專利名稱：一種長效胰高血糖素樣肽-2及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種由人血清白蛋白和胰高血糖素樣肽-2組成的融合蛋白及其制備 與應用。
背景技術：
胰高血糖素樣肽-2(GLP_2)是由33個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量約為 3.9KD。與胰高血糖素之間存在約50%的氨基酸序列同源性。GLP-2存在3種形式，即有 活性的GLP-21 33、無活性的GLP-23 33和未處理的主要胰高血糖素原片段(MPGF)。其在 循環(huán)血液和組織中以完整的有活性的GLP-21 33形式為主，但GLP-21 33可被二肽基肽酶 IV(dipeptidylpeptidase IV, DPP IV)從氨基端第2位的丙氨酸(Ala2)殘基處切除掉2個 氨基酸殘基而產生31個氨基酸殘基組成的無活性的GLP-23 33。GLP-2目前已成為一種倍受 推崇的腸道保護激素，被廣泛應用于各種原因引起的腸道損傷修復及代償的研究中。它在 腫瘤放化療、嚴重創(chuàng)(燒)傷、全腸外營養(yǎng)、炎癥性腸病等因素引起的腸粘膜損傷、失血性休 克、廣泛腸切除、小腸移植等方面均具有潛在的臨床應用價值。目前，美國NPS制藥公司開 發(fā)的可以抵抗DPP IV降解作用的GLP-2的突變體h[Gly2]GLP-2(商品名為teduglutide) 已進入用于短腸綜合征(SBS)和Corhn’ s腸炎治療的臨床研究。然而在血液循環(huán)中， GLP-21 33和GLP-23 33的生物半衰期都較短，在人體分別約為7min和27min，使得在治療 過程中頻繁給藥才能獲得良好的療效，并且其治療周期往往較長，因此研制出作用時間長 的重組胰高血糖素樣肽_2具有重要意義。人血清白蛋白(Human serum albmin, HSA)是含585個氨基酸的非糖基化單鏈結 構分子(A. Dugaiczyk et al.，PNAS，198279 :71_75)，是人體血清中的主要成分，廣泛分布 于血管內外，主要由人體肝臟產生，其對維持體內滲透壓和血漿體積起著至關重要的作用， 腎清除率非常低，體內半衰期長，為14 20d。而且它沒有酶或免疫活性，是體內因子和藥 物轉運的天然載體，因此可望作為提高小分子蛋白在血液中的半衰期的載體。相關研究成 果表明，很多蛋白藥物與人血清白蛋白融合表達后，與先前的蛋白藥物相比，藥效相似，但 體內半衰期大大延長。胰高血糖素樣肽_2在預防和治療化療中導致腸胃損傷、短腸綜合癥 SBS、C0rhn’ s腸炎等疾病過程中，醫(yī)療周期往往很長，長周期的頻繁用藥會增加病人的痛苦 和毒副作用。且本發(fā)明融合蛋白在酵母菌中表達與現有胰高血糖素樣肽_2相比，具有生產 成本低、效率高、易于純化等優(yōu)點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種集胰高血糖素樣肽_2和血清白蛋白的特性為一體的胰 高血糖素樣肽-2-人血清白蛋白融合蛋白及編碼基因。與現有胰高血糖素樣肽_2相比， 本發(fā)明的融合蛋白具有以下優(yōu)點1)能夠在酵母菌中實現胞外表達，產量高，無需復性，易 純化。2)重組融合蛋白在體內的半衰期延長，且作用效果明顯，能減少現有胰高血糖素樣 肽-2潛在的毒副作用，發(fā)揮最大的治療作用。3)重組表達生產成本較低、效率高，利于工業(yè)大量生產。本發(fā)明所提供的長效融合蛋白名稱為h[Gly2]GLP-2_HSA融合蛋白，以下簡稱GLH
融合蛋白。本發(fā)明的GLH融合蛋白，包括與序列表中SEQ ID No :2胰高血糖素樣肽_2氨基 酸序列相同的第二區(qū)和與序列表中SEQ ID No :1人血清白蛋白氨基酸序列相同的第一區(qū)。 在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或添加得 到的蛋白，但這些改變不能明顯改變蛋白質的一個或多個有用的配體結合和生物活性的能 力。特別是，將人血清白蛋白和人血清白蛋白片段中天然發(fā)生的多態(tài)性變體包括在內，融合 蛋白中白蛋白可來自任何脊椎動物，特別是任何哺乳動物，如牛、羊、豬、雞或鮭魚。