專利名稱：一種檢測基因融合的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測領(lǐng)域，更具體地涉及一種檢測基因融合的方法、試劑以及試劑盒。
背景技術(shù)：
研究表明，在哺乳動物(如人)中，基因融合是導(dǎo)致某些疾病(如癌癥)的原因之一。以間變性淋巴瘤激酶基因(Anaplastic lymphoma kinase，簡稱為“ALK”)為例， 該基因編碼一蛋白激酶受體[1]?；罨腁LK基因通過PIK3CA/AKT以及MAI3K通路對細(xì)胞的抗凋亡和增殖發(fā)揮作用氣ALK基因的異位多發(fā)在間變性淋巴瘤，神經(jīng)性母細(xì)胞瘤以及肌纖維瘤中[3]。ALK異位產(chǎn)生的融合蛋白發(fā)揮著致癌基因的作用，這種融合蛋白保留了 ALK的胞內(nèi)激酶部分并融合了與其融合的蛋白的N端部分。目前已報(bào)道的與ALK發(fā)生融合的基因有 11 種之多，如 NPM[4]，EML4[1]，MSN[5]，TPM3[6'7], ATIC, TFG, CARS,以及 CLTC[8'9ao]等。在諸多的ALK融合基因中，對于非小細(xì)胞肺癌，一種棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣 4(EML4)/間變淋巴瘤激酶(ALK)的融合基因(EML4-ALK)于2007年開始見諸于NSCLC相關(guān)研究當(dāng)中[1'"'12]。間變淋巴瘤激酶(ALK)/棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4(EML4)融合基因(EML4-ALK) 在非小細(xì)胞肺癌中占有一定的比例，且研究表明其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。 EML4-ALK融合由第二號染色體短臂異位引起，目前已發(fā)現(xiàn)有6種不同的融合類型。對這些融合基因的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，其ALK部分均包括開始于第20外顯子的編碼細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的基因片段，而EML4部分則包括長短不一的編碼蛋白N端部分的基因片段。將ALK融合基因轉(zhuǎn)入3T3細(xì)胞以及Ba/F3動物模型的研究表明，所有這些融合基因均能二聚化并組成型活化。ALK融合基因的表達(dá)產(chǎn)物作為一種嵌合酪氨酸激酶，對肺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[13’14]。因此，對ALK融合基因的檢測具有重要意義。目前，對ALK融合基因的研究大部分的采用RT-PCR的方法，小部分研究采用免疫組化、FISH的方法進(jìn)行檢測。RT-PCR的方法是針對已知的ALK融合基因的類型以及融合方式來設(shè)計(jì)引物，將 RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA之后，通過PCR擴(kuò)增目的片斷的方式來進(jìn)行檢測。該方法的局限性1) 必須知曉與ALK基因發(fā)生融合的基因；2)必須知曉兩基因發(fā)生融合的方式；3)不能或難以同時(shí)檢測不同基因與ALK發(fā)生的融合。因此利用該方法須針對與ALK發(fā)生融合的不同基因， 必須根據(jù)不同融合方式設(shè)計(jì)不同的引物來進(jìn)行檢測，且不能檢測出未知的ALK融合基因以及未知的融合方式，這將直接導(dǎo)致ALK融合基因檢測困難及檢出率的降低。例如，目前已報(bào)道的EML4-ALK的基因融合在肺癌中的檢出頻率在0. 5% -7. 5%之間[15]非放射性原位雜交技術(shù)FISH法的原理是設(shè)計(jì)與被檢測的EML4-ALK同源互補(bǔ)的核酸探針，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形EML4-ALK融合基因的DNA與核酸探針的雜交體。 用報(bào)告分子(如生物素、地高辛)標(biāo)記核酸探針的某一種核苷酸，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異性配基(如特異性與生物素結(jié)合的親和素)之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性以及相對定位分析。然而，該方法局限性1)必須知曉與ALK基因發(fā)生融合的基因；2)與ALK發(fā)生融合的基因所在染色體的位置必須與ALK相距較近的距離；3)不能同時(shí)檢測不同基因與ALK發(fā)生的融合。因此該方法須針對與ALK基因發(fā)生融合的不同基因設(shè)計(jì)不同的探針，且不能檢測出未知的ALK融合基因，這將影響到ALK 基因的檢測率。鑒于各種融合基因(如ALK融合基因)的表達(dá)產(chǎn)物對癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)更為通用的融合基因檢測方法。