專利名稱：固定化過氧化物酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境科學領(lǐng)域，涉及一種新型環(huán)境功能材料，具體地說是一種以納米磁鐵顆粒為載體的固定化過氧化物酶的制備方法。
背景技術(shù)：
酶的固定化是指通過物理或化學的方法將酶分子固定到載體表面。固定化酶的制 備方法有物理法和化學法兩大類。主要的物理固定方法有吸附法、包埋法。吸附法操作簡 單，條件溫和，不會引起酶的變性失活，但酶與載體結(jié)合部不太牢固而易脫落。包埋法雖然 可以固定大量的酶，但酶在底物反應過程中造成較大的傳質(zhì)阻力?；瘜W固定法是目前應用 最多的酶固定化技術(shù)，酶與載體結(jié)合牢固，制得的固定化酶穩(wěn)定性好，但制備過程中反應條 件較為強烈，難以控制，最終可能導致酶被固定化后失活較為嚴重。層層自組裝技術(shù)是基于靜電相吸而產(chǎn)生多層膜自組裝體系的技術(shù)，通過輪流地交 換吸附溶液，使兩種帶相反電荷的離子相互吸引結(jié)合構(gòu)成多層膜結(jié)構(gòu)。具體而言就是將底 物上帶有電荷的聚合物表面連續(xù)而又交替地沉浸在帶有完全相反電荷的兩種溶液中，利用 靜電相吸的作用，使帶不同電荷的兩種物質(zhì)有序而緊湊地連接在一起，重復數(shù)次得到多層 膜結(jié)構(gòu)。該技術(shù)在材料、生物和藥物/基因釋放等領(lǐng)域得到了廣泛的應用。但迄今為止，層 層自組裝技術(shù)在環(huán)境科學領(lǐng)域的應用還是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題，提供一種固定化過氧化物酶的制備方法，該方法利用層層 自組裝技術(shù)制備固定化過氧化氫酶，制得的固定化過氧化氫酶活性高、穩(wěn)定性好。按照本發(fā)明的技術(shù)方案一種固定化過氧化物酶的制備方法，包括以下步驟a.載體的預處理用超聲波將磁鐵顆粒按質(zhì)量體積比為1 10 1 20的比例 分散到含20g/L殼聚糖和冰醋酸的溶液中，混合均勻，充分攪拌下逐滴加入含乳化劑的 石蠟油，繼續(xù)攪拌，加入戊二醛溶液作為交聯(lián)劑，40°C下反應lh，然后加入適量NaOH溶液， 調(diào)節(jié)PH至9 10，用石油醚或乙醇洗去多余的殼聚糖和石蠟油，干燥后得到表面包裹殼聚 糖的磁鐵顆粒；b.成膜材料的選擇選擇聚磺化苯乙烯鈉鹽和聚鹽酸烯丙胺分別作載體的A層膜 電解質(zhì)材料和B層膜電解質(zhì)材料，用IOmmol的醋酸緩沖液配制濃度為2% 5%的聚電解 質(zhì)溶液，加0. 05% 0. 08% NaCl溶液控制聚電解質(zhì)溶液的離子強度；c.配置過氧化物酶溶液用pH4. 5 5. 5醋酸緩沖液配制酶活力為250U/mg的過 氧化物酶溶液；d.靜電交替沉積A層膜的吸附將載體置于A層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物酶溶液的混合溶液中， 通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附20min 60min后，用緩沖液沖洗 2min 20min ；
B層膜的吸附將經(jīng)過A層膜吸附后的載體置于B層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物 酶溶液的混合溶液中，通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附20min 60min后，用緩沖液沖洗2min 20min ；e.重復d步驟至少一次，即得固定化過氧化物酶。所述石蠟油含Span-80乳化劑，所述石蠟油含Span-80乳化劑的體積濃度為 0. 5%。所述戊二醛溶液的體積濃度為8%。所述步驟e中，重復d步驟三次。本發(fā)明的技術(shù)效果在于本發(fā)明用層層自組裝技術(shù)將過氧化物酶固定化到納米磁 鐵顆粒的表面，不僅具有固定酶量多，且酶活力保留量較大；本發(fā)明制得的固定化過氧化物 酶活性高，有很高的穩(wěn)定性，可以回收循環(huán)利用，可以用于含苯酚苯胺廢水的無害化處理。