此外， 胰高血糖素樣肽-2可以由生物體中提取，也可以通過生物技術工程的方法獲得。可以通過對本發(fā)明的GLH融合蛋白中個別氨基酸殘基進行取代、缺失或插入，得 到與正常胰高血糖素樣肽_2或血清白蛋白具有至少85 %的序列同源性的變體。相對于 正常的血清白蛋白，血清白蛋白變體應至少包含或是有血清白蛋白的一個完整的結構域組 成。相對于正常的胰高血糖素樣肽_2，胰高血糖素樣肽_2的突變體具有與胰高血糖素樣 肽_2相同的活性，包含本領域內所周知的胰高血糖素樣肽_2所有突變體。當用本領域公認的軟件與其他任何具有類似的DNA序列對比分析時，某一特定的 序列如與本發(fā)明所提出的序列有85%以上的序列同源性，均認為與本發(fā)明長效融合蛋白所 述的序列相同源。為了使融合蛋白兩部分間有較大的間隔，使胰高血糖素樣肽_2的部分最大的與 其受體結合，在所述的第一區(qū)與第二區(qū)之間設有連接肽。眾所周知連接肽不改變融合蛋白 的生物活性，所述連接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n為0-10的整數，更優(yōu)選的是3，通 式描述為胰高血糖素樣肽-2-連接肽_血清白蛋白。本發(fā)明的另一個目的是提供編碼本發(fā)明GLH融合蛋白的氨基酸序列和基因序列。 包括與序列表中SEQ ID No :2胰高血糖素樣肽-2氨基酸序列相同的第二區(qū)和與序列表中 SEQ IDNo 1血清白蛋白氨基酸序列相同第一區(qū)的融合蛋白氨基酸序列和基因序列。本發(fā)明的又一個目的是提供攜帶編碼本發(fā)明GLH融合蛋白基因序列的重組表達 載體。重組表達載體包括PPIC9質粒，pPIC3質粒，pPIC9K質粒等。本發(fā)明的再一目的是提供一種表達上述GLH融合蛋白的方法。所提供的表達上述 GLH融合蛋白方法，是將含有上述GLH融合蛋白編碼基因的重組表達載體導入宿主細胞，表 達得到長效融合蛋白。所述的宿主可為酵母菌，大腸桿菌等，優(yōu)選為酵母菌，酵母菌更優(yōu)選巴氏畢赤酵母 (Pichipastoris)，其中，所述的巴氏畢赤酵母優(yōu)選巴氏畢赤酵母GS115。本發(fā)明的GLH融合蛋白，編碼胰高血糖素樣肽_2和血清白蛋白的DNA序列可以用 PCR，RT-PCR方法、人工合成的方法、構建篩選cDNA文庫等本領域所周知的方法獲得。其中 上述方法所采用的mRNA或cDNA可以來源于任何含有相應mRNA或cDNA的組織(細胞)和 文庫等?？梢杂肞CR等方法，在編碼序列的兩側引入限制性內切酶識別位點，進行編碼白蛋 白和編碼胰高血糖素樣肽-2的融合，通過酶切產生粘性末端用DNA連接酶連接后從而獲得 編碼融合蛋白的基因。本發(fā)明的GLH融合蛋白的表達載體和其對應的宿主可以是，酵母表達載體如PPIC9質粒，pPIC3質粒，pPIC9K質粒，pPICZ質粒等，動物細胞表達載體Psvk3質粒，pMSG 質粒等。其中優(yōu)選的質粒為帶有His4選擇性標記的酵母整合型質粒，如pPIC9質粒，pPIC9K 質粒等，通過編碼本發(fā)明的新型的長效融合蛋白的基因克隆到這些酵母表達載體中。本發(fā)明GLH融合蛋白的表達宿主可以是酵母，細菌，動物細胞或植物細胞以及包 含本發(fā)明融合蛋白基因序列的轉基因動植物等。融合蛋白或多肽的表達可以是胞內，也可 以分泌表達到宿主胞外的培養(yǎng)基中。優(yōu)選的表達方式是分泌至培養(yǎng)液中，形成可溶性蛋白。 其中，含血清白蛋白的融合蛋白可以有信號肽主導并通過分泌表達途徑而得到加工。分泌 所用的信號肽，優(yōu)選的是天然人血清白蛋白的信號肽或釀酒酵母配對因子a或這兩種信 號肽的類似物。更優(yōu)選天然人血清白蛋白的信號肽。融合蛋白也可以不用信號肽，而以胞 內可溶形式表達。編碼融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色體，或游離質粒形式存在。宿主細胞可以利用周知的方法經遺傳工程(轉導、轉化或轉染)將攜帶本發(fā)明融 合蛋白基因序列的質粒載體以入侵方式、病毒感染、噬菌體等形式轉入宿主中表達。其中轉 化融合蛋白核苷酸序列至宿主細胞中可用周知的方法，如電穿孔，制備感受態(tài)的原生質體， 化學轉化等。成功轉化并含有本發(fā)明融合蛋白基因序列構建體的細胞，可通過常用的方法 進行鑒定，如提取DNA，然后PCR方法鑒定?