專利名稱：：6-氨基己酸的生物化學(xué)合成的制作方法6-氨基己酸的生物化學(xué)合成本發(fā)明是基于發(fā)明專利申請No.200580002757.3的分案申請。本發(fā)明涉及對6-氨基己酸(6-aminocaproicacid)進行生物化學(xué)合成的新方法。6-氨基己酸在下文中也被稱為6-ACA?；衔?-氨基己酸(IUPAC名稱6_氨基-己酸，6-amino-hexanoicacid)是生產(chǎn)ε-己內(nèi)酰胺(下文中簡稱為己內(nèi)酰胺)的可能的中間產(chǎn)物，這是生產(chǎn)尼龍-6的基礎(chǔ)。另一方面，6-氨基己酸還可通過己內(nèi)酰胺的水解形成。己內(nèi)酰胺是散裝化學(xué)物質(zhì)，其在世界范圍內(nèi)以非常大的規(guī)模被制造。用于對己內(nèi)酰胺進行工業(yè)制造的基礎(chǔ)化學(xué)物質(zhì)通常是散裝化學(xué)物質(zhì)，例如，苯、環(huán)己烷、環(huán)己酮等，從它們可以制得環(huán)己酮肟，然后其再通過所謂的Beckmarm重排轉(zhuǎn)化為己內(nèi)酰胺。但是，在回收尼龍-6地毯廢料時，例如，6-氨基己酸(以及在對尼龍-6的去聚合化步驟中形成的一些其它產(chǎn)物)可被用于通過環(huán)化反應(yīng)合成己內(nèi)酰胺。在對尼龍-6的工業(yè)回收中，生產(chǎn)己內(nèi)酰胺通常是最后的合成步驟。6-氨基己酸(6-ACA)因此適合用于合成己內(nèi)酰胺，以及隨后的對尼龍-6的生產(chǎn)。但是，6-ACA還可直接用作為生產(chǎn)尼龍-6的原材料。對于6-ACA和/或其酯類的環(huán)化而言，多種方法都是技術(shù)人員已知的。例如，可以參考US-A-6，194，572中描述的方法，其中，在反應(yīng)區(qū)域中，在不存在催化劑的情況下，用溫度在270至400°C范圍內(nèi)壓力在0.5至2MPa范圍內(nèi)的超熱蒸汽去處理6-ACA和/或其酯類。這些方法可連續(xù)操作，形成的己內(nèi)酰胺可通過在反應(yīng)混和物離開反應(yīng)區(qū)域之后立即在100至170°C范圍內(nèi)的溫度下進行部分冷凝來分離。將6-ACA直接轉(zhuǎn)化為尼龍-6例如可以按照J(rèn)P4050232-A來進行。在本專利申請中，術(shù)語“生物化學(xué)合成”(在本專利申請上下文中，該術(shù)語可被替換為“生物轉(zhuǎn)化”)的含義不僅指除大量純粹的化學(xué)反應(yīng)步驟之外還包含一種或多種生物催化反應(yīng)的方法，該術(shù)語還包括使用合適的生產(chǎn)菌株的整個細(xì)胞來進行的純粹的生物化學(xué)過程。此類純粹的生物化學(xué)過程在從合適的碳源開始的生物化學(xué)合成的情況下指發(fā)酵，在從已具有碳骨架(從其可獲得待合成的目標(biāo)分子)的中間產(chǎn)物開始的生物合成的情況下指前體發(fā)酵。這些方法可以在有氧或厭氧條件下進行。生物化學(xué)合成可以在體內(nèi)或體外進行。通常，體內(nèi)方法是用活細(xì)胞(術(shù)語“活細(xì)胞”還包括所謂的靜止細(xì)胞)進行的方法；另一方面，體外方法通常使用細(xì)胞裂解物或(部分)純化的酶來進行的。然而，在本文中提及的生物化學(xué)合成還可用滲透性(permeabilized)細(xì)胞來進行；但是，對于用滲透性細(xì)胞進行的方法來說，體內(nèi)和體外的區(qū)別沒有太多意義。本發(fā)明還涉及獲得用于合成6-氨基己酸的生物轉(zhuǎn)化過程的經(jīng)過遺傳工程改造的合適的宿主細(xì)胞的方法，還特別涉及迄今未知的用于從能得到6-氨基己酸的中間產(chǎn)物(即，6-氨基己-2-烯酸)，或從能轉(zhuǎn)化為其的化合物(即6-氨基-2-羥基己酸)對6-氨基己酸進行前體發(fā)酵的方法。在本申請的上下文中，所述化合物6-氨基己-2-烯酸和6-氨基-2-羥基己酸(下文中將有解釋)將被分別稱為6-AHEA和6-AHHA。在對6-氨基己酸的前體發(fā)酵中，如下所述，可針對前體發(fā)酵將合適的中間產(chǎn)物制備為如下可獲得的形式它們3以非限制性和非抑制性的濃度存在，例如，通過將其補料到其中進行生物化學(xué)合成(即，轉(zhuǎn)化)的反應(yīng)容器中來進行。本發(fā)明還特別涉及新穎的宿主細(xì)胞，它們具有針對6-氨基己-2-烯酸，即針對6-AHEA，的烯酸酯(enoate)還原酶活性。特別地，其還涉及具有針對6-AHEA的在空氣中穩(wěn)定的烯酸酯還原酶活性的新穎的宿主細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語“空氣中穩(wěn)定的(aerostable)，，表示耐氧的。最后，如下文中所解釋的一樣，本發(fā)明涉及通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的新穎的化合物6-AHEA和6-ACA，以及從此類6-ACA生產(chǎn)的己內(nèi)酰胺，涉及尼龍_6和其它衍生物，它們是從此類通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的化合物或此類己內(nèi)酰胺生產(chǎn)的。通常，直到今天，已知的到6-ACA的途徑都是艱苦且麻煩的。通常，如果6-ACA不是從廢的尼龍_6材料生產(chǎn)的話，這些已知的途徑都需要相對昂貴的起始原料和反應(yīng)試劑(例如，丁二烯和氫氣)，以及相對嚴(yán)格的在多步驟和多反應(yīng)器方案中的溫度和壓力反應(yīng)條件，以及需要用到昂貴的催化體系。