此外，本發(fā)明還迫切需要開發(fā)，在部分知曉或未知曉融合基因結(jié)構(gòu)的情況下，能夠準(zhǔn)確靈敏地檢測方法來檢測融合基因(如ALK融合基因)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種通用性更高的檢測融合基因的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種能夠在僅部分知曉或未知曉融合基因結(jié)構(gòu)的情況下，準(zhǔn)確靈敏地檢測方法來檢測融合基因(如ALK融合基因)的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種非診斷性的、體外檢測樣本中的多核苷酸是否存在基因融合的方法，其中所述的融合基因是第一基因與第二基因融合形成的，其中，包括步驟1)以檢測樣本的mRNA為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，利用基因特異性引物1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而擴(kuò)增得到cDNA鏈，其中所述的擴(kuò)增的cDNA鏈的序列跨越了第一基因以及與其發(fā)生融合的第二基因的融合區(qū)；其中，所述的基因特異性引物1位于第一基因以及與其發(fā)生融合的第二基因的遠(yuǎn)端，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、第一基因(或其部分) 以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；2)在cDNA的3，端添加多聚C(polyC)的尾巴；3)以添加了 polyC尾的cDNA鏈為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，用與多聚C錨定引物與基因特異性引物2進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，從而獲得第一 PCR產(chǎn)物；其中所述的多聚C錨定引物包括(a)位于引物3’端的、與多聚C尾互補(bǔ)的polyG 結(jié)合區(qū)，以及(b)位于引物5’端的錨定區(qū)，其中所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與 PolyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；所述的基因特異性引物2位于第一基因以及與其發(fā)生融合的基因的遠(yuǎn)端，且不超過基因特異性引物1，從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；4)以第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，用錨定引物與基因特異性引物3進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，從而獲得第二 PCR產(chǎn)物；其中所述的錨定引物包括位于引物3’端的、與多聚C錨定引物的錨定區(qū)相同或互補(bǔ)的錨定區(qū)，所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與polyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；其中，所述的錨定區(qū)不與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3相同或互補(bǔ)， 即不會與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3發(fā)生特異性結(jié)合；
所述的基因特異性引物3位于基因特異性引物2和基因特異性引物1的內(nèi)側(cè)，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、基因特異性引物3、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；5)對得到的長度大于陰性對照的第二 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以得到與第一基因發(fā)生融合的基因序列，從而確定所述的多核苷酸是否存在基因融合。在另一優(yōu)選例中，在步驟1)和2)之間，還包括步驟步驟1)獲得的cDNA鏈為模板，用內(nèi)部質(zhì)控引物對進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。在另一優(yōu)選例中，所述的內(nèi)部質(zhì)控引物是特異性擴(kuò)增出第一基因(或其部分片段)的引物對。在另一優(yōu)選例中，所述的第一基因選自下組ALK基因。在另一優(yōu)選例中，所述的第二基因是選自下組的一種或多種基因NPM，EML4，MSN， TPM3, ATIC, TFG, CARS,以及 CLTC。在另一優(yōu)選例中，所述的polyC尾的長度為8_20bp ；和/或所述的polyG結(jié)合區(qū)的長度為8_20bp ；和/或所述的多聚C錨定引物的錨定區(qū)的長度為15_30bp ；和/或所述的錨定引物的錨定區(qū)的長度為15_30bp。在另一優(yōu)選例中，所述的錨定引物是序列完全與多聚C錨定引物的錨定區(qū)完全相同(或完全互補(bǔ))的多聚核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物1和/或基因特異性引物2和基因特異性引物3特異性結(jié)合于第一基因的外側(cè)、結(jié)合于第一基因的外側(cè)和第一基因本身、或者僅結(jié)合于第一基因本身。在另一優(yōu)選例中，所述的方法使用選自下組的一種或多種引物序列如SEQ ID NO 1所示的基因特異性引物1 ；序列如SEQ ID NO 2所示的多聚C錨定引物；序列如SEQ ID NO 3所示的基因特異性引物2 ；序列如SEQ ID NO 4所示的錨定引物；序列如SEQ ID NO 5所示的基因特異性引物3。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還使用序列如SEQ ID NO 6和7所示的內(nèi)部質(zhì)控引物對。