；蛘呤占毎扑橐夯虬馀囵B(yǎng)液中的蛋白，用 抗白蛋白抗體進行ELISA檢測鑒定。本發(fā)明的GLH融合蛋白的生產，可以通過培養(yǎng)含有本發(fā)明基因序列構建體的宿主 菌體，如重組酵母，細菌，動、植物細胞，轉基因動植物等獲得。宿主細胞(或細胞)的培養(yǎng) 可以是所周知的方法，如搖瓶或生物反應器等。本發(fā)明的GLH融合蛋白的純化處理，其中包括鹽析、沉淀、超濾、液相層析等技術 及這些技術的組合。其中液相層析可以用分子篩、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術。本發(fā)明將人血清白蛋白和胰高血糖素樣肽_2融合所形成的融合蛋白既保留了與 胰高血糖素樣肽-2受體結合的活性，同時與胰高血糖素樣肽_2相比，其體內半衰期得到了 顯著延長，降低了給藥頻率和劑量，是一種長效候選藥物。本發(fā)明中的GLH融合蛋白可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其不 同形式的鹽、修飾產物等，如在多肽的氨基、羧基、羥基、巰基上再進行修飾。本發(fā)明中的GLH融合蛋白及其衍生物可單獨使用，也可以加入一種或多種藥學上 可以接受的載體一起組成藥物制劑的形式使用。所述的載體包括藥學領域常規(guī)的典型載體 為水、鹽水、糖類、醇類、氨基酸等。本發(fā)明的GLH融合蛋白可以制成注射劑。該劑型的藥物可以按照藥學領域的常規(guī) 方法制備。藥物制劑可以存在于單一劑量或多劑量的容器中，如密封的安瓶，西林瓶或小管 中。凍干制劑是將液體制劑冷凍干燥制備的，使用前加入無菌、無熱原的液態(tài)載體，如注射 用水。本發(fā)明中的GLH融合蛋白及其衍生物或其藥物組合物，作為腸道保護激素可用于 各種原因引起的腸道損傷修復及代償疾病，如腫瘤放化療、嚴重創(chuàng)(燒)傷、全腸外營養(yǎng)、炎 癥性腸病等因素引起的腸粘膜損傷、失血性休克、廣泛腸切除、小腸移植等病人的治療。本發(fā)明中的GLH融合蛋白及其衍生物可以通過靜脈注射，皮下注射等方法給藥。 優(yōu)選的方法是靜脈注射給藥。治療包括在一段時間內使用單一劑量或復合劑量。實驗證明本發(fā)明的GLH融合蛋白穩(wěn)定性高，半衰期較長，在醫(yī)學上也有較高的安全性、較好的療效。且該融合蛋白的表達量高，易純化，生產周期短，成本低等優(yōu)點，利于工 業(yè)大量生產，具有重要應用前景和實際意義。下面結合具體實例對本發(fā)明作進一步的說明。


SEQ ID N0:1為人血清白蛋白的基因和氨基酸序列SEQ ID NO 2為胰高血糖素樣肽_2的基因和氨基酸序列圖1是目的基因h [Gly2] GLP-2-HSA通過PCR獲得圖2是重組表達載體pPIC9-GLH質粒的構建圖3重組表達載體pPIC9K-GLH雙酶切驗證圖4是重組表達載體pPIC9K-GLH質粒的構建圖5是GLH融合蛋白分離純化SDS-PAGE圖其中m，marker ；1，發(fā)酵液樣品；2，濃縮樣品；3，Blue-S印harose親和層析后的樣 品；4，Phenyl S印harose 6F.F疏水層析后的樣品；5，DEAE s印harose陰離子交換層析后 的樣品圖6是GLH融合蛋白對小鼠體重改變影響圖7是GLH融合蛋白對小鼠小腸干濕比重影響圖8是GLH融合蛋白對小鼠小腸重量影響圖9是GLH融合蛋白對小鼠小腸長度影響圖10是小鼠腸壁炎癥及絨毛長度影響的病變評分圖11是小鼠空腸組織切片圖其中A，saline組；B，5-FU 模型組；C，GLH 對照組；D，GLH1+5-FU 實驗組；E， GLH2+5-FU 實驗組；F，GLH3+5-FU 實驗組圖12是GLH融合蛋白大鼠單劑量靜脈給藥后的藥時曲線具體的實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1 目的基因h [Gly2] GLP-2-HSA的獲得在本實驗室已構建的帶有HSA基因的質粒pPIC9K-HT的基礎上，利用 SOE-PCR(splicingby overlap extension，簡稱S0E)的方法擴增獲得完整的融合基因 h[Gly2]GLP-2-HSA(以下簡稱GLH)。