因此，人們需要替代性的到6-ACA的途徑，優(yōu)選地，從便宜很多的原材料起始的。本領(lǐng)域公知，來自農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的天然生長的并且因此可更新的材料是可用于發(fā)酵或前體發(fā)酵的碳源(例如葡萄糖)(或其它合適的碳源或其混合物)的基礎(chǔ)。此類可更新的材料相對便宜而且可以大量獲得。通常，如果可更新的材料可用作為針對所有類型的化學(xué)材料的起始原料，會被認(rèn)為是非常有利的。本發(fā)明的目的之一是使得能夠通過生物化學(xué)合成(即，通過生物轉(zhuǎn)化)來生產(chǎn)6-ACA，這在目前是未知的。本發(fā)明的發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)了一種新穎的方法，用于對6-氨基己酸進行生物化學(xué)合成，其中，結(jié)構(gòu)式[1]的6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)H2N-CH2-CH2-CH2-CH=CH-COOH[1]或6-氨基-2-羥基己酸(6-AHHA)(這是一種能被轉(zhuǎn)化為6_氨基己_2_烯酸的化合物)被具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶處理，所述的酶活性針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子，具體而言，被具有針對6-氨基己-2-烯酸的α，烯酸酯還原酶活性的酶處理。本文中，針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性應(yīng)被理解為，能將與羧酸(-C00H)或羧酸根(_C00_)或酯(_C00R，R表示至多6個C原子的低級烷基)相鄰的α，β-位置上的α，碳-碳雙鍵轉(zhuǎn)化為還含有伯氨基(即，不形成酰胺基團一部分的-NH2基團)的分子中的碳-碳單鍵。單取代或二取代的氨基不被包含在本文所使用的伯氨基的定義內(nèi)。術(shù)語α，β-烯酸酯還原酶活性包括可測量到的活性的所有可能水平上的此類活性，包括可通過技術(shù)人員已知的方法獲得的增加的活性水平，例如，通過過量表達、誘導(dǎo)或者對相關(guān)基因加以調(diào)控、增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、增加相關(guān)基因的內(nèi)源活性等方法來實現(xiàn)，或者通過優(yōu)化試驗條件來實現(xiàn)。除6-ΑΗΕΑ之夕卜，能通過脫水作用轉(zhuǎn)化為6-ΑΗΕΑ的、相應(yīng)的飽和α-輕基-取代的化合物6-ΑΗΗΑ也可用于本發(fā)明的方法。在本專利申請的上下文中，該化合物被認(rèn)為與α-未取代的α，β-烯酸酯6-ΑΗΕΑ等同。應(yīng)當(dāng)注意，由本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的生物化學(xué)反應(yīng)，關(guān)于含α，烯酸酯基團和伯氨基的分子的轉(zhuǎn)化方面，在本領(lǐng)域中并未有描述和教導(dǎo)，盡管具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶(大多數(shù)情況下，通常特別用于含有不與氫等同的α-取代基的α，β-烯酸酯)是技術(shù)人員已知用于針對大范圍底物的其它類型的反應(yīng)的。通常，此類使用具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的已知的反應(yīng)是用于對應(yīng)異構(gòu)體特異性酶的合成的。例如，見H.Simonetal.的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol13(1974)，p.608-609、B.Rambecketal.的如上文中第609頁、I.Thanosetal.的J.Biotechnol.9，13-29(1987)、H.Simonetal.的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol.24(1985)，p.539-553和US-A-4,464，235。在H.Simon的Chem.Biochem.Flavoenzymes(1991),Chapterl1,pages317-328(出版者CRC,BocaRaton)中可以找到關(guān)于具有α，β_烯酸酯還原酶活性的酶的綜述。這些文獻中的后者表明，所述α，β-烯酸酯還原酶活性涉及從被還原的酶到烯酸酯化合物的氫化物轉(zhuǎn)移。I.Thanosetal.(上文中引用的)關(guān)注使用來自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460的烯酸酯還原酶針對α-取代的烯酸酯進行的電酶還原方面。在W0-03/066863中顯示了具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的其它例子，這些例子涉及對立體化學(xué)上純凈的α-取代的羰基化合物的合成。該文獻沒有顯示針對所用的烯酸酯還原酶的任何含有伯氨基的底物。因此，完全沒有教導(dǎo)表明，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶適合用于對羧酸基團鄰近的α-位置上未被取代且還含有伯氨基的化合物，例如6-ACA進行生物化學(xué)合成。