè)誘導(dǎo)型酵母 表達(dá)質(zhì)粒載體上，在被整合到畢赤酵母基因組中后，對轉(zhuǎn)化后的酵母菌株進(jìn)行G418抗性篩 選和發(fā)酵液抑菌活性測定，得到的重組酵母工程菌株可以高效表達(dá)假黑盤菌素成熟多肽二 聚體融合蛋白并將其分泌到細(xì)胞外，利用發(fā)酵液上清進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，證明該重組融合蛋白 具有與天然多肽相類似的抑菌活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了有關(guān)重組畢赤酵母工程菌的最適的生長培養(yǎng)條 件和外源蛋白表達(dá)條件，如培養(yǎng)基的成分、接種量、PH值、溶氧量和培養(yǎng)時(shí)間等，由此使該重 組酵母工程菌的生長量和重組蛋白的分泌量都盡可能地達(dá)到最大化。通過離心除菌、中空 纖維過濾、分子篩等快速分離和純化步驟從發(fā)酵液中得到高純度的外源重組蛋白，以便為 這種重組酵母的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、低成本發(fā)酵和純化奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)以誘導(dǎo)型方式表達(dá)和生產(chǎn)假黑盤菌素成熟多肽二 聚體重組融合蛋白，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該重組融合蛋白具有抑菌和殺菌能力；或更 確切地說，本發(fā)明所指的重組假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白與源自絲狀真菌假黑盤 菌的天然蛋白或其他常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的該重組蛋白相類似，作為抑菌劑或殺菌劑可以廣 泛地應(yīng)用到醫(yī)療、食品、飼料和科研等領(lǐng)域。例如，在醫(yī)藥研究領(lǐng)域，本發(fā)明的重組假黑盤菌 素成熟多肽二聚體融合蛋白可以替代某些常用的抗生素，如青霉素或萬古霉素等，不僅可 以用于殺滅某些病原性細(xì)菌、甚至耐藥菌株，而且可以降低抗生素的使用量，減少耐藥性病 原菌的出現(xiàn)。本發(fā)明所指的重組假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白是在畢赤酵母中以誘導(dǎo) 型方式表達(dá)和生產(chǎn)的，首先是編碼假黑盤菌素成熟多肽單體的基因被按照畢赤酵母所偏愛 的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，然后采用人工合成的方法，兩個(gè)編碼假黑盤菌素成熟多肽的單體基因 被一個(gè)編碼6個(gè)Gly短肽的核苷酸序列再串聯(lián)起來，然后，該融合蛋白基因被插入到一個(gè) 帶有a-因子分泌信號肽編碼序列的酵母表達(dá)載體上。a-因子分泌信號肽的作用是操縱 所謂外源的重組假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白向畢赤酵母胞外的分泌。在該質(zhì)粒 載體上，還含有一個(gè)誘導(dǎo)型啟動子，該啟動子位于a-因子分泌信號肽與假黑盤菌素成熟 多肽二聚體融合蛋白基因的上游，它操縱二聚體融合蛋白基因在畢赤酵母細(xì)胞中的高效表 達(dá)。該質(zhì)粒表達(dá)載體經(jīng)線性化后，可通過電融合法或氯化鋰等方法被導(dǎo)入到畢赤酵母細(xì)胞 中，進(jìn)而通過同源重組穩(wěn)定整合到酵母染色體基因組上，此重組酵母在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，經(jīng) 甲醇誘導(dǎo)，可高效表達(dá)的假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白，并在a-因子分泌信號肽 的弓I導(dǎo)下得以分泌到胞外的培養(yǎng)基中。本發(fā)明所指的重組蛋白可以是假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的全部，然 而，在某些具體的實(shí)施方案中，所表達(dá)的外源基因也可能只是該二聚體融合蛋白基因的一 部分。有時(shí)，假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白可再與另外一個(gè)具有不同生物學(xué)功能的 蛋白基因以獨(dú)立或融合方式同時(shí)在一個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，目的是為了方便提純或提高其生 物活性。可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)進(jìn)行蛋白融合，例如通過蛋白翻譯后加工或共價(jià)結(jié)合的方式，或者通過DNA重組技術(shù)使基因在翻譯表達(dá)前相互拼接在一起。