所獲得的基因片段GLH包含h[Gly2]GLP_2的DNA序 列和編碼連接肽([GlyGlyGlyGlySer]3)及HSA的基因序列。將實驗室保存的含有質粒pPIC9K-HT的大腸桿菌DH5 a接種入含有青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，用堿裂解法提取質粒(方法參見分子克隆實驗指南，第2 版)。以pPIC9K-HT質粒作為模板，進行S0E-PCR，其中每一輪的PCR擴增產物經過電泳 后用DNA凝膠回收試劑盒回收，作為下一輪PCR反應的模板，以獲得完整的目的基因片段 GLH，如圖1。上游引物P5-1: 5，-CGGAGGTTCTGGCGGAGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGGAGTGATGCACACAAGAGTGAGG-3，
上游引物P5-2:5’ -TCATAAACTGGTTGATCCAGACCAAAATCACTGACGGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGG-3’上游引物P5-3:5 ’ -GAGATGAACACCATTCTTGATAATCTTGCCGCCAGGGACTTCATAAACTGGTTGATCC-3’上游引物P5-4:5’ -CCGCTCGAGAAAAGACACGGTGATGGTTCCTTCTCTGATGAGATGAACACCATTCTTG-3’下游引物P3-1:5’ -CAGCGTCTAGAGTGGTTTCATATGTC-3’下游引物P3-2:5 ’ -GGCGAATTCTTACTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’引物委托上海英俊生物公司合成。PCR反應體系(50iU) :5u 1 lOXPfu buffer, 4XdNTPmix(200iimol/L)，引物上(0. 5 ii mol/L)，引物下(0. 5 ii mol/L)，0. ly g模板(HT 重 組質粒)，0. 5 ill Pfu DNA聚合酶(5U/ u 1)，滅菌水補足至50 u 1 (dNTP、反應緩沖液、Pfu DNA聚合酶均為上海申能博彩生物科技有限公司產品)，所有PCR反應程序均為94°C預變 性5分鐘，94 V變性30秒,52 V退火1分鐘，68 V延伸4分鐘，25個循環(huán)，68 V延伸10分鐘。 四輪PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，實驗結果與理論設計一致。實施例2 質粒pPIC9-GLH的構建將本實驗室保存的含有質粒pPIC9的大腸桿菌DH5 a接種入含有青霉素的LB液 體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，用堿裂解法提取質粒pPIC9。根據實施例1獲得的基因片段GLH和本實施例中獲得的質粒pPIC9分別進行雙 酶切后，得到重組PPIC9-GLH質粒的片段。酶切方法基因片段GLH和質粒pPIC9均用 Xhol和EcoRI雙酶切(Xba I、EcoR I均為MBI Fermentas公司產品)，基因片段GLH的 Xba I 和 EcoR I 雙酶切反應體系10 ii 1 10 X Tango buffer，35 ii 1 基因片段 GLH，2. 5 ii 1 Xba I(10U/u 1),2. 5u lEcoR I(10U/u 1) 質粒 pPIC9 的 Xba I 禾口 EcoR I 雙酶切反應體 系10 ill 10 X Tango buffer, 35 u lpPIC9,2. 5 u 1 Xba I(10U/u 1),2. 5u 1 EcoR I (10U/ U 1)。上述酶切體系于37°C反應過夜后，電泳切下相應的片段用DNA凝膠回收試劑盒回收。本實施例中獲得的回收目的片段進行連接構建質粒PPIC9-GLH。酶連方法將 回收片段用T4DNA連接酶來連接(T4DNA連接酶為MBI Fermentas公司產品)，酶連的反 應體系為6iU基因片段GLH的酶切回收片段，2.5iU pPIC9質粒的酶切回收片段，liU T410XBuffer，0. 5iilT4DNA連接酶。上述酶連反應體系于16°C反應過夜。