事實上，技術(shù)人員考慮到上述可能的氫化物轉(zhuǎn)移機制，將更可能預(yù)期到那些要被具有α，烯酸酯還原酶活性的酶轉(zhuǎn)化的分子中伯氨基的存在，會對此類轉(zhuǎn)化反應(yīng)造成負(fù)面影響。預(yù)期中帶正電的氨基看起來將是被轉(zhuǎn)移的氫化物的優(yōu)選受體，因此會對烯酸酯還原酶活性造成負(fù)面干擾。還應(yīng)注意到，SteirAacheretal.(見STN數(shù)據(jù)庫編號2003:101473)進行的評述指出烯酸酯還原酶具有寬廣的底物特異性，這與來自其它文獻(例如，上文引用的H.Simonetal.)的數(shù)據(jù)一致，其中顯示了針對菌株ClostridiumtyrobutyricumDSM1460(與上文引用的I.Thanosetal.的工作中使用的同樣的菌株)中烯酸酯還原酶反應(yīng)的寬廣范圍的底物的使用，這并未改變所述的觀點。此外，在文獻中，對來自不同梭狀芽胞桿菌的烯酸酯還原酶的克隆、測序和表達已有描述(見，F(xiàn).Rohdich，etal.的J.Biol.Chem.276(6)，5779-5787(2001))。特別地，ClostridiumtyrobutyricumDSM1460禾口ClostridiumthermoaceticumDSM1974(該菌株近來與許多其它Clostridium種的菌柱一起被重新命名，因此現(xiàn)在也被稱為Moorellathermoacetica)的烯酸酯還原酶(enr)基因被克隆和測序。然而，此類克隆目前還沒有在來自例如，Bacillus、Corynel3acterium或Pichia屬的任何種中開展。但是，具體而言，關(guān)于在E.coli中克隆來自Moorellathermoacetica和來自Clostridiumtyrobutyricum的enr基因已被F.Rohdich描述過。關(guān)于這些克隆，應(yīng)當(dāng)注意到，后者(來自C.tyrobutyricum)并未被Rohdichetal.在厭氧條件下(即在厭氧條件下生長)試驗過，并且在有氧條件下的實驗導(dǎo)致烯酸酯還原酶的失活形式；而前者(來自M.thermoacetica)在有氧條件下表達時給出了同樣的結(jié)果，僅在厭氧條件下才能產(chǎn)生烯酸酯還原酶的活性形式。此外，在W0-03/066863中，已描述了在E.coli中對從BurWiolderia種獲得的烯酸酯還原酶進行克隆，這些酶已被測序。因此，引用的參考文獻中沒有一篇教導(dǎo)了形成本發(fā)明基礎(chǔ)的6-ACA形成反應(yīng)。如發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的，具有α，烯酸酯還原酶活性的酶(用于本發(fā)明的方法中的)可以是來自一大組的微生物屬(厭氧的以及需氧的那些)的任何合適的酶(即，如果可被確認(rèn)為具有針對含α，β_烯酸酯基團和伯氨基的分子，尤其是針對6-氨基己-2-烯酸的α，β-烯酸酯還原酶活性，該酶就是合適的)，例如，來自Acetobacterium、AchromobacterλAcremonium、Agrobacterium、Alcaligenes、Bacillus、Bradyrhizobium、Burkholderia、CaloramatorΛCephalosporium、Clostridium、Escherichia、Eubacterium、FilifactorλFusobacterium、Kluyveromyces、Mesorhizobium、Moorella、Ochrobactrum、Oxalophagus、OxobacterΛPaenibacillus、PseudomonasΛRalstonia、Rhizobium、Rhodotorula、Salmonella、Shigella、Sinorhizobium、Sporohalobacter、Syntrophospora、ThermoanaerobacterλThermoanaerobacterium、Tilachlidium、Vibrio、Xanthobacter或Yersinia的屬。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，具有α，烯酸酯還原酶活性的酶是來自Acetobacterimsp.、Acremoniumsp.、Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.、Cephalosporiumsp.、Clostridiumsp.、Escherichiasp.、Moorellasp.、Ochrobactrumsp.、Pseudomonassp.、Salmonellasp.、Shigellasp.、Tilachlidiumsp.、Yersiniasp.和Vibriosp.種的組的微生物的酶。更優(yōu)選地，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來自Acremoniumsp.、Clostridiumsp·、Moorellasp.、或Ochrobactrumsp.的酶。最優(yōu)選地，具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來自AcremoniumstrictumCBSl14157(保藏日2003年12月19日；按照布達佩斯條約保藏)、ClostridiumtyrobutyricumDSM1460(可從DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen獲得)、MoorellathermoaceticaDSM1974(可從DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen獲得)(該酶還被稱為DSM1974，直到1980年1月1日，被命名為Clostridiumthermoaceticum)>OchrobactrumanthropiNCIMB41200(1H%2003^Ξ12月16日；按照布達佩斯條約保藏)或ClostridiumkluyveriDSM555(可從DeutscheSammlungMikroorganismenundZellkulturen獲得)的酶。