發(fā)酵產(chǎn)品中假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的純度直接關(guān)系到該重組蛋白 的應(yīng)用范圍及所生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品成本的高低，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了快速純化大量 的假黑盤菌素成熟多肽二聚體重組融合蛋白，可以先使用不同截流分子量的過濾裝置對酵 母發(fā)酵液上清液進(jìn)行預(yù)處理，然后再使用分子篩柱層析，在純化過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)，都可 使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，通過上述方法可獲得純度達(dá)到99 %的重組融合蛋白。本發(fā)明的方法中極為重要的環(huán)節(jié)是一些質(zhì)粒載體的構(gòu)建，它們在獲得本發(fā)明所指 的畢赤酵母細(xì)胞及其重組產(chǎn)物的加工應(yīng)用中起重要作用。用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的質(zhì)粒載體包 含由編碼假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因或其衍生物的DNA序列和操縱該基因 或其衍生物的DNA序列在所說的酵母細(xì)胞中表達(dá)的一個(gè)誘導(dǎo)型啟動子組成。在某些具體實(shí) 施方案中，質(zhì)粒載體還包括一個(gè)選擇性或標(biāo)記基因，主要用于重組畢赤酵母細(xì)胞的篩選和 檢測。在某些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動子是酵母醇氧化酶啟動子(A0X1)。正 如上面所述，按照某些具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的質(zhì)粒載體可用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母，它所編碼 的外源蛋白是假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白。本發(fā)明也提供了畢赤酵母細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化以及酵母重組子篩選的方法，它包括以下 步驟1)按照畢赤酵母所偏愛的密碼子，對假黑盤菌素成熟多肽基因進(jìn)行優(yōu)化；2)假黑盤 菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因的人工合成、其中涉及到將一段短核苷酸連接序列插入 在兩個(gè)成熟多肽單體核苷酸編碼序列的中間，由此使表達(dá)出的兩個(gè)多肽單體都能夠保持一 定的柔性和靈活性，并使它們都能夠保持正確的三維結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮其各自的生物活性；3) 構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體，其中含有編碼假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的基因或其衍 生物的基因(包括連接序列的改變或連接方式的改變等)；4)通過電融合法或其他方法，用 上述線性化后的質(zhì)粒表達(dá)載體DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母細(xì)胞涂布于RDB 固體平板選擇培養(yǎng)基上，能夠在此培養(yǎng)基上生長的酵母單菌落就是含有外源基因的酵母重 組子；5)挑選再生出的酵母細(xì)胞單菌落，逐一分別接種到含有不同濃度G418的YPD固體平 板培養(yǎng)基上(濃度依次為0. 5,1. 0,1. 5,2. Omg/mL)，那些能夠在高濃度G418平板上生長的 酵母單菌落具有較高的外源基因拷貝數(shù)，有可能具有較高的外源蛋白表達(dá)水平。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)過優(yōu)化的重組畢赤酵母培養(yǎng)生長條件 以及重組蛋白的快速純化方法，它包括以下四個(gè)階段1)菌體培養(yǎng)，以10%的接種量接種 酵母工程菌后，經(jīng)過22 24小時(shí)的培養(yǎng)，酵母菌體濕重將達(dá)到95 100g/L左右；2)飼喂 碳源，在培養(yǎng)4小時(shí)后，酵母菌體的濕重將達(dá)到190 200g/L左右；3)誘導(dǎo)表達(dá)，加入甲 醇，誘導(dǎo)酵母細(xì)胞高效表達(dá)假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白并將其分泌到培養(yǎng)基中； 4)目標(biāo)蛋白的純化，發(fā)酵液經(jīng)過離心和三次不同規(guī)格的濾膜過濾處理，再經(jīng)過一次分子篩 柱層析，重組假黑盤菌素成熟多肽二聚體的純度可達(dá)99%以上。本發(fā)明在詳細(xì)介紹酵母表達(dá)系統(tǒng)時(shí)僅提到了畢赤酵母，然而，正如本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員早已熟知的那樣，許多種酵母表達(dá)系統(tǒng)都可以利用本發(fā)明所提供的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn) 化、表達(dá)和生產(chǎn)。因此，所有這些酵母表達(dá)系統(tǒng)都應(yīng)包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。正如下面實(shí)施例中詳細(xì)描述的那樣，本發(fā)明描述的酵母轉(zhuǎn)化方法中所用的質(zhì)粒載 體是一個(gè)整合型的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所使用的質(zhì)粒表達(dá)載 體的出發(fā)載體是PPIC9K。