將本實施例中得到的重組質粒pPIC9-GLH，采用氯化鈣法轉化大腸桿菌DH5 a (方 法參見分子克隆實驗指南，第2版)，轉化產物涂布于含有青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜 后挑取板上的單菌落接種入含有青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜后抽提質粒。將 重組質粒送上海博亞生物技術公司測序驗證結果與理論設計結果相一致。重組表達載體pPIC9-GLH質粒的構建過程，如圖2。實施例3 重組pPIC9K-GLH質粒構建及轉化根據實施例2獲得的質粒pPIC9-GLH和質粒pPIC9K分別進行雙酶切后，再酶連得 到重組PPIC9K-GLH質粒。將實施例2獲得的含有質粒PPIC9-GLH和本實驗室保存的pPIC9K的大腸桿菌DH5a分別接入含有青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜后分別抽提質粒。質粒 PPIC9-GLH和pPIC9K分別用BamH I和EcoR I進行雙酶切，得到重組pPIC9K_GLH質粒的 片段。酶切方法pPIC9-GLH和pPIC9K用BamH I和EcoR I進行雙酶切(BamH I、EcoR I 均為MBIFermentas公司產品)，pPIC9_GLH的BamH I和EcoR I雙酶切反應體系10 yl 10 X Tango buffer, 35 u 1 pPIC9-GLH, 3. 3 u 1 BamH I(10U/u 1),1. 7u 1 EcoR I (10U/ yl)。質粒 pPIC9K 的 BamH I 禾口 EcoR I 雙酶切反應體系10 yl 10 X Tango buffer, 35 u 1 pPIC9K,3. 3u 1 BamH I(10U/u 1),1. 7u lEcoR I(10U/u 1) 上述酶切體系于 37°C反應過 夜后，切下相應的片段后用DNA凝膠回收試劑盒回收。本實施例中獲得的回收片段進行連接構建質粒PPIC9K-GLH。酶連方法將回 收片段用T4DNA連接酶來連接(T4DNA連接酶為MBI Fermentas公司產品)，酶連的反 應體系為5iaPPIC9-GLH質粒酶切回收片段，3.5iU pPIC9K質粒酶切回收片段，1 yl T410XBuffer，0. 5iilT4DNA連接酶。上述酶連反應體系于16°C反應過夜。將本實施例中得到的重組質粒pPIC9K-GLH，采用氯化鈣法轉化大腸桿菌DH5 a， 轉化產物涂布于含有青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜后挑取板上的單菌落接種入含有青 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜后抽提質粒，經酶切驗證與理論設計結果相一致， 如圖3。重組表達載體pPIC9K-GLH質粒的構建過程，如圖4。實施例4 畢赤酵母工程菌的構建及工程菌菌株的篩選將實施例3中構建的陽性克隆大腸桿菌PPIC9K-GLH培養(yǎng)擴增，抽提重組質粒。 將獲得的純化質粒用Sal I酶切使其線性化。酶切反應體系42. 5 ill pPIC9K-GLH，5 ill 10XBuffer0,3. 3u 1 Sal I (Sal I酶為MBI Fermentas公司產品)。將酶切反應體系置 于37°C反應過夜后，直接用DNA回收試劑盒回收酶切產物，用于畢赤酵母GS115的轉化 (Invitrogen Corp. USA公司酵母表達試劑盒提供的方法)。轉化后的重組GS115，分別涂 布MD培養(yǎng)基平板(2%瓊脂，1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB, Digco Cotp)，4X 10_5%生物 素，2%葡萄糖)，30°C倒置培養(yǎng)2 5天。挑取his+克隆。用滅過菌的牙簽將每個克隆同 時點種于MM、MD(2%瓊脂，1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB，Digco Cotp)，4X 10_5%生物素， 2%甲醇)平板的對應位置上，30°C倒置培養(yǎng)3 5天，只有在MM平板上和MD平板上同時 生長的菌落大小相差不多的菌株才是Mut+表型。