專利名稱：一種臘梅胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因及其抗低溫應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬分子生物學與基因工程領域，具體涉及一種臘梅胚胎發(fā)育晚期豐富蛋 白的基因克隆及其應用。
背景技術：
干旱、鹽漬和低溫都能引起植物水分虧缺，在這期間植物細胞積累一系列的蛋 白質(zhì)來保護細胞免受脫水傷害。環(huán)境脅迫除了引起代謝變化和低分子量保護性化合物 的積累外，植物的許多基因可被激活轉(zhuǎn)錄，并導致植物營養(yǎng)組織中新蛋白的積累，特別 是植物干旱、低溫誘導蛋白的研究已受到普遍關注，其中胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundantprotein，LEA)是指胚胎發(fā)育后期種子中大量積累的一系列蛋白 質(zhì)，其具有親水性和熱穩(wěn)定性，廣泛存在于高等植物中，且受發(fā)育階段、脫落酸(ABA) 和脫水信號的調(diào)節(jié)，因此成為當前在逆境研究方面的一個重要課題。LEA蛋白是一類親水性大家族，共同特點是由極性氨基酸組成，為親水性的多 肽，甘氨酸含量>6%，親水指數(shù)>1.0，大多數(shù)LEA蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸殘基。 根據(jù)LEA蛋白氨基酸序列同源性和特定的序列單元，LEA蛋白被分為6組。由于各組 LEA蛋白序列和可能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，每一組LEA蛋白在水分脅迫下有不同的功能。LEA蛋白表達受發(fā)育階段控制，但它們也能在施加外源ABA的離體胚中表達， 許多營養(yǎng)組織在外源ABA、滲透和低溫脅迫的誘導下能產(chǎn)生特異的LEAmRNA和LEA蛋 白。LEA蛋白表達無組織特異性，可以在轉(zhuǎn)錄水平上被ABA、高滲透濃度和水分脅迫所 誘導。植物在受到干旱脅迫時，LEA基因的高水平表達和LEA蛋白的大量積累，表明 LEA具有干旱保護功能。種子在自然成熟過程中發(fā)生自燃的干化作用，LEA蛋白的作用 是保護種子細胞免受由干化引起的傷害，并且在部分種類耐受寒冷凍的生理作用中具有 重要意義。LEA蛋白最顯著的物理化學特性是具有很高的親水性和熱穩(wěn)定性，即使在煮沸 條件下也能保持水溶狀態(tài)，同時可能形成一種離子載體為那些即將干化失水的組織細胞 中的離子凝結(jié)/結(jié)晶作好準備。在干旱脫水過程中細胞液的離子濃度會迅速升高，高強 度的離子濃度會造成細胞的不可逆?zhèn)?。?組LEA蛋白中的11個氨基酸殘基組成的 基元序列可形成兼性a2螺旋結(jié)構(gòu)，提供一個具疏水條區(qū)的親水表面，螺旋的疏水面可形 成同型二聚體，處在親水表面的帶電基團可鰲合細胞脫水過程中濃縮的離子，如Na+和 P03+。此外，組成該蛋白的大多數(shù)氨基酸殘基為堿性、親水性氨基酸，無半胱氨酸和色 氨酸，這些高電荷的氨基酸殘基可以重新定向細胞內(nèi)的水分子，束縛鹽離子，從而避免 干旱脅迫時細胞內(nèi)高濃度離子的累積所引起的損傷，同時也可防止組織過度脫水。目 前，在多種植物中都有關于第3組LEA蛋白或基因的研究報道，這些基因的表達或蛋白 累積與植物的滲透脅迫抗性呈正相關。萌芽3天的大麥幼苗經(jīng)ABA或干旱處理后，幼苗 的所有器官中均有高水平的HVAl mRNA和蛋白質(zhì)出現(xiàn)，它可被干旱等環(huán)境脅迫和ABA 誘導表達。Xu等將HVAl cDNA全序列導入水稻，獲得了抗旱、抗鹽的轉(zhuǎn)基因水稻，從而直接證實了第3組LEA基因可能具有干旱保護功能。LEA廣泛存在于高等植物種子中，首先是在棉花中被發(fā)現(xiàn)，后來相繼在大麥、 胡蘿卜、小麥、大豆、番茄和向日葵植物中檢測到此類蛋白。在眾多的研究中，并沒有看到在多抗植物臘梅中有關LEA的相關報道，而臘梅Chimonanthus praecox作為一種具有多抗特性的物種，對外界環(huán)境的適應能力比較
強，并且臘梅耐旱、耐寒、病蟲害較少，在臘梅中一定存在多抗基因。發(fā)明人利用本實 驗室構(gòu)建的臘梅花ESTs序列，從臘梅花cDNA文庫中克隆了胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因 (CpLEA3)。構(gòu)建了臘梅LEA基因的表達載體，使表達菌株表達該基因的編碼蛋白，通 過低溫脅迫后測菌落生物活性以及細胞膜通透性損傷情況，發(fā)現(xiàn)CpLEA3基因能提高菌 株的抗低溫能力，因而本發(fā)明具有創(chuàng)新性。