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測基因融合的試劑盒，其中所述的融合基因是第一基因與第二基因融合形成的，所述的試劑盒包括以下組件1)位于容器a中基因特異性引物1，其中，所述的基因特異性引物1位于第一基因以及與其發(fā)生融合的第二基因的遠(yuǎn)端，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；2)位于容器b中的多聚C錨定引物；其中所述的多聚C錨定引物包括(a)位于引物3’端的、與polyC互補(bǔ)的polyG結(jié)合區(qū)，以及(b)位于引物5’端的錨定區(qū)，其中所述的錨定區(qū)既不與PolyC互補(bǔ)，也不與polyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；3)位于容器c中的基因特異性引物2，所述的基因特異性引物2對應(yīng)于第一基因以及與其發(fā)生融合的基因的遠(yuǎn)端，且不超過基因特異性引物1，從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；4)位于容器d的錨定引物，其中所述的錨定引物包括位于引物3’端的、與多聚C 錨定引物的錨定區(qū)相同或互補(bǔ)的錨定區(qū)，所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與polyG 結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；5)位于容器e中的基因特異性引物3，其中，所述的基因特異性引物3位于基因特異性引物2和基因特異性引物1的內(nèi)側(cè)，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、基因特異性引物3、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；并且，所述的多聚C錨定引物的錨定區(qū)和錨定引物錨定區(qū)都不與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3相同或互補(bǔ)，即不會與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3發(fā)生特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒包括選自下組的一種或多種引物序列如SEQ ID NO 1所示的基因特異性引物1 ；序列如SEQ ID NO 2所示的多聚C錨定引物；序列如SEQ ID NO 3所示的基因特異性引物2 ；序列如SEQ ID NO 4所示的錨定引物；序列如SEQ ID NO 5所示的基因特異性引物3。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有內(nèi)部質(zhì)控引物對。更佳地，所述試劑盒含有序列如SEQ ID NO 6和7所示的內(nèi)部質(zhì)控引物對。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有以下一種或多種任選組分(a)裝于一容器中的反轉(zhuǎn)錄酶；(b)裝于一容器中的PCR聚合酶；(c)裝于一容器中的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶。應(yīng)理解，上述的以及本文下文中所詳述的任二個(gè)或多個(gè)技術(shù)特征都可相互組合， 以構(gòu)成新的技術(shù)方案。在此申請中，為了節(jié)省篇幅，不再一一列出。


圖1顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的檢測結(jié)果。圖中，M表示200bp的分子量標(biāo)準(zhǔn)物； P表示陽性標(biāo)準(zhǔn)品。NTC表示陰性標(biāo)準(zhǔn)品。其他表示編號為1至45的檢測樣本。圖Ia是第一輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中，ALK E20表示ALK基因的外顯子20。圖Ib表示第二輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；其中，ALK E19+EML4 E6表示ALK基因的外顯子19與EML4的外顯子6形成的融合基因。圖Ic顯示了一種EML4-ALK融合產(chǎn)物的測序圖。圖2顯示了本發(fā)明“RCAE樣PCR聯(lián)合測序法”的示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，首次開發(fā)了一種新的檢測方法RACE-like PCR 聯(lián)合測序的檢測方法(簡稱為“RCAE樣PCR聯(lián)合測序法”)，對ALK融合基因之類的融合基因進(jìn)行檢測。以ALK融合基因?yàn)槔?，該方法不僅可同時(shí)檢測多種不同的ALK融合基因，而且在不必事先知道與ALK發(fā)生融合的基因以及ALK融合基因的融合方式的情況下，檢測出未知的ALK融合基因。這不僅提高了檢測方法的通用性，而且大大提高ALK融合基因的檢出率。用本發(fā)明方法獲得的ALK融合基因的發(fā)生頻率，可用于輔助判斷ALK融合基因在肺癌中所起的作用。這種方法在靈敏性、實(shí)用性以及通用方面具有優(yōu)勢。再此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體地，用本發(fā)明人所開發(fā)的RACE-like PCR聯(lián)合測序的檢測方法，在103例非小細(xì)胞肺癌的病例樣本中進(jìn)行了檢測，結(jié)果得到了 11.6% (12/103)的檢出率，其中包括了已報(bào)道的6種融合形式中的其中5種。與目前報(bào)道的數(shù)據(jù)相比，在沒有特殊篩選的樣本中， 此研究的陽性率是最高的，比本發(fā)明之前最高的陽性率(7.5%)提高了約50%。