本發(fā)明具有兩大優(yōu)勢1、可以形成多層酶結(jié)構(gòu)，達到較高酶上載量；2、可在常溫 水溶液中進行，不形成共價鍵，可以保證蛋白質(zhì)分子維持生物活性的天然構(gòu)象，從而最大程 度的保留其催化活性。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。本發(fā)明是一種固定化過氧化物酶的制備方法，包括以下步驟a.載體的預處理用超聲波將磁鐵顆粒按質(zhì)量體積比為1 10 1 20的比例 分散到含20g/L殼聚糖和冰醋酸的溶液中，混合均勻，充分攪拌下逐滴加入含乳化劑的 石蠟油，繼續(xù)攪拌，加入戊二醛溶液作為交聯(lián)劑，40°C下反應lh，然后加入適量NaOH溶液， 調(diào)節(jié)PH至9 10，用石油醚或乙醇洗去多余的殼聚糖和石蠟油，干燥后得到表面包裹殼聚 糖的磁鐵顆粒。所述石蠟油含體積濃度為0.5%的Span-80乳化劑。所述戊二醛溶液的體 積濃度為8%。磁鐵顆粒的粒徑為50nm，可由Sigma-Aldrich公司購得。預處理的目的是 使載體表面帶上電荷，以便聚電解質(zhì)和酶的組裝。b.成膜材料的選擇選擇聚磺化苯乙烯鈉鹽(PSS)和聚鹽酸烯丙胺(PAH)分別作 載體的A層膜電解質(zhì)材料和B層膜電解質(zhì)材料，用IOmmol的醋酸緩沖液配制濃度為2% 5%的聚電解質(zhì)溶液，加0. 05% 0. 08% NaCl溶液控制聚電解質(zhì)溶液的離子強度；c.配置過氧化物酶溶液用pH4. 5 5. 5醋酸緩沖液配制酶活力為250U/mg的過 氧化物酶溶液；d.靜電交替沉積A層膜的吸附將載體置于A層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物酶溶液的混合溶液中，通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附20min 60min后，用緩沖液沖洗 2min 20min ；B層膜的吸附將經(jīng)過A層膜吸附后的載體置于B層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物 酶溶液的混合溶液中，通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附20min 60min后，用緩沖液沖洗2min 20min ；e.重復d步驟至少一次，最好是重復d步驟三次，即得固定化過氧化物酶。本發(fā)明用層層自組裝技術(shù)將過氧化物酶固定化到納米磁鐵顆粒的表面，不僅具有固定酶量多，且酶活力保留量較大；本發(fā)明制得的固定化過氧化物酶活性高，有很高的穩(wěn)定性，可以回收循環(huán)利用，可以用于含苯酚苯胺廢水的無害化處理。本發(fā)明制得的固定化過氧化物酶可通過以下方法測定其酶活性pH 6. 0的過氧 化氫，IOmmol愈創(chuàng)木酚，用分光光度計在470nm處測定最大吸光值，以每分鐘吸光度變化值 表示酶活性的大小。固定化酶穩(wěn)定性(溫度、pH、儲存)分別取游離酶和固定化酶置于70°C水浴中保 溫，定時取樣監(jiān)測其活性，從而確定酶的熱穩(wěn)定性。取適量游離酶和固定化酶，分別置于PH 值不同的緩沖溶液中，25°C保溫，每隔一段時間取樣測定活性。將游離酶和固定化酶在4°C 保藏1、2、3、4、5、6周后，測定酶活性。以下是本發(fā)明的具體實施例實施例1a.載體的預處理用超聲波將1. Og粒徑為50nm的磁鐵顆粒分散到20ml含20g/ L殼聚糖和冰醋酸的溶液中，混合均勻，充分攪拌下逐滴加入含體積濃度為0.5%的 Span-80乳化劑的石蠟油，繼續(xù)攪拌30min，加入體積濃度為8%的戊二醛溶液作為交聯(lián)劑， 40°C下反應lh，然后加入適量NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至9 10，用石油醚或乙醇洗去多余的殼 聚糖和石蠟油，干燥后得到表面包裹殼聚糖的磁鐵顆粒。b.成膜材料的選擇選擇聚磺化苯乙烯鈉鹽(PSS)和聚鹽酸烯丙胺(PAH)分別作 載體的A層膜電解質(zhì)材料和B層膜電解質(zhì)材料，用IOmmol的醋酸緩沖液配制濃度為2%的 聚電解質(zhì)溶液，加0. 05% NaCl溶液控制聚電解質(zhì)溶液的離子強度；c.