將獲得的his+Mut+轉化子分別點種于 G418 濃度為 0. 25mg/ml、0. 5mg/ml、1. 0mg/ml、2. 0mg/ml 的 G418 平板，30°C培養(yǎng) 3 5 天，挑 選能夠耐受較高濃度G418生長的轉化子。挑取經篩選的單菌落，接種入含50mlYPD(l%酵 母浸出粉，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，30°C，220r/min培養(yǎng)20h至 0D_達10 20。按照的接菌量將上述菌液轉接至BMGY培養(yǎng)基(1. 34%無氨基酸酵母 氮源(YNB，Digco Cotp)，4X10_5%生物素，酵母浸出粉，2%胰蛋白胨，10%磷酸鉀緩沖 液(pH6. 0)，甲醇)重懸菌體，置于30°C，220r/min搖床上繼續(xù)生長，每24小時向BMGY 培養(yǎng)基中添加甲醇至終濃度0. 5%，按時間點分別取菌液樣品，取樣量為0. 5ml，置于EP管 中，離心取上清，SDS-PAGE凝膠電泳分析，篩選出表達量高的菌株，以其作為表達融合蛋白 的目標菌株。實施例5 畢赤酵母工程菌的發(fā)酵從實施例4中獲得的目標菌株的YPD斜面培養(yǎng)基上挑一環(huán)菌至YPD液體培養(yǎng)基(1%酵母浸出粉，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)中，30°C，220r/min培養(yǎng)20h至006(1。達10 20 ；將上述菌液按接菌量轉接至50ml三角燒瓶的BMGY培養(yǎng)基中(1. 34%無氨基酸酵母 氮源(YNB，Digco Cotp)，4X10_5%生物素，酵母浸出粉，2%胰蛋白胨，10%磷酸鉀緩沖 液(pH6. 0)，1 %甲醇)，30°C，220r/min培養(yǎng)12小時，補加甲醇至終濃度0. 5 %，每24小時 向培養(yǎng)基補加一次甲醇，誘導表達4 7天，8000r/min離心收集上清。實施例6 :GLH融合蛋白的分離純化將實施例5中獲得的高表達量的菌株發(fā)酵后，收集發(fā)酵液樣品，經4°C離心 (8000g, lOmin)得上清，上清經超濾濃縮。濃縮樣過Blue_S印harose (Amershan產品)親 和色譜進行分離，上樣緩沖液pH為4. 0-6. 0緩沖液，上樣平衡后用2. 0M的NaCl進行洗脫， 收集含有目的蛋白的洗脫峰；超濾濃縮后用Phenyl S印harose 6F. F (Amershan產品)疏水 填料進行層析分離，上樣緩沖液PH為6. 0-8. 0，平衡后用0-1. 5M的緩沖液進行梯度洗脫， 收集洗脫液；超濾濃縮后用DEAE s印harose (Amershan產品)陰離子交換色譜進行分離， 上樣緩沖液為PH為6. 0-8. 0，上樣平衡后用0-1. 0M的NaCl進行梯度洗脫，收集目的蛋白 的洗脫峰，即可獲得純化的融合蛋白，SDS-PAGE分析呈電泳純?yōu)榫粭l帶。如圖5，其中 m，marker ；1，發(fā)酵液樣品；2，濃縮樣品；3，Blue-Sepharose親和層析后的樣品；4，Phenyl S印harose 6F. F疏水層析后的樣品；5，DEAE s印harose陰離子交換層析后的樣品。實施例7 :GLH融合蛋白對于5-FU導致小鼠腸道損傷(體重減輕、小腸萎縮)的預 防作用癌癥的化療常導致小腸上皮細胞的損傷，而導致胃腸道粘膜炎。小鼠尾靜脈注射 GLH融合蛋白連續(xù)給藥三天，第四天同時腹腔注射5-FU，實驗周期為7天。在最后一次給藥 后24小時禁食處死小鼠。剪開小鼠腹腔，在冰浴中，截取小鼠的小腸、大腸，用生理鹽水沖 洗后，測量其長度并進行稱重。測濕重和干重將腸段直接稱重，之后置于試管中凍干過夜 除水再稱重。組織學分析采用的方法近端空腸(與幽門相距8厘米)，加入10%的福爾馬 林溶液中，浸泡48小時，植入石蠟，切成4-6 u m的橫切片(每只小鼠至少制備10個切片)， 用蘇木紫和伊紅(HE)染色，使用普通光鏡下觀察、照像檢測，觀察腸的病理改變。實驗結 果顯示，實驗組與對照組相比，小鼠體重變化程度小，小腸萎縮減輕，小腸絨毛破壞程度輕， GLH融合蛋白對于化療中造成的腸道損傷有良好的預防和治療作用。