本發(fā)明包括以下幾個(gè)組成部分1)按照畢赤酵母所偏愛的密碼子，對編碼假黑盤 菌素成熟多肽的基因進(jìn)行優(yōu)化；2)假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因的人工合成， 其中包括將一段DNA連接序列的5'端與一個(gè)去掉了終止密碼子的假黑盤菌素成熟多肽基 因序列的3'端連接，而該段DNA連接序列的3'端同時(shí)再與另外一個(gè)假黑盤菌素成熟多肽 基因的5'端連接起來，由此串聯(lián)形成了一個(gè)新的融合蛋白基因，將該DNA編碼序列插入到 pEASY-Tl質(zhì)粒的T位點(diǎn)內(nèi)，用得到的中間質(zhì)粒載體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，使 中間載體得到復(fù)制，然后進(jìn)行DNA測序，分析所插入外源基因的正確性和完整性；3)通過常 規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，如內(nèi)切酶和連接酶處理，將該融合蛋白基因定向插入到PPIC9K質(zhì)粒 中的Xho I和Not I位點(diǎn)之間，從而構(gòu)成了一個(gè)誘導(dǎo)型酵母高效表達(dá)載體；4)高表達(dá)酵母 重組子的篩選，經(jīng)過電融合或其他轉(zhuǎn)化方法，將上述重組后并線性化的酵母表達(dá)載體導(dǎo)入 酵母受體細(xì)胞，在RDB固體平板選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待酵母單菌落出現(xiàn)后，再將其逐一轉(zhuǎn)接 到含不同濃度G418的YPD固體平板培養(yǎng)基上，能夠抵抗高濃度G418的酵母重組子由于具 有較高的外源基因基因拷貝數(shù)，因而有可能具有較高的外源蛋白表達(dá)水平，因此，挑選能夠 在最高濃度G418的YPD固體平板培養(yǎng)基上生長的酵母重組子進(jìn)行后續(xù)操作；5)提供重組 畢赤酵母最適生長培養(yǎng)和表達(dá)的條件。重組畢赤酵母的高密度發(fā)酵可分為菌體培養(yǎng)、飼喂 碳源和誘導(dǎo)表達(dá)三個(gè)階段，在每個(gè)階段均給予最適的培養(yǎng)時(shí)間和環(huán)境條件。發(fā)酵液分別經(jīng) 離心除菌、過濾和分子篩柱層析等步驟后，可得到純度達(dá)99%以上的重組假黑盤菌素成熟 多肽二聚體融合蛋白。(三)有益效果(1)本發(fā)明首次利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功地以誘導(dǎo)型方式表達(dá)和生產(chǎn)假黑盤菌 素成熟多肽二聚體融合蛋白；(2)本發(fā)明采用密碼子優(yōu)化后的假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因，以提 高其在畢赤酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)效率；(3)本發(fā)明采用酵母醇氧化酶啟動子調(diào)控假黑盤菌成熟多肽二聚體融合蛋白基 因，在畢赤酵母中以誘導(dǎo)型方式高效和穩(wěn)定地表達(dá)；(4)選擇假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白在畢赤酵母中以誘導(dǎo)型方式表達(dá)和 生產(chǎn)是因?yàn)樵撊诤系鞍妆葐误w更加穩(wěn)定、能更加高效地在酵母細(xì)胞中表達(dá)、生物產(chǎn)量高且 仍具有廣譜和高效的殺菌活性；(5)本發(fā)明特別優(yōu)化了畢赤酵母工程菌發(fā)酵生長條件以提高假黑盤菌成熟多肽二 聚體融合蛋白的生物產(chǎn)量，以及從發(fā)酵上清液中快速提純該重組蛋白的方法，純化工藝簡 單易行，適用于工業(yè)上規(guī)?；a(chǎn)假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白，最終制備的假黑 盤菌成熟多肽二聚體融合蛋白具生物活性，該重組融合蛋白可作為抑菌劑或殺菌劑廣泛應(yīng) 用于醫(yī)療、食品、飼料以及科研等領(lǐng)域。


圖1假黑盤菌素成熟多肽基因密碼子優(yōu)化前后對比，N代表密碼子優(yōu)化前的基因 序列；M代表密碼子優(yōu)化后的基因序列；圖2假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因的克隆及其誘導(dǎo)型酵母表達(dá)載體 plp-9k的構(gòu)建過程；