配置過氧化物酶溶液用pH4. 5醋酸緩沖液配制酶活力為250U/mg的過氧化物 酶溶液；d.靜電交替沉積A層膜的吸附將載體置于A層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物酶溶液的混合溶液中， 通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附60min后，用緩沖液沖洗20min;B層膜的吸附將經(jīng)過A層膜吸附后的載體置于B層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物 酶溶液的混合溶液中，通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附60min后， 用緩沖液沖洗20min ；e.重復d步驟三次，即得固定化過氧化物酶。以上得到的納米磁鐵固定化過氧化物酶的酶活為210U/mg，在溫度為30 45°C 內(nèi)，酶活保留在80%以上，在pH4 7. 2以內(nèi)酶活保留在78%以上，在4°C保藏1 35d內(nèi) 酶活保留75%以上。實施例2a.載體的預處理用超聲波將1. Og粒徑為50nm的磁鐵顆粒分散到20ml含20g/ L殼聚糖和冰醋酸的溶液中，混合均勻，充分攪拌下逐滴加入含體積濃度為0.5%的 Span-80乳化劑的石蠟油，繼續(xù)攪拌30min，加入體積濃度為8%的戊二醛溶液作為交聯(lián)劑， 40°C下反應lh，然后加入適量NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至9 10，用石油醚或乙醇洗去多余的殼 聚糖和石蠟油，干燥后得到表面包裹殼聚糖的磁鐵顆粒。b.成膜材料的選擇選擇聚磺化苯乙烯鈉鹽(PSS)和聚鹽酸烯丙胺(PAH)分別作 載體的A層膜電解質(zhì)材料和B層膜電解質(zhì)材料，用IOmmol的醋酸緩沖液配制濃度為3. 5%的聚電解質(zhì)溶液，加0. 06% NaCl溶液控制聚電解質(zhì)溶液的離子強度；c.配置過氧化物酶溶液用pH5醋酸緩沖液配制酶活力為250U/mg的過氧化物酶 溶液；d.靜電交替沉積A層膜的吸附將載體置于A層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物酶溶液的混合溶液中， 通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附40min后，用緩沖液沖洗IOmin ；B層膜的吸附將經(jīng)過A層膜吸附后的載體置于B層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物 酶溶液的混合溶液中，通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附40min后， 用緩沖液沖洗IOmin ；e.重復d步驟三次，即得固定化過氧化物酶。以上得到的納米磁鐵固定化過氧化物酶的酶活為190U/mg，在溫度為30 45°C 內(nèi)，酶活保留在60%以上，在pH4 7. 2以內(nèi)酶活保留在65%以上，在4°C保藏1 35d內(nèi) 酶活保留70%以上。實施例3a.載體的預處理用超聲波將1. Og粒徑為50nm的磁鐵顆粒分散到IOml含20g/ L殼聚糖和冰醋酸的溶液中，混合均勻，充分攪拌下逐滴加入含體積濃度為0.5%的 Span-80乳化劑的石蠟油，繼續(xù)攪拌30min，加入體積濃度為8%的戊二醛溶液作為交聯(lián)劑， 40°C下反應lh，然后加入適量NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至9 10，用石油醚或乙醇洗去多余的殼 聚糖和石蠟油，干燥后得到表面包裹殼聚糖的磁鐵顆粒。b.成膜材料的選擇選擇聚磺化苯乙烯鈉鹽(PSS)和聚鹽酸烯丙胺(PAH)分別作 載體的A層膜電解質(zhì)材料和B層膜電解質(zhì)材料，用IOmmol的醋酸緩沖液配制濃度為5%的 聚電解質(zhì)溶液，加0. 08% NaCl溶液控制聚電解質(zhì)溶液的離子強度；c.配置過氧化物酶溶液用pH5. 5醋酸緩沖液配制酶活力為250U/mg的過氧化物 酶溶液；d.