在上下文中，應(yīng)當(dāng)注意至丨」，大量的Clostridium種近來被重命名。上文中給出的名字因此指出了可由其獲得具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的菌株(細(xì)胞)和品種。使用來自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460或來自MoorellathermoaceticaDSM1974的具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶時，發(fā)明人已獲得了根據(jù)本發(fā)明的向6-ACA的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化的好結(jié)果。優(yōu)選地，針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的具有α，β_烯酸酯還原酶活性的酶具有在空氣中穩(wěn)定的α，烯酸酯還原酶活性。這意味著，該酶將能在游離氧存在的條件下催化想要的生物轉(zhuǎn)化，而沒有任何明顯的鈍化，即，在生物轉(zhuǎn)化過程中鈍化不會超過酶活的標(biāo)準(zhǔn)偏差。此類具有空氣中穩(wěn)定活性的酶可被稱為耐氧酶。因此，在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，具有α，烯酸酯還原酶活性的酶具有在空氣中穩(wěn)定的α，β-烯酸酯還原酶活性，并且是來自Agrobacteriumsp.、Burkholderiasp.^Escherichiasp.>Pseudomonassp.>Salmonellasp.>Shigellasp.、Yersiniasp.和Vibriosp.種的組的微生物的酶。更優(yōu)選地，具有空氣中穩(wěn)定的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶是來自Escherichiacoli種的，最優(yōu)選地，是來自EscherichiacoliK12的酶。本發(fā)明的方法非常適合在3至9范圍內(nèi)的pH下通過將6-氨基己_2_烯酸轉(zhuǎn)化為6-氨基己酸來進行，優(yōu)選地，4至8范圍內(nèi)的pH，更優(yōu)選地，5至8，最優(yōu)選地，在厭氧條件下5.5至7pH，在有氧條件下，6.5至8pH?？赏ㄟ^以如下方式提供6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)化合物，或者提供能代謝為該化合物的產(chǎn)品(但與純粹的碳源例如葡萄糖不同)，使得起始材料6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)可為根據(jù)本發(fā)明的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化所用，所述方式使得該化合物在所用的反應(yīng)器中以非限制性和非抑制性的濃度存在，例如通過向其中進行生物化學(xué)過程的反應(yīng)容器(例如，發(fā)酵罐)中補料來進行。其中6-AHEA(或其可被代謝的前體)以上述方式用于反應(yīng)容器中的根據(jù)本發(fā)明的方法被稱為“前體發(fā)酵”。當(dāng)然，還可通過發(fā)生于含α，β-烯酸酯還原酶活性的微生物中的任何合適的生物化學(xué)方法，使得6-ΑΗΕΑ(或任何能被代謝為其但與純粹的碳源不同的產(chǎn)品)可以被根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化所利用。例如，人們已知，賴氨酸可通過在Corynebacteriumglutamicum細(xì)胞中的生物轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生(例如，見PfefferleW.的Adv.Biochem.Eng.(2003)，Vol.79，p59-l12)。Corynebacteriumglutamicum完整基因組序列的已知對于賴氨酸的生物技術(shù)生產(chǎn)的改進產(chǎn)生了重大的影響。假設(shè)微生物中的賴氨酸隨后可被轉(zhuǎn)化為6-AHEA，這是迄今為止未被公開或提出的方法，它將可能是制備可用于本發(fā)明轉(zhuǎn)化的6-AHEA的合適方法。通過技術(shù)人員容易獲得的化學(xué)方法，可將通過生物化學(xué)合成(生物轉(zhuǎn)化)產(chǎn)生的賴氨酸轉(zhuǎn)化為6-AHEA。例如，按照Houben-Weyl，MethodsofOrganicChemistry(4thedition),VolE22a,Thieme,Stuttgart,2002page166-191所述，通過首先用賴氨酸-銅(II)復(fù)合物方法保護氨基來進行?？蛇x的保護基團是乙?；?、苯甲?；⒈揭阴；?、芐氧羰基或鄰苯二甲酰亞胺基(phthaloylimide)。隨后在硫醇或硒醇存在的情況下對α-氨基進行的亞硝化反應(yīng)導(dǎo)致了相應(yīng)的α-硫或α-硒醚的形成。該亞硝化可以在具有NaNO2/H2S04的水性介質(zhì)中進行，或者在使用例如，亞硝酸異戊酯(iso-amylnitrite)的無水條件下進行。