專利名稱:一種體外測定生物鐘節(jié)律的新方法
技術領域:
本發(fā)明涉及藥物的開發(fā)以及時鐘生物學的基礎和應用研究。具體地說,本發(fā)明建立了一種新的體外快速測定生物鐘節(jié)律的方法,能廣泛用于生物鐘的基礎和應用研究及藥物篩選。
背景技術:
生物節(jié)律(circadian rhythm)是以大約M小時為周期的內在生理節(jié)律,它調節(jié)我們的許多代謝、生理活動和行為。很多證據(jù)表明,生物節(jié)律的失調和紊亂會對人的健康產(chǎn)生很大的負面效應,包括時差反應、倒夜班引起的疲勞綜合癥、睡眠失調等。此外,很多嚴重威脅人類健康的疾病,比如心腦血管疾病和腫瘤也都與生物節(jié)律的紊亂有關。然而,隨著現(xiàn)代文明的普及,越來越多的人背離了日出而作,日落而息的生活方式,從而生物節(jié)律的失調也越來越普遍。因此,迫切需要開發(fā)能夠改善生物節(jié)律的藥物。目前生物節(jié)律的測定主要通過小鼠的跑輪實驗,周期長,成本高,不適應大規(guī)模藥物篩選的要求。因此建立一種新的快速測定生物節(jié)律的方法很有意義。
發(fā)明內容
發(fā)明目的本發(fā)明希望利用現(xiàn)代細胞生物學技術,建立一套可以體外快速測定細胞生物節(jié)律的方法,既能用于生物鐘的基礎研究,又可以為將來大規(guī)模篩選生物鐘調節(jié)藥物打下基礎。發(fā)明概述本發(fā)明建立了一種在細胞上快速測定生物節(jié)律的方法,其特征在于利用rPerl細胞系,待細胞長滿5天后,以50%的馬血清處理兩小時來達到細胞節(jié)律的同步化,然后加入熒光素酶底物Luciferin,置Lumicycle儀器中實時測定熒光的強度,從而確定細胞的生物節(jié)律。
圖1為利用利用該方法測定細胞生物節(jié)律的代表性結果。
具體實施例方式1.生物節(jié)律體外測定方法的建立1)篩選用細胞系的選擇我們選擇了表達rPerl細胞作為篩選用細胞系,該細胞系源自Rat-I細胞,且其中整合了熒光素酶基因,熒光素酶基因的表達受核心生物鐘基因 Perl控制。2)細胞同步化方法在35mm培養(yǎng)皿中接種約3xl05rPerl細胞,于37°C、5% C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為D2902 (Gibco)添加5%胎牛血清(GIBCO),50單位/mL青霉素,50 單位/mL鏈霉素,IOmM HEPES,以及0. 35g/L碳酸氫鈉,3. 5g/L葡萄糖。待細胞完全長滿后,繼續(xù)培養(yǎng)5天,以達到細胞周期的同步化。然后,細胞用50%馬血清刺激2個小時,達到細胞節(jié)律的同步化。3)細胞生物節(jié)律的測定細胞同步化后,加入2. OmL新鮮的擬902培養(yǎng)基,并補加Luciferin至終濃度為30ug/ml。接著去掉培養(yǎng)皿蓋,用封口膜密封,將培養(yǎng)皿轉移到Lumicycle儀器 (Actimetrics)中,連續(xù)5天進行生物節(jié)律的測量。其中一次代表性的測量結果見圖1。
權利要求
1. 一種新的體外測定生物鐘節(jié)律的方法,其特征在于利用Perl基因的啟動子控制熒光素酶基因在Rat-I細胞系中節(jié)律性的表達,待細胞長滿5天后,以50%的馬血清處理兩小時來達到細胞節(jié)律的同步化,然后加入熒光素酶底物Luciferin,置Lumicycle儀器中實時測定熒光的強度,從而確定生物節(jié)律。
全文摘要
本發(fā)明建立了一種在細胞上快速測定生物鐘節(jié)律的方法,其特征在于利用rPer1細胞系,以熒光素酶的活性作為測量指標,用50%的馬血清處理來使細胞同步化,然后利用Lumicycle實時記錄熒光的強度,從而確定細胞的節(jié)律周期。該方法在生物鐘的基礎及應用研究以及生物鐘調節(jié)藥物的篩選上具有廣泛應用前景。
文檔編號C12Q1/66GK102234680SQ20101015299
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月22日 優(yōu)先權日2010年4月22日
發(fā)明者吳曦, 徐瓔, 谷習文 申請人:南京大學