圖3利用抑菌圈法，檢測重組假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白對溶壁微球菌 的抑菌效果A、B、C、D和E分別為加入重組假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的樣品孔， 濃度依次為 200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、25ug/mL 和 12. 5ug/mL ；CK-為陰性對照，添加蒸 餾水；圖4利用抑菌圈法，檢測重組假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白對肺炎鏈球菌 的抑菌效果1、2和3為加入雞溶菌酶，濃度分別為4mg/mL、2mg/mL和lmg/mL ；4、5和6為 加入重組假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白，濃度分別為50Ug/mL、100Ug/mL和200ug/ mL ；CK-為陰性對照，添加蒸餾水；圖5利用抑菌圈法，檢測畢赤酵母菌株plp-p不同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間后的上清液抑 菌圈形成情況CK-為陰性對照，添加不含外源基因的酵母培養(yǎng)144小時(shí)后的發(fā)酵上清液； 24h 144h分別為添加含有假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因重組菌株plp-p不同 培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵上清液；圖6SDS_PAGE(16%分離膠濃度)電泳檢測純化后的重組假黑盤菌素成熟多肽二 聚體融合蛋白1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量10 160KDa(美國MBI Fermentas產(chǎn)品)；2為純化后 重組假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因的人工合成根據(jù)已知的假黑盤菌素全基因序列(GenBank:AJ964941)，按照畢赤酵母所偏愛 的密碼子，在不改變其氨基酸序列的前提下，對編碼假黑盤菌素成熟多肽的基因進(jìn)行密碼 子優(yōu)化。優(yōu)化后的假黑盤菌素成熟多肽基因與優(yōu)化前相比，改變了其中的19個(gè)核苷酸堿 基，總共涉及到19個(gè)密碼子，G+C含量由原來的45%變?yōu)?6%，假黑盤菌素成熟多肽基因 密碼子優(yōu)化前后對比見圖1，經(jīng)過優(yōu)化的假黑盤菌素成熟多肽基因仍編碼相同的40個(gè)氨基 酸殘基(見SEQ ID NO :1)，分子量約為4. 4KDa。在人工合成假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因時(shí)，首先去掉了第一個(gè)假黑 盤菌素成熟多肽單體核苷酸編碼序列3'端的終止密碼子TAA，然后與連接序列(編碼6個(gè) 甘氨酸短肽)的核苷酸編碼序列的5'端連接，最后將該短肽(連接序列)核苷酸編碼序 列的3'端再與第二個(gè)假黑盤菌素成熟多肽單體核苷酸編碼序列的5'端連接，由此串聯(lián) 形成一個(gè)全新的假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因。新合成的融合蛋白基因全長 為261bp (包括終止密碼子)，共編碼86個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列見SEQ ID N0:2，分 子量約為9. 14KDa。此外，在人工合成該融合蛋白基因過程中，在其5’端第一個(gè)密碼子GGT 前添加了限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)Xho I (CTCGAG)及酵母Kex2基因表達(dá)產(chǎn)物切割識別序列 GAGAAAAGA (其作用是在融合蛋白分泌到酵母細(xì)胞外的過稈中，可將a _因子分泌信號肽切 割掉)，在其3'端終止密碼子TAA后添加了限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)Not I (GCGGCCGC)(基 因人工合成工作由上海捷瑞生物工程有限公司完成)。人工合成的假黑盤菌素成熟多肽二 聚體融合蛋白基因及其兩端的附屬序列見SEQ IDN0 :3。實(shí)施例2 假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因的克隆將上述人工合成的假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因plpDNA片段直接插入到pEASY-Tl (購自北京TransGenic公司)質(zhì)粒中的T位點(diǎn)內(nèi)，按照該公司所提供的方法， 得到含有質(zhì)粒載體plp-T的細(xì)菌克隆。通過DNA測序分析，確定其所含的假黑盤菌素成熟 多肽二聚體融合蛋白基因pip是正確和完整的(DNA測序由北京標(biāo)凱科技有限公司完成)。實(shí)施例3 酵母表達(dá)載體plp_9k的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Xho I和Not I進(jìn)行雙酶切，將連接在中間質(zhì)粒載體plp-T中的 假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白基因pip切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收該 二聚體融合蛋白基因片段。