硫醇的合適例子是(被取代的)苯硫酚和苯甲基硫醇；該反應(yīng)中苯硒醇是作為硒醇優(yōu)選的。隨后用H2O2對α-硫醚或α-硒醚氧化以及隨后進行原位消去反應(yīng)將獲得ε-保護的6-ΑΗΕΑ。該過程的例子由S.Bory,M.Gaudry,A.Marquet；NouveauJournaldeChimie(1986)，10，709-713所描述。通過酸或堿催化的對ε-保護基團的水解，獲得6-ΑΗΕΑ。當(dāng)6-ΑΗΕΑ是在細(xì)胞中通過生物化學(xué)方法產(chǎn)生(或來自通過生物轉(zhuǎn)化制造的賴氨酸)的情況下，得到的6-ACA(以及在從細(xì)胞中排出和通過任何已知方法進行的環(huán)化之后從其獲得的己內(nèi)酰胺)與從化石給料(fossilefeedstock)的化學(xué)途徑獲得的6-ACA(和/或由此獲得的己內(nèi)酰胺，分別從其獲得的產(chǎn)品，例如，從此類己內(nèi)酰胺獲得的尼龍-6)可以很容易地區(qū)分開。在后一種情況中，分子中不存在14C是顯而易見的?；蛘?，可以用12C比13C比14C同位素的比例(可通過StableIsotopeRatioMassSpectrometry(SIRMS)方法，或通過所謂的經(jīng)由NuclearMagneticResonance的Site-SpecificNaturalIsotopeFractionation(SNIF-NMR，它們可用于對生物物質(zhì)的鑒定)作為6-ACA(和/或己內(nèi)酰胺)來源的指紋，因為，12C比13C比14C同位素的比例將與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同。起始材料，6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)還可通過純粹的化學(xué)方法獲得，例如，與P.Hughesetal.關(guān)于蘇_3_羥基賴氨酸合成的J.Org.Chem.vol.59(1994)，pages5799-5802中所述的方法中流程2的步驟a和i類似的方法。這被展示在本申請的實驗部分中。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選在選自由Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium、hcherichia和Pichia屬組成的組的宿主生物中進行。屬于Corynekicteriumsp.的組，例如C.glutamicum的宿主生物是特別優(yōu)選的，因為這些微生物已知適合用于對賴氨酸的生物合成生產(chǎn)。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方式中，適于對6-氨基己酸進行生物化學(xué)合成的宿主菌株以及由此的宿主細(xì)胞選自Escherichiacoli、Bacillus、Corynebacteriumglutamicum、Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主細(xì)胞的組，其中，編碼具有針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，烯酸酯還原酶活性的α，β_烯酸酯還原酶基因被克隆和表達?？梢源嫒魏紊鲜靓?，β-烯酸酯還原酶基因，編碼具有α，β-烯酸酯還原酶活性并且能將6-ΑΗΕΑ以足夠程度轉(zhuǎn)化為6-ACA的任何其它基因可以使用，其被認(rèn)為是落在了要求保護的范圍之內(nèi)。在本申請?zhí)岬降募?xì)胞中，現(xiàn)有技術(shù)中僅描述了用來自MoorellathermoaceticaDSM1974或來自Clostridiumtyrobutyricum的α,β-烯酸酯還原酶基因克隆的hcherichiacoli細(xì)胞；上面提到的其它細(xì)胞都是新穎的細(xì)胞。此外，如本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的，編碼具有空氣中穩(wěn)定的、針對含α，烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，烯酸酯還原酶活性的酶的基因可被用于本發(fā)明的方法。例如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，已知具有N-乙基馬來酰亞胺還原酶活性的基因，EscherichiacoliK12(菌株W3110)的nemA基因(編號D86931)也具有針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性。nemA基因的這種α，β_烯酸酯還原酶活性以前是未知的?；谂c來自E.coli的nemA基因的序列同源性，編碼具有在空氣中穩(wěn)定的、針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，β-烯酸酯還原酶活性的酶的其它基因?qū)⒖蓮膩碜岳鏏grobacterium、Escherichia、Pseudomonas、Salmonella、Shigella、Yersinia禾口Vibrio的菌株中獲得。就本專利申請的目的而言，編碼具有在空氣中穩(wěn)定的、針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，烯酸酯還原酶活性的酶的所有此類其它基因都被認(rèn)為是與nemA等同的。