本實施例中小鼠分為6組空白對照saline組給生理鹽水，5_FU模型組只給與實 驗組等量的5-FU，GLH組只給予405mmol/kg的GLH融合蛋白，實驗GLH(1，2，3) +5-FU組給予 三個不同劑量(405mmol/kg，135mmol/kg, 46mmol/kg)的GLH融合蛋白，同時給予5-FTOOmg/ kg。融合蛋白GLH對小鼠體重改變影響，如圖6 ；對小鼠小腸干濕比重影響，如圖7 ；對小鼠 小腸重量影響，如圖8 ；對小鼠小腸長度影響，如圖9 ；小鼠腸壁炎癥及絨毛長度影響的病變 評分，如圖10 ；小鼠空腸組織切片，如圖11，其中:A, saline組；B，5_FU模型組；C，GLH對照 組；D，GLH1+5-FU 實驗組；E，GLH2+5-FU 實驗組；F，GLH3+5-FU 實驗組實施例8 融合蛋白GLH在在大鼠體內藥代動力學評價大鼠靜脈注射給予GLH融合蛋白分別于0. 5，1，2，4，6，8，12，36，48，72小時的不同 時間采樣，用碘示蹤法測定血中胰高血糖素樣肽-2的濃度，其中藥-時曲線如圖12，實驗結 果顯示重組GLH融合蛋白與胰高血糖素樣肽相比其半衰期更長。
權利要求
一種長效胰高血糖素樣肽-2融合蛋白，它包括序列表中SEQ ID No1血清白蛋白的第一區(qū)，連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ ID No2序列相同的第二區(qū)。
2.根據權利要求1所述的長效胰高血糖素樣肽_2融合蛋白，其特征是所述的融合蛋 白包括與序列表中SEQ ID No :1血清白蛋白氨基酸序列相同的第一區(qū)，和連接在血清白蛋 白N-末端的與序列表中SEQ ID No 2胰高血糖素樣肽_2氨基酸序列相同的第二區(qū)。
3.根據權利要求1或2所述的融合蛋白，其特征是所述血清白蛋白的第一區(qū)與連接 在血清白蛋白的N-末端的序列表中SEQ ID No :2胰高血糖素樣肽-2氨基酸序列相同的第 二區(qū)之間設有連接肽，連接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n為3。
4.根據權利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征是攜帶編碼融合蛋白基因序列的 重組表達載體是PPIC9或pPIC9K。
5.根據權利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征是表達融合蛋白的宿主是細菌、酵 母、動物細胞、植物細胞或含有本發(fā)明融合蛋白基因序列的轉基因動、植物中的任一種。
6.根據權利要求5所述的融合蛋白，其特征是表達融合蛋白的宿主是畢赤酵母。
7.權利要求1、2或3所述的融合蛋白用于制備一種具有預防和/或治療化療中導致腸 胃損傷、短腸綜合癥SBS、Corhn' s腸炎作用的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長效的人血清白蛋白(HSA)和胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)融合蛋白(簡稱GLH融合蛋白)的制備及其治療用途，包括編碼融合蛋白的基因序列，含有該基因的載體，以及含有所述載體的宿主細胞。本發(fā)明的GLH融合蛋白包括序列表中SEQ ID No1血清白蛋白的第一區(qū)和連接在血清白蛋白N-末端的與序列表中SEQ ID No2序列相同的第二區(qū)。本發(fā)明GLH融合蛋白的第一區(qū)與第二區(qū)之間可以設有連接肽，也可以不設，連接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n為3。經初步的藥理實驗證明，本發(fā)明所述的GLH融合蛋白既有胰高血糖素樣肽-2的特性，其半衰期又得到顯著延長，可用于制備預防和/或治療化療中導致腸胃損傷、短腸綜合癥SBS、Corhn’s腸炎等多種胃腸道損傷疾病藥物的用途。
文檔編號C12N15/63GK101851293SQ201010153879
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權日2010年4月23日
發(fā)明者姜玉濤, 褚寧琳, 邢曉, 陳建華, 陳蕞 申請人:中國藥科大學