用同樣的限制性內(nèi)切酶處理質(zhì)粒PPIC9K，通過瓊脂糖凝膠電泳 分離和回收線性化后的PPIC9K質(zhì)粒DNA。將上述兩個(gè)DNA片段混合后用連接酶連接在一 起，得到畢赤酵母高效表達(dá)載體plp_9k(見圖2)。然后用該質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì) 胞DH5 a (購自美國GIBC0公司)以便進(jìn)行質(zhì)粒的復(fù)制和保存。質(zhì)粒載體pPIC9K購自美國Invitrogen公司，它是一個(gè)酵母誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒載體， 它含有一個(gè)高效的誘導(dǎo)型啟動子-醇氧化酶啟動子(A0X1)，在甲醇的誘導(dǎo)下，可調(diào)控下游 插入外源基因的高效表達(dá)。在該表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)前含有編碼a-因子分泌信號肽的核 苷酸序列，在與外源基因融合表達(dá)后，可引導(dǎo)外源重組蛋白向酵母細(xì)胞外分泌。在分泌到胞 外的過程中，該信號肽序列可以被酵母自身的Kex2或Stel3基因表達(dá)產(chǎn)物切割下來，而不 會改變重組外源蛋白的N端序列。實(shí)施例4 :plp-9k質(zhì)粒DNA的制備采用堿裂解法(參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版)從上述大腸桿菌細(xì)胞DH5 a中 制備提取plp_9k質(zhì)粒DNA，然后用1 2倍過量的限制性內(nèi)切酶Sal I酶切，使之完全線性 化，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全。用苯酚和氯仿分別抽提上述酶切產(chǎn)物，乙醇沉 淀，棄上清，收集沉淀，經(jīng)冷凍干燥后，將沉淀重新溶解在無菌的去離子水中，-20°C保存?zhèn)?用。實(shí)施例5 酵母細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化將_72°C保存的畢赤酵母菌株GS115(購自美國Invitrogen公司)接種到5mL YPD液體培養(yǎng)基中(1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)，28°C震蕩培養(yǎng)1天后進(jìn)行 活化。將培養(yǎng)好的菌液以接種量重新接種于100mL YPD液體培養(yǎng)基中，28°C震蕩過夜 培養(yǎng)(8h)至0D6(1(lmi = 1. 3 1. 5,4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，倒掉上清；將沉淀的酵母細(xì)胞 重新懸浮在200mL冰預(yù)冷的滅菌去離子水中，緩慢重懸菌體，4°C 4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘， 倒掉上清；將沉淀的酵母細(xì)胞重新懸浮在200mL冰預(yù)冷的1M山梨醇中溶液中，4°C 4000 轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，倒掉上清；將沉淀的酵母細(xì)胞重新懸浮在40mL冰預(yù)冷的1M山梨醇中 溶液中，4°C 4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，倒掉上清；將沉淀的酵母細(xì)胞重新懸浮在lmL冰預(yù) 冷的1M山梨醇中溶液中，吸取80uL于1. 5mL離心管中，與上述線性化表達(dá)載體plp_9k質(zhì) 粒DNA(4 5ug)進(jìn)行充分混勻，然后轉(zhuǎn)移到冰浴后的0. 2cm無菌電擊杯中，利用電擊儀 PrecisionPulse (美國BTX公司產(chǎn)品)將線性化的表達(dá)載體plp_9k質(zhì)粒DNA導(dǎo)入酵母感 受態(tài)細(xì)胞中，所使用的電擊參數(shù)為電壓1. 5kV，電容50uF，電阻200 Q。電擊完成后，立即向 電擊杯中加入lmL室溫的YPD培養(yǎng)基，充分混勻后，28°C靜置1小時(shí)，然后均勻涂布于RDB 選擇培養(yǎng)基平板上(1. 34% YNB, 1M山梨醇，葡萄糖，0. 00004% Biotin，0. 005%谷氨酸， 0. 005%甲硫氨酸，0. 005%賴氨酸，0. %亮氨酸，0. 005%異亮氨酸，2%瓊脂粉)，倒置于 28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 3天，至出現(xiàn)酵母轉(zhuǎn)化子單菌落。