因此，本發(fā)明還特別涉及如下新穎的細(xì)胞-Escherichiacoli宿主細(xì)胞，其中，來自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200或來自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達；-Bacillus宿主細(xì)胞，其中，來自MoorellathermoaceticaDSM1974,或來自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460,^jfegOchrobactrumanthropiNCIMB41200,自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達；-Corynebacteriumglutamicum宿主細(xì)胞，其中，來自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460，或來自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200，或來自AcremoniumstrictumCBS114157的α,β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達；-Aspergillusniger,gMoorellathermoaceticaDSM1974,^；JfegClostridiumtyrobutyricumDSM1460,^jftgOchrobactrumanthropiNCIMB41200,或來自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達；-Pichiapastoris宿主細(xì)胞，其中，來自MoorellathermoaceticaDSM1974，或來自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460,^jftgOchrobactrumanthropiNCIMB41200,^；來自AcremoniumstrictumCBS114157的α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達；以及-選自Aspergillus、Bacillus、Corynebacterium和Pichia宿主細(xì)胞的組的宿主細(xì)胞，其中，來自E.coliK12的在空氣中穩(wěn)定的α，β-烯酸酯還原酶基因nemA被克隆和表達。通常，具有在空氣中穩(wěn)定的α，烯酸酯還原酶活性的酶在本發(fā)明的上下文中是明確優(yōu)選的。這是因為在有氧條件下培養(yǎng)和/或使用的微生物中它們能被表達和使用?？梢酝ㄟ^技術(shù)人員已知的任何合適的克隆策略，例如通過實驗部分中描述的Tj法，來獲得下述Escherichiacoli、或Bacillus、或Corynebacteriumglutamicum、或Aspergillusniger或Pichiapastoris宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞中，來自MoorellathermoaceticaDSM1974,g*自ClostridiumtyrobutyricumDSM1460,g*自O(shè)chrobactrumanthropiNCIMB41200,SAcremoniumstrictumCBSl14157白勺α，β-烯酸酯還原酶基因被克隆和表達(或者，與它們同源、并且編碼具有α，β-烯酸酯還原酶活性且能以足夠程度將6-ΑΗΕΑ轉(zhuǎn)化為6-ACA的酶的任何此類基因)。還可參考公知的手冊，SambrookJ.,Fritsch,Ε.F.,andManiatis,Τ.MolecularClonning:ALaboratoryManual.2nded.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY，1989。類似地，此類克隆策略還可被用于構(gòu)建上面提到的nemA克隆(或與其等同的克隆)。此外，特別是當(dāng)從真菌中獲得的基因被克隆到細(xì)菌菌種中的情況下，技術(shù)人員將使用合適的手段，不僅用于改造轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，此外還使用經(jīng)過分離的或通過合成獲得的cDNA序列，以獲得將被制造的酶的功能性表達。此外，本發(fā)明還涉及對6-氨基己酸(6-ACA)進行前體發(fā)酵的方法，其中，從6_氨基己-2-烯酸(6-AHEA)或從6-氨基-2-羥基己酸(6-AHHA)開始，應(yīng)用至少一個酶步驟，其中使用具有針對含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子的α，烯酸酯還原酶活性的酶，特別是使用具有針對6-氨基己-2-烯酸的α，烯酸酯還原酶活性的酶。在最優(yōu)選的實施方式中，此類前體發(fā)酵在能體內(nèi)形成6-氨基己-2-烯酸(6-ΑΗΕΑ)的微生物中進行。事實上，在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的6-ACA的形成是起始自任何合適碳源的向6-ACA的生物轉(zhuǎn)化。