與現(xiàn)有的RT-PCR以及FISH兩種方法相比，本發(fā)明方法在敏感度上具有的優(yōu)勢，并且實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上不必事先知道與ALK發(fā)生融合的基因以及ALK融合基因的融合方式，因此該方法不局限于 EML4-ALK融合基因的檢測，可擴(kuò)展到其他有ALK參與的融合基因的檢測。檢測方法如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明方法”、“RACE-like PCR聯(lián)合測序的檢測方法”或“RCAE 樣PCR聯(lián)合測序法”可互換使用。為了便于理解本發(fā)明，本發(fā)明人提供了如圖2所示的本發(fā)明方法的原理。應(yīng)理解， 本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受所述原理的限制。如圖2所示，以ALK融合基因?yàn)槔?，本發(fā)明方法分為五個(gè)步驟1)以檢測樣本的mRNA為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，利用ALK基因特異性引物1 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而擴(kuò)增得到cDNA鏈，其中所述的擴(kuò)增的cDNA鏈的序列跨越(或涵蓋)了 ALK以及與其發(fā)生融合的基因的融合區(qū)；其中，所述的ALK基因特異性引物1位于ALK以及與其發(fā)生融合的基因的遠(yuǎn)端，即從ALK基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為ALK基因特異性引物1、ALK基因(或其部分)以及與ALK基因發(fā)生融合的基因(如EML4基因)；2)在cDNA的3’端添加多聚C(polyC)的尾巴；其中，polyC尾的長度沒有特別限制，通常為8-20bp，較佳地為10-Mbp。3)以添加了 polyC尾的cDNA鏈為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，用與多聚C錨定引物與基因特異性引物2進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，從而獲得第一 PCR產(chǎn)物；其中所述的多聚C錨定引物包括(a)位于引物3’端的、與多聚C尾互補(bǔ)的polyG 結(jié)合區(qū)，以及(b)位于引物5’端的錨定區(qū)，其中所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與 PolyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)。一般，polyG結(jié)合區(qū)的長度與polyC尾的長度相對應(yīng)，通常為8_20bp，較佳地為 10-15bp。多聚C錨定引物的錨定區(qū)的長度沒有特別限制，通常為15_30bp，較佳地為 15-20bp。所述的ALK基因特異性引物2也位于ALK以及與其發(fā)生融合的基因的遠(yuǎn)端，但最遠(yuǎn)不超過ALK基因特異性引物1。雖然ALK基因特異性引物2和ALK基因特異性引物1可以重疊，但是優(yōu)選地ALK基因特異性引物2位于ALK基因特異性引物1的內(nèi)側(cè)，即從ALK基
8因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為ALK基因特異性引物1、ALK基因特異性引物2、ALK 基因(或其部分)以及與ALK基因發(fā)生融合的基因(如EML4基因)；應(yīng)理解，ALK基因特異性引物1和/或ALK基因特異性引物2都可以是特異性結(jié)合于ALK基因的外側(cè)、結(jié)合于 ALK基因的外側(cè)和ALK基因本身、或者僅合于ALK基因本身。由于本發(fā)明采用了特定結(jié)構(gòu)的多聚C錨定引物與基因特異性引物2，因此獲得的第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包括了 基因特異性引物2結(jié)合區(qū)、ALK基因(或其部分)、與ALK基因發(fā)生融合的基因(如EML4基因)、polyC區(qū)(來自多聚C錨定引物)、和錨定區(qū)(來自多聚C 錨定引物)。4)以第一 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，用錨定引物與基因特異性引物3進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，從而獲得第二 PCR產(chǎn)物；其中所述的錨定引物包括位于引物3’端的、多聚C錨定引物的錨定區(qū)相同(或互補(bǔ))的錨定區(qū)。同樣，所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與polyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)。錨定引物的錨定區(qū)的長度沒有特別限制，通常為15_30bp，較佳地為15_20bp。此外，在錨定引物的5’端可以含有或不含有額外的輔助區(qū)，該輔助區(qū)可以提供輔助的可檢測