實(shí)施例6 高表達(dá)重組酵母菌株的篩選將在RDB培養(yǎng)基上生長的酵母單菌落(轉(zhuǎn)化子)用無菌牙簽逐一挑取到含有梯度 G418 的 YPD 培養(yǎng)基(濃度分別為 0. 5mg/mL、lmg/mL、l. 5mg/mL、2mg/mL G418)固體平板上， 將平板倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中放置1 2天。隨著攜帶有G418抗性基因的外源質(zhì)粒整 合到酵母基因組中拷貝數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化子對G418的抗性也不斷增強(qiáng)。挑取能夠在含有2mg/ mL G418的YPD平板上生長的轉(zhuǎn)化子，重新接種于lOOmLBMGY培養(yǎng)基[1%酵母提取物，2%酪 蛋白胨，lOOmM 磷酸鉀緩沖液(pH7. 0)，1. 34% YNB，0. 00004% Biotin，甘油(v/v)]中， 28°C震蕩培養(yǎng)4天，發(fā)酵液10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集含有重組假黑盤菌素成熟多肽二 聚體融合蛋白的上清液，該上清液可直接用于抑菌活性的測定。采用抑菌圈法測定重組蛋白的抑菌活性，所用的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodeikticus)和肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)均購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏 中心,菌種編號分別為CGMCC1. 0634和CGMCC 1. 1692。將溶壁微球菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中(每升培養(yǎng)基中含有蛋白胨10g，酵母 提取物5g, NaCl 10g，pH7. 0)，37°C震蕩培養(yǎng)至0D_nm約為1. 0，吸取luL培養(yǎng)物于45°C的 尚未凝固的固體LB培養(yǎng)基中，迅速混勻，倒置固體平板。待平板凝固后，用打孔器在其上打 出直徑約5mm的圓孔，將20uL不同濃度的重組假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白樣品加 入到孔中，37°C靜置過夜。抑菌圈如圖3所示。將肺炎鏈球菌接種于5mL血瓊脂培養(yǎng)基中(每升培養(yǎng)基中含牛肉浸膏10g，NaCl 5g，蛋白胨10g，脫纖維羊血50mL，pH7. 2 7. 4，固體中加入20g瓊脂)，37°C震蕩培養(yǎng)至 OD600nm約為1. 0，吸取luL培養(yǎng)物于45°C的尚未凝固的血瓊脂培養(yǎng)基中，迅速混勻，倒置固 體平板。待平板凝固后，用打孔器在其上打出直徑約5mm的圓孔，將20uL不同濃度的重組 假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白樣品和不同濃度的雞溶菌酶分別加入到孔中，37°C靜 置過夜。抑菌圈如圖4所示。具有抑菌活性的發(fā)酵液將會使圓孔周圍出現(xiàn)透明圈，根據(jù)抑菌圈半徑的大小可以 判斷發(fā)酵液抑菌活性的強(qiáng)弱。隨機(jī)挑取10株能夠在2mg/mL G418的YPD平板上生長的轉(zhuǎn)化子，發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā) 酵液上清進(jìn)行抑菌活性測定。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有能夠在2mg/mL G418的YPD平板上生長的 轉(zhuǎn)化子都具有抑菌活性，并且抑菌活性強(qiáng)弱差別不明顯。挑選出一株能夠在溶壁微球菌和肺炎鏈球菌平板上都能產(chǎn)生抑菌圈的重組子，作 為基因工程菌加以保存，并將其命名為plp-p。實(shí)施例7 重組酵母菌的高密度發(fā)酵1.種子液的制備將重組酵母菌株plp-p接種于10mL BMGY培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)過夜，以10% 的接種量轉(zhuǎn)接于100mL BMGY培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)過夜，再以10%的接種量轉(zhuǎn)接于1L BMGY培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)過夜，將其接種到4L BMGY培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)2天，作為 高密度發(fā)酵的種子液。2.重組酵母在50L發(fā)酵罐中的高密度發(fā)酵1)菌體培養(yǎng)在50L發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司)中盛 放30L基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[lOXBasal Salts (2. 67%磷酸、0. 093%硫酸鈣、1. 82%硫酸鉀、1. 49%硫酸鎂、0. 413%氫氧化鉀)+4%甘油]，在接種前先加入氨水使該培養(yǎng)基的pH值維 持在6. 0左右(氨水同時(shí)也可作為酵母菌體生長的氮源)，然后按下述比例，在每升基礎(chǔ) 發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4. 37mL微量鹽溶液PTM1(0. 6%硫酸銅，0. 008%碘化鈉，0. 3 %硫酸錳， 0. 02 %鉬酸鈉，0. 002 %硼酸，0. 05 %氯化鈷，2 %氯化鋅，6. 5 %硫酸亞鐵，0. 025 %生物素， 0. 5 %硫酸)。按體積比10 %的比例接種此前制備好的種子液，28°C通氣攪拌培養(yǎng)24小時(shí)左 右(轉(zhuǎn)速自始至終維持在372轉(zhuǎn)/分)。