適合用于本發(fā)明方法的此類特殊實施方式的碳源是寡糖和二糖，例如，麥芽糖，β-半乳糖苷，蜜二糖，表蜜二糖(印imelibiose)，肌醇半乳糖苷，蜜二醇(melibitol)，半乳糖苷甘油和海藻糖(trehalose)，己糖，例如，D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖和D-半乳糖，含有葡萄糖的溶液或漿體，淀粉，含有碳源的溶液或漿體，氨基糖，例如，N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺，甲基戊糖，例如，L-海藻糖(fucose)和L-鼠李糖，戊糖和丙糖，例如，L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、木糖醇、D-來蘇糖、D-核糖、2-脫氧-2-D-核糖和二羥基丙酮，核苷和去氧核苷中的戊糖，例如，胞嘧啶核苷、去氧胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、去氧腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、黃嘌呤核苷、胸腺嘧啶脫氧核苷(去氧尿嘧啶核苷)，嘌呤(腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤核糖核苷)，heXur0nides，heXur0nates和己糖酸酯，例如D-葡9萄糖酸酯和D-半乳糖醛酸酯(D-galactonate)，磷酸化的糖和羧酸酯，例如己糖磷酸酯以及sn-甘油3-磷酸酯，二羧酸酯，例如琥珀酸酯、富馬酸酯和L-蘋果酸酯，三羧酸，多羥基化合物，例如，D-甘露糖醇、D-葡萄糖醇、D-山梨糖醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、D-阿拉伯醇、核糖醇和木糖醇、甘油，二碳化合物，例如乙醇和乙酸酯，脂肪酸，.羥乙酸酯(glycolate)和乙醛酸酯(glyoxylate)以及甲醇，可食用油或任意上述化合物的混合物。最優(yōu)選地，6-氨基己-2-烯酸(6-AHEA)是在體內(nèi)從含有合適碳源的溶液或漿體形成的。此類合適的碳源可以選自葡萄糖、含有葡萄糖的溶液或漿體、(甲)乙醇、葡萄糖酸酯、戊糖、己糖、淀粉和脂肪酸的組。特別地，使用的碳源是葡萄糖。如上所述，因為對游離氧耐受的(并且因此可被描述為在空氣中穩(wěn)定的)、具有針對6-AHEA的烯酸酯還原酶活性的酶是本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的(即，在有氧條件下培養(yǎng)和/或使用的微生物中可被表達和使用的酶)，因此優(yōu)選使用在有氧條件下可用的微生物。有氧條件下的生長效率(即，也是生物物質(zhì)產(chǎn)量)以及相關(guān)(多種)酶和/或?qū)⒈簧a(chǎn)的物質(zhì)產(chǎn)生的效率，通常比厭氧條件下的生長要高得多。例如，能獲得好得多的關(guān)于葡萄糖(或其它碳源)的產(chǎn)量。此類優(yōu)點在，例如，通用手冊H.khlegel，Thieme,Germany(1981)的"AllgemeineMikrobiologie"中有所描述。此外，本發(fā)明涉及新穎的、通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的如本文所公開的物質(zhì)，涉及由此獲得的、且12C比13C比14C同位素比例與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的產(chǎn)品，即，涉及通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的、具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的1V比"c比14C同位素比例的6-氨基己-2-烯酸；具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的6-氨基-己酸；具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的、從通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-羧基-6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸產(chǎn)生的ε-己內(nèi)酰胺；涉及具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例的尼龍-6或其衍生物，所述尼龍-6是從通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸，或從ε-己內(nèi)酰胺產(chǎn)生的，所述ε-己內(nèi)酰胺是從通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸生產(chǎn)的。通過本文描述的方法，可以容易地鑒定出這些新穎的化合物，例如，通過MableIsotopeRatioMassSpectrometry(SIRMS)方法或通過由NMR進行的Site-SpecificNaturalIsotopeFractionation.這些新穎的化合物與從化石碳源通過化學(xué)合成獲得的、在現(xiàn)有技術(shù)文獻中有所描述的相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)式明顯不同(即，它們的12C比13C比14C同位素比例方面)。下述實驗結(jié)果將對本發(fā)明加以詳述，但是，本發(fā)明并不被該實驗部分的方法或原理所限制。此外，應(yīng)當(dāng)清楚，通過類推，本發(fā)明將可用于從ω-氨基2-烯烴羧酸對更高級的α，ω-氨基羧酸進行生物合成(以及隨后對來自其的聚酰胺的生產(chǎn))。例如，11-氨基-2-十一烯酸可以作為合成聚酰胺-11的起始化合物。用于通過處理其相應(yīng)的α，β-不飽和羧酸來生產(chǎn)此類高級α，ω-氨基羧酸的實施方式被認(rèn)落為在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。