信號等。一種優(yōu)選的錨定引物是序列完全與多聚C錨定引物的錨定區(qū)完全相同(或完全互補(bǔ))的多聚核苷酸。應(yīng)理解，所述的錨定區(qū)應(yīng)不與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3相同或互補(bǔ)(即不會與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3發(fā)生特異性結(jié)合)。所述的ALK基因特異性引物3也位于ALK以及與其發(fā)生融合的基因的遠(yuǎn)端，但最遠(yuǎn)不超過ALK基因特異性引物2，也不超過ALK基因特異性引物1。雖然ALK基因特異性引物3和ALK基因特異性引物1或2可以重疊，但是優(yōu)選地ALK基因特異性引物3位于ALK 基因特異性引物2和ALK基因特異性引物1的內(nèi)側(cè)，即從ALK基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為ALK基因特異性引物1、ALK基因特異性引物2、ALK基因特異性引物3、ALK基因(或其部分)以及與ALK基因發(fā)生融合的基因(如EML4基因)；應(yīng)理解，ALK基因特異性引物1和/或ALK基因特異性引物2和ALK基因特異性引物3都可以是特異性結(jié)合于ALK 基因的外側(cè)、結(jié)合于ALK基因的外側(cè)和ALK基因本身、或者僅合于ALK基因本身。5)對得到的長度大于陰性對照的第二 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以得到與ALK基因發(fā)生融合的基因序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，為了檢測cDNA是否成功逆轉(zhuǎn)，可以以純化后的cDNA為模板，用內(nèi)部質(zhì)控引物進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行驗(yàn)證。所述的內(nèi)部質(zhì)控引物可特異性擴(kuò)增出ALK基因 (或其部分片段)的引物。通常，內(nèi)部質(zhì)控引物特異性結(jié)合于ALK基因的外側(cè)和/或ALK基因。從ALK基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為ALK基因特異性引物1、5’端的內(nèi)部質(zhì)控引物、ALK基因(或其部分)以及3’端的內(nèi)部質(zhì)控引物。在ALK融合基因中，其一端基因相對固定(即ALK基因相對固定)，而另一端基因相對多變(如NMP、EML4)。因此，本發(fā)明方法特別適用于ALK融合基因。然而，應(yīng)理解，除了 ALK基因之外，目前還發(fā)現(xiàn)其他一些融合基因也存在一端基因相對固定，而另一端基因相對多變。本發(fā)明方法不僅可以用于檢測ALK融合基因，還可以用于其他類型的融合基因。試劑盒
本發(fā)明還提供了相應(yīng)的檢測試劑和試劑盒。通常，本發(fā)明的試劑盒可用于檢測基因融合，其中所述的融合基因是第一基因與第二基因融合形成的，所述的試劑盒包括以下組件1)位于容器a中基因特異性引物1，其中，所述的基因特異性引物1位于第一基因以及與其發(fā)生融合的第二基因的遠(yuǎn)端，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；2)位于容器b中的多聚C錨定引物；其中所述的多聚C錨定引物包括(a)位于引物3’端的、與polyC互補(bǔ)的polyG結(jié)合區(qū)，以及(b)位于引物5’端的錨定區(qū)，其中所述的錨定區(qū)既不與PolyC互補(bǔ)，也不與polyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；3)位于容器c中的基因特異性引物2，所述的基因特異性引物2對應(yīng)于第一基因以及與其發(fā)生融合的基因的遠(yuǎn)端，且不超過基因特異性引物1，從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；4)位于容器d的錨定引物，其中所述的錨定引物包括位于引物3’端的、與多聚C 錨定引物的錨定區(qū)相同或互補(bǔ)的錨定區(qū)，所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與polyG 結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；5)位于容器e中的基因特異性引物3，其中，所述的基因特異性引物3位于基因特異性引物2和基因特異性引物1的內(nèi)側(cè)，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、基因特異性引物3、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；并且，所述的多聚C錨定引物的錨定區(qū)和錨定引物錨定區(qū)都不與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3相同或互補(bǔ)，即不會與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3發(fā)生特異性結(jié)合。本發(fā)明的引物可用常規(guī)方法制備和合成?？捎糜诒景l(fā)明方法和試劑盒的反轉(zhuǎn)錄酶、PCR聚合酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶等酶沒有特別限制，可以采用本領(lǐng)域中已知的和常用的各類反轉(zhuǎn)錄酶、PCR聚合酶和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶。此外，這些酶不僅可以通過商業(yè)途徑購得，也可以用常規(guī)方法進(jìn)行制備。此外，使用各種反轉(zhuǎn)錄酶以及PCR聚合酶進(jìn)行特異性的擴(kuò)增、以及使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在末端添加PolyC尾等都是本領(lǐng)域中熟知的，在例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York =Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)等文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。