在培養(yǎng)過程中，隨著酵母菌體的生長，培養(yǎng)基中的 溶氧量將由100%逐漸降低，當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源消耗完后，溶氧量將再度升高至80%以上， 此時(shí)菌體的濕重將達(dá)90 95g/L ；2)飼喂碳源通過蠕動泵向步驟1)得到的發(fā)酵液中流加補(bǔ)料液，補(bǔ)料液為50%甘 油(其中含有12mL PTM1/L發(fā)酵液)，流加量為18mL/h/L。28°C通氣攪拌培養(yǎng)4小時(shí)，隨著 菌體的生長，PH值逐漸降低，用氨水維持pH值在6. 0左右。同時(shí)調(diào)整通氣量使此階段的溶 氧量始終維持在20%以上。此時(shí)菌體濕重將達(dá)到190 200g/L左右；3)誘導(dǎo)表達(dá)向步驟2)得到的發(fā)酵液中流加甲醇(其中含有12mLPTMl/L發(fā)酵 液)，使甲醇濃度始終維持在0. 3%左右，溶氧量始終大于20%，28°C通氣攪拌培養(yǎng)144小 時(shí)，每隔24小時(shí)取數(shù)毫升發(fā)酵液經(jīng)5000rpm 4°C下離心10分鐘，取30uL發(fā)酵液上清液進(jìn) 行SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)有肉眼可觀察到的一條蛋白帶，分子量約為9KDa，與推測中的假黑 盤菌素成熟多肽二聚體重組融合蛋白的分子量相吻合。此外，從抑菌圈活性檢測中發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)120小時(shí)后，重組蛋白的表達(dá)量達(dá)到 最高峰(見圖5)。實(shí)施例8 重組蛋白的純化待一個(gè)發(fā)酵周期全部結(jié)束之后，留取500mL發(fā)酵液作為種子液(接種量為5% ) 直接進(jìn)行下一輪的發(fā)酵過程。類似的操作累計(jì)進(jìn)行3輪，在每輪發(fā)酵過程中，均對菌體的生 長量和重組蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了測定。另外，在每輪發(fā)酵過程完全結(jié)束后，還取少許菌液涂 布于YPD固體平板上，并從中任意挑取10個(gè)酵母單菌落，快速提取其基因組(蔡傳奇等， 2001)DNA，進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌體的生物量、生長速度以及重組蛋白的表達(dá)量在各 輪發(fā)酵過程中基本保持穩(wěn)定；另外，PCR的檢測結(jié)果也證實(shí)重組畢赤酵母菌株具有很好的 遺傳穩(wěn)定性(見表2)。表2. plp-p菌株的遺傳穩(wěn)定性和外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定性的測定 在一個(gè)發(fā)酵周期結(jié)束之后，除留下500mL發(fā)酵液作為種子液外，其余的發(fā)酵液用用方法見該公司說明)過濾，收集透過液，澄清的透過液再用截流分子量為lOKDa的納濾 膜(上海朗極化工科技有限公司，產(chǎn)品編號2426538，使用方法見該公司說明)處理，保留 分子量小于lOKDa的透過液，將透過液再用截流分子量為2. 5KDa的納濾膜(上海朗極化 工科技有限公司，產(chǎn)品編號2405515)處理，保留分子量大于2. 5KDa的回流液，回流液終體 積約為700mL。將此回流液進(jìn)行脫鹽處理，向700mL回流液中加入6. 3L蒸餾水，即將回流 液稀釋10倍，然后將稀釋液再次通過上述2. 5KDa的納濾膜處理，此時(shí)得到的回流液中鹽離 子濃度也相應(yīng)稀釋10倍，如此重復(fù)操作5次，即回流液中鹽離子濃度稀釋105倍，最終得到 700mL回流液，將此回流液冷凍干燥后，可得到初步提純的重組蛋白凍干粉。該樣品經(jīng)分子 篩柱層析進(jìn)一步分離提純，分子篩柱層析條件為柱填充料為S印hadex G75(美國GE公司 產(chǎn)品)，柱高35cm，直徑16mm，流速lmL/min，洗脫緩沖液為20mM磷酸鉀緩沖液pH6. 2，樣品 上樣量為500uL (含凍干粉50mg)，每lmL流出液收集一管，將收集液取少量進(jìn)行抑菌圈實(shí) 驗(yàn)和SDS-PAGE電泳，收集抑菌圈較大且在聚丙烯酰胺凝膠上顯示單一條帶的收集液作為 最終制得的重組蛋白純品。上述純化流程中每個(gè)操作步驟之后都留取少量樣品進(jìn)行總蛋白 量、純度和回收率的測定(見表3)。最終制得的重組蛋白純品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和脫色后，電泳 圖經(jīng)LabWork軟件(美國UVP公司產(chǎn)品)分析，結(jié)果顯示重組蛋白濃度達(dá)到99%以上(見 圖6)，重組蛋白的表達(dá)量約為0. 15g/L。表3.假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的純化 顯然，通過本發(fā)明的方法，假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白能夠在畢赤酵母 中獲得高效表達(dá)。
權(quán)利要求
一種假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的DNA序列如SEQID No. 3所示