I從4-氨基丁醛二乙縮醛來制備6-氨基己-2-烯酸出-AHEA)在R.Hamiltonetal.,Tet.Letters1993(34)，ρ·2847—2850，在P.Hughesetal.,J.Org.Chem.1994(59),p.5799-5802,以及在C.Stammeretal.,J.Org.Chem.1969(34)，p.2306-2311中分別描述了相關(guān)的反應(yīng)步驟。在Dean-Stark條件下，4-氨基丁醛二乙縮醛(技術(shù)級，90%；202.4g,1130mmol)和鄰苯二甲酸酐(186g，1256mmol)在含有大約IOwt.%三乙胺(TEA;166g，1640mmol)的甲苯(1700ml)中進行4小時的反應(yīng)。冷卻至室溫(RT)后，真空蒸發(fā)掉溶劑和多余的TEA。將殘余物溶解，在2MHCl水溶液QOOOml)和丙酮Q800ml)的混合物中回流20分鐘。冷卻至室溫后，真空移除丙酮，用CH2Cl2(h200ml)萃取殘余物。用2MHCl水溶液(3x200ml)和飽和NaHCO3水溶液(h200ml)來洗有機相。在Na2SO4上干燥溶液之后，通過真空蒸發(fā)掉CH2Cl2來分離4-鄰苯二甲酰亞氨基正丁醛G-phtalimidobutanal)。在真空下除濕器中于P2O5上干燥之后，獲得了MO.5g的4-鄰苯二甲酰亞氨基正丁醛(產(chǎn)率98%)。再將4-鄰苯二甲酰亞氨基正丁醛(120.9g，556mmOl)溶于600ml的CH2Cl2，用600mlCH2Cl2中的(三苯基正膦基亞基)乙酸甲酯(methyl(triphenylphosphoranylidene)acetate)(186g,556mmol)對其進行處理。1小時后，在真空下對混合物進行濃縮，分七等分進行色譜(MerckKieselgel60；7x14cm柱；用己烷中30%的乙酸乙酯進行洗脫)，得到了145.6g(96%)的甲基-6-鄰苯二甲酰亞氨基己-2-烯酸酯^-phtalimidohex-2_enoate)，其為白色固體。甲基-6-鄰苯二甲酰亞氨基己-2-烯酸酯(145.6g；533mmol)被溶于甲醇(900ml)，與1700ml蒸餾水中的71.6gNa0H(1790mmol)在室溫下攪拌8小時。用木炭處理溶液并過濾。用沈咖丨37%的HCl水溶液對濾出物進行酸化，然后回流3小時。冷卻至室溫后，將小量沉淀物過濾掉，將溶液在真空下濃縮至開始結(jié)晶。沉淀物被濾走，在真空下將溶液蒸發(fā)至干。用2-丙醇和乙酸乙酯的71(體積/體積)混合物(hSOOml)煮沸殘余物，以提取產(chǎn)物。過濾之后，真空下蒸發(fā)溶劑，殘余物從2-丙醇(385ml)中重結(jié)晶出來，得到了36.7g(42%)的6-氨基-己-2-烯酸HCl鹽。用250MHz匪R在CD3OD中進行測量得到的關(guān)于6-AHEA的匪R數(shù)據(jù)如下所示權(quán)利要求1.通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-氨基己-2-烯酸，具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。2.通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-氨基-己酸，具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。3.e-己內(nèi)酰胺，其具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例，是從通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的6-氨基己-2-烯酸或6-氨基-己酸制造的。4.從如權(quán)利要求1或2所述通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的任何產(chǎn)品或從如權(quán)利要求3所述的e-己內(nèi)酰胺制造的尼龍-6和其它衍生物，其具有與環(huán)境二氧化碳中存在的值大致相同的12C比13C比14C同位素比例。全文摘要本發(fā)明涉及6-氨基己酸的生物化學(xué)合成。本發(fā)明涉及從6-氨基己-2-烯酸化合物或從6-氨基-2-羥基己酸來進行6-氨基己酸生物化學(xué)合成的方法，這是通過用具有α，β-烯酸酯還原酶活性的酶去處理含α，β-烯酸酯基團和伯氨基的分子來實現(xiàn)的。本發(fā)明還涉及獲得用于此類生物轉(zhuǎn)化過程的經(jīng)過遺傳工程改造的合適的細(xì)胞的方法，以及涉及從能得到6-氨基己酸的中間產(chǎn)物進行的對6-氨基己酸的前體發(fā)酵。最后，本發(fā)明涉及一些新穎的通過生物化學(xué)方法生產(chǎn)的化合物，即，6-氨基己-2-烯酸、6-氨基己酸，以及涉及由此生產(chǎn)的己內(nèi)酰胺，以及尼龍-6和來自此類生物化學(xué)方法生產(chǎn)的化合物或己內(nèi)酰胺的其它衍生物。文檔編號C12P7/42GK102285893SQ201010151079公開日2011年12月21日申請日期2005年1月17日優(yōu)先權(quán)日2004年1月19日發(fā)明者保羅·瑪麗亞·布朗特斯,彼得呂斯·馬蒂納斯·馬特烏斯·諾斯恩,斯蒂法恩·馬莉亞·安德勒·德威爾德曼,桑德拉·爾恩斯特,比托納拉·凱薩琳娜·拉伊馬克斯-弗蘭肯,韋南德·彼得·赫勒納·派特斯,馬丁·舒爾曼,馬塞爾·格哈杜斯·烏博爾特斯申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司