通常，特異性擴(kuò)增條件包括第一輪反應(yīng)的程序?yàn)?4°C 30S，55°C 30S，72°C 3min ；72°C IOmin ；35 個(gè)循環(huán)，第二輪反應(yīng)的程序?yàn)?94°C 30S，68°C 30S，72°C 3min 40 個(gè)循環(huán)。第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物將用于測序，得到的產(chǎn)物序列將用于判斷基因融合的方式。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)靈敏度高與現(xiàn)有的RT-PCR以及FISH兩種方法相比，本發(fā)明方法在敏感度上具有的優(yōu)勢。(b)通用性強(qiáng)不必事先知道與ALK發(fā)生融合的基因以及ALK融合基因的融合方式，因此該方法不局限于EML4-ALK融合基因的檢測，可擴(kuò)展到其他有ALK參與的融合基因的檢測。(d)實(shí)用性好適用于能夠提取到RNA的各種腫瘤組織標(biāo)本檢測ALK融合。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1樣本本實(shí)施例的樣本來自廣東省人民醫(yī)院的103例經(jīng)過手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌病人，獲得的樣本用于ALK融合基因的檢測。這些樣本收集于2004年到2006年之間，其中包括62 例腺癌二9例鱗癌，11例大細(xì)胞癌，1例平滑肌肉瘤。知情同意書發(fā)放給每一位患者并得到患者的同意。該研究獲得了廣東省人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。所有103例樣本均為合格樣本可用于ALK融合基因的檢測。RNA 抽提使用市售的RNeasy試劑盒(購自QIAGEN公司，Valencia，CA)提取總RNA。所有的樣本均經(jīng)過病理評估且保證腫瘤所占的比例均不少于80 %。引物用人工合成法，合成以下各引物。表1.引物信息
權(quán)利要求
1.一種非診斷性的、體外檢測樣本中的多核苷酸是否存在基因融合的方法，其中所述的融合基因是第一基因與第二基因融合形成的，其特征在于，包括步驟1)以檢測樣本的mRNA為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，利用基因特異性引物1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而擴(kuò)增得到cDNA鏈，其中所述的擴(kuò)增的cDNA鏈的序列跨越了第一基因以及與其發(fā)生融合的第二基因的融合區(qū)；其中，所述的基因特異性引物1位于第一基因以及與其發(fā)生融合的第二基因的遠(yuǎn)端， 即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；2)在cDNA的3，端添加多聚C(polyC)的尾巴；3)以添加了polyC尾的cDNA鏈為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，用與多聚C錨定引物與基因特異性引物2進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，從而獲得第一 PCR產(chǎn)物；其中所述的多聚C錨定引物包括(a)位于引物3’端的、與多聚C尾互補(bǔ)的polyG結(jié)合區(qū)，以及(b)位于引物5’端的錨定區(qū)，其中所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與 PolyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；所述的基因特異性引物2位于第一基因以及與其發(fā)生融合的基因的遠(yuǎn)端，且不超過基因特異性引物1，從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；4)以第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，用錨定引物與基因特異性引物3 進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，從而獲得第二 PCR產(chǎn)物；其中所述的錨定引物包括位于引物3’端的、與多聚C錨定引物的錨定區(qū)相同或互補(bǔ)的錨定區(qū)，所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與polyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；其中，所述的錨定區(qū)不與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3相同或互補(bǔ)，即不會與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3發(fā)生特異性結(jié)合；所述的基因特異性引物3位于基因特異性引物2和基因特異性引物1的內(nèi)側(cè)，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、基因特異性引物3、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；5)對得到的長度大于陰性對照的第二PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以得到與第一基因發(fā)生融合的基因序列，從而確定所述的多核苷酸是否存在基因融合。