靜電交替沉積A層膜的吸附將載體置于A層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物酶溶液的混合溶液中， 通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附20min后，用緩沖液沖洗2min;B層膜的吸附將經(jīng)過A層膜吸附后的載體置于B層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物 酶溶液的混合溶液中，通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附20min后， 用緩沖液沖洗2min ；e.重復d步驟三次，即得固定化過氧化物酶。以上得到的納米磁鐵固定化過氧化物酶的酶活為170U/mg，在溫度為30 45°C 內(nèi)，酶活保留在55%以上，在pH4 7. 2以內(nèi)酶活保留在60%以上，在4°C保藏1 35d內(nèi) 酶活保留58%以上。
權(quán)利要求
一種固定化過氧化物酶的制備方法，其特征是，包括以下步驟a.載體的預處理用超聲波將磁鐵顆粒按質(zhì)量體積比為1∶10～1∶20的比例分散到含20g/L殼聚糖和1％冰醋酸的溶液中，混合均勻，充分攪拌下逐滴加入含乳化劑的石蠟油，繼續(xù)攪拌，加入戊二醛溶液作為交聯(lián)劑，40℃下反應1h，然后加入適量NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至9～10，用石油醚或乙醇洗去多余的殼聚糖和石蠟油，干燥后得到表面包裹殼聚糖的磁鐵顆粒；b.成膜材料的選擇選擇聚磺化苯乙烯鈉鹽和聚鹽酸烯丙胺分別作載體的A層膜電解質(zhì)材料和B層膜電解質(zhì)材料，用10mmol的醋酸緩沖液配制濃度為2％～5％的聚電解質(zhì)溶液，加0.05％～0.08％NaCl溶液控制聚電解質(zhì)溶液的離子強度；c.配置過氧化物酶溶液用pH4.5～5.5醋酸緩沖液配制酶活力為250U/mg的過氧化物酶溶液；d.靜電交替沉積A層膜的吸附將載體置于A層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物酶溶液的混合溶液中，通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附20min～60min后，用緩沖液沖洗2min～20min；B層膜的吸附將經(jīng)過A層膜吸附后的載體置于B層膜聚電解質(zhì)溶液和過氧化物酶溶液的混合溶液中，通過靜電作用，使過氧化物酶沉積吸附在載體表面，吸附20min～60min后，用緩沖液沖洗2min～20min；e.重復d步驟至少一次，即得固定化過氧化物酶。
2.按照權(quán)利要求1所述的固定化過氧化物酶的制備方法，其特征是所述石蠟油含 Span-80乳化劑，所述石蠟油含Span-80乳化劑的體積濃度為0. 5%。
3.按照權(quán)利要求1所述的固定化過氧化物酶的制備方法，其特征是所述戊二醛溶液的 體積濃度為8%。
4.按照權(quán)利要求1所述的固定化過氧化物酶的制備方法，其特征是所述步驟e中，重復 d步驟三次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固定化過氧化物酶的制備方法，包括載體的預處理，用超聲波將磁鐵顆粒分散到殼聚糖和冰醋酸的溶液中，加入含乳化劑的石蠟油，加入戊二醛溶液，干燥后得到表面包裹殼聚糖的磁鐵顆粒、成膜材料的選擇，選擇聚磺化苯乙烯鈉鹽和聚鹽酸烯丙胺分別作載體的A層膜電解質(zhì)材料和B層膜電解質(zhì)材料、配置過氧化物酶溶液、靜電交替沉積，經(jīng)過A層膜的吸附和B層膜的吸附等步驟。本發(fā)明用層層自組裝技術(shù)將過氧化物酶固定化到納米磁鐵顆粒的表面，不僅具有固定酶量多，且酶活力保留量較大；本發(fā)明制得的固定化過氧化物酶活性高，有很高的穩(wěn)定性，可以回收循環(huán)利用，可以用于含苯酚苯胺廢水的無害化處理。
文檔編號C12N11/10GK101818139SQ201010152690
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者宦志榮, 王欣, 趙曉聯(lián), 陸雋鶴 申請人:無錫市金坤生物工程有限公司