4.一種含有編碼假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的DNA序列的表達(dá)載體，其包括 酵母誘導(dǎo)型啟動子，位于啟動子下游的編碼α “因子分泌信號肽的核苷酸序列以及權(quán)利要 求2或3所述編碼假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的基因，所述編碼假黑盤菌素成熟 多肽二聚體融合蛋白的基因的5’端具有酵母Kex2基因表達(dá)產(chǎn)物切割識別序列GAGAAAAGA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述酵母誘導(dǎo)型啟動子為酵母醇氧 化酶啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為 PPIC9K。
7.一種基因工程菌，其為含有權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述表達(dá)載體的宿主；優(yōu)選地，所述 宿主為畢赤酵母；更優(yōu)選地，所述宿主為畢赤酵母GS115。
8.權(quán)利要求7所述基因工程菌的培養(yǎng)和表達(dá)方法，該方法包括如下步驟1)菌體培養(yǎng)在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，接種前用氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值為5.7 6. 0，然后在每升基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4. 37mL PTMl溶液；按體積比10%的比例接 入種子液，28 30°C、372 380轉(zhuǎn)/分通氣攪拌培養(yǎng)22 24小時(shí)；2)飼喂碳源通過蠕動泵向步驟1)得到的發(fā)酵液中流加含有12mLPTM1/L發(fā)酵液的 50%甘油，流加量為17 18mL/h/L發(fā)酵液，28 30°C通氣攪拌培養(yǎng)4 5小時(shí)，在培養(yǎng)過 程中加入氨水調(diào)節(jié)PH值為5. 7 6. 0，調(diào)整通氣量使溶氧量大于20% ；3)誘導(dǎo)表達(dá)向步驟2)得到的發(fā)酵液中流加含有12mLPTM1/L發(fā)酵液的甲醇，使甲醇 的濃度為0. 2 0. 3%，調(diào)整通氣量使溶氧量大于20%，28 30°C通氣攪拌培養(yǎng)120 144 小時(shí)；其中，所述基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為IOXBasal Salts+4%甘油；所述PTMl含有0. 6%硫酸 銅、0. 008%碘化鈉、0. 3%硫酸錳、0. 02%鉬酸鈉、0. 002%硼酸、0. 05%氯化鈷、2%氯化鋅、6.5%硫酸亞鐵、0. 025%生物素和0. 5%硫酸。
9.一種在重組畢赤酵母中表達(dá)假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的方法，該方法包 括如下步驟利用權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得的重組畢赤酵 母經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，分泌產(chǎn)生假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白。
10.假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白在制備殺滅病原性細(xì)菌和耐藥性菌株的藥物 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白、編碼該蛋白的基因以及含有編碼該蛋白的DNA序列的表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及一種在重組畢赤酵母中表達(dá)假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的方法，該方法包括如下步驟利用含有編碼假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得的重組畢赤酵母經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，分泌產(chǎn)生假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白。得到的假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白具有生物活性，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、飼料以及科研等領(lǐng)域。
文檔編號C12N15/31GK101851280SQ20101014990
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者劉德虎, 李剛強(qiáng), 潘春剛, 王楠 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所;中牧實(shí)業(yè)股份有限公司