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟1)和2~)之間，還包括步驟步驟1) 獲得的cDNA鏈為模板，用內(nèi)部質(zhì)控引物對進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的內(nèi)部質(zhì)控引物是特異性擴(kuò)增出第一基因(或其部分片段)的引物對。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一基因選自下組:ALK基因。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二基因是選自下組的一種或多種基因:NPM, EML4, MSN, TPM3, ATIC, TFG, CARS,以及 CLTC0
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的polyC尾的長度為8-20bp；和/或所述的PolyG結(jié)合區(qū)的長度為8-20bp ；和/或所述的多聚C錨定引物的錨定區(qū)的長度為15-30bp ；和/或所述的錨定引物的錨定區(qū)的長度為15-30bp。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特異性引物1和/或基因特異性引物2和基因特異性引物3特異性結(jié)合于第一基因的外側(cè)、結(jié)合于第一基因的外側(cè)和第一基因本身、或者僅結(jié)合于第一基因本身。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法使用選自下組的一種或多種引物序列如SEQ ID NO 1所示的基因特異性引物1 ； 序列如SEQ ID NO 2所示的多聚C錨定引物； 序列如SEQ ID NO 3所示的基因特異性引物2 ； 序列如SEQ ID NO :4所示的錨定引物； 序列如SEQ ID NO 5所示的基因特異性引物3。
9.一種用于檢測基因融合的試劑盒，其中所述的融合基因是第一基因與第二基因融合形成的，其特征在于，所述的試劑盒包括以下組件1)位于容器a中基因特異性引物1，其中，所述的基因特異性引物1位于第一基因以及與其發(fā)生融合的第二基因的遠(yuǎn)端，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；2)位于容器b中的多聚C錨定引物；其中所述的多聚C錨定引物包括(a)位于引物3’ 端的、與PolyC互補(bǔ)的polyG結(jié)合區(qū)，以及(b)位于引物5’端的錨定區(qū)，其中所述的錨定區(qū)既不與PolyC互補(bǔ)，也不與polyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；3)位于容器c中的基因特異性引物2，所述的基因特異性引物2對應(yīng)于第一基因以及與其發(fā)生融合的基因的遠(yuǎn)端，且不超過基因特異性引物1，從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；4)位于容器d的錨定引物，其中所述的錨定引物包括位于引物3’端的、與多聚C錨定引物的錨定區(qū)相同或互補(bǔ)的錨定區(qū)，所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與polyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；5)位于容器e中的基因特異性引物3，其中，所述的基因特異性引物3位于基因特異性引物2和基因特異性引物1的內(nèi)側(cè)，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、基因特異性引物3、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；并且，所述的多聚C錨定引物的錨定區(qū)和錨定引物錨定區(qū)都不與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3相同或互補(bǔ)，即不會與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3 發(fā)生特異性結(jié)合。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括選自下組的一種或多種引物序列如SEQ ID NO 1所示的基因特異性引物1 ； 序列如SEQ ID NO 2所示的多聚C錨定引物； 序列如SEQ ID NO 3所示的基因特異性引物2 ； 序列如SEQ ID NO :4所示的錨定引物； 序列如SEQ ID NO 5所示的基因特異性引物3。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測基因融合的方法。具體地，本發(fā)明提供了一種RACE-like PCR聯(lián)合測序的檢測方法(簡稱為“RCAE樣PCR聯(lián)合測序法”)，對ALK融合基因之類的融合基因進(jìn)行檢測。本發(fā)明方法不僅可同時(shí)檢測多種不同的ALK融合基因，而且在不必事先知道與ALK發(fā)生融合的基因以及ALK融合基因的融合方式的情況下，檢測出未知的ALK融合基因，從而提高了檢測方法的靈敏性、實(shí)用性以及通用性。
文檔編號C12Q1/68GK102234681SQ20101015049
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者吳一龍, 張仕蓉, 張緒超, 朱冠山 申請人:廣東省人民醫(yī)院, 阿斯利康投資(中國)有限公司