發(fā)明內(nèi)容
(1)提供一種DNA序列，其編碼一種臘梅胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因，命 名為CpLEA3; (2)提供一種利用基因工程方法得到CpLEA3編碼的蛋白；(3)提供 CpLEA3在菌株抗低溫基因工程方面的應用。本發(fā)明提供了 CpLEA3基因，它具有如序列表中SEQ IDNO : 1所示的核苷酸序 列。從臘梅花冠cDNA文庫中，利用PCR方法篩選克隆出CpLEA3基因利用 RNAiso Reagent (購自大連Takara公司)提取臘梅花冠總RNA，按照SMARTTM cDNA Library Construction Kit合成臘梅花冠cDNA文庫，隨機挑取1000個文庫克隆測序和生物
信息學分析，獲得臘梅花ESTs序列。從臘梅花ESTs序列中，發(fā)現(xiàn)編碼CpLEA3的cDNA 序列，根據(jù)此序列設計上下游引物，并以臘梅花cDNA文庫為模板進行PCR擴增，克隆 出CpLEA3的全長基因。CpLEA3的基因由288個堿基組成，含有一個完整的開放閱讀框架，為序列表中 的SEQ IDNO 1序列。開放讀碼框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。本發(fā)明還提供了由CpLEA3基因序列編碼的蛋白，其具有序列表中SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列，是含有95個氨基酸殘基，其理論分子量大小為 10.4129kDa,預測等電點為9.98。根據(jù)軟件分析，CpLEA3蛋白前41個左右氨基酸為葉 綠體運輸肽，從第4個到第25個氨基酸為跨膜結(jié)構(gòu)域，該蛋白為穩(wěn)定蛋白。重組原核表達載體含有CpLEA3基因，重組原核表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞為大 腸桿菌。如實施例二所述，還可利用基因工程的方法，在高效大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達 出具有生物活性的CpLEA3蛋白。關于在菌株抗低溫基因工程方面的應用CpLEA3基因在菌株抗低溫基因工程方面的應用，包括低溫脅迫陽性克隆菌株和 空載菌株后觀察菌株生物活性以及陽性克隆菌株和空載菌株細胞膜通透性。通過低溫脅 迫，陽性克隆菌株存活率比空載菌株高約20%。通過電導率測定，陽性克隆菌株細胞膜 損傷程度僅為空載菌株的55%，陽性克隆菌株細胞膜遭到破壞的程度比空載菌株小，說 明CpLEA3基因能提高菌株的抗低溫能力。
本發(fā)明的有益效果在于提供了一種臘梅胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因(CpLEA3) 及蛋白，構(gòu)建了原核表達載體，并將驗證正確的原核表達載體轉(zhuǎn)入BL21表達菌株中誘導 表達，通過低溫脅迫后測菌落生物活性及菌株細胞膜通透性，分析CpLEA3基因可提高 菌株抗低溫的能力。


圖1為以臘梅花冠cDNA為模板，PCR擴增電泳圖其中M:marker 自上到下大小為1500bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp、 IOObpl、2 目的條帶圖2為CpLEA3原核表達載體的構(gòu)建過程示意圖
圖3為SDS-PAGE原核表達全蛋白電泳圖其中M:Marker 從上至下為 97、66、43、31(kDa)1、2 含有重組克隆質(zhì)粒pET-32a::CpLEA3的BL21宿主菌全蛋白CK 含有空載體質(zhì)粒pET_32a的BL21宿主菌全蛋白圖4為低溫脅迫后菌株細胞活力平板菌落示意圖其中pET32a 空載菌株；pET32a_CpLEA3 轉(zhuǎn)基因陽性克隆菌株CK pET32a 和 pET32a_CpLEA3 未做低溫脅迫處理24h pET32a 和 pET32a_CpLEA3 在-20°C 脅迫處理 24h48h pET32a 和 pET32a_CpLEA3 在-20°C 脅迫處理 48h72h pET32a 和 pET32a_CpLEA3 在-20°C 脅迫處理 72h圖5為低溫脅迫后菌株細胞活力曲線6為-20°C低溫脅迫60min后菌株細胞膜通透性的差異示意圖其中pET32a 空載菌株；pET32a_CpLEA3 轉(zhuǎn)基因陽性克隆菌株
具體實施例方式實施例一克隆CpLEA3基因1.提取 RNA:取500mg臘梅花冠用RNAiso Reagent提取臘梅花總RNA。2.構(gòu)建 cDNA 文庫取總RNA，按照 SMARTTM cDNA Library Construction Kit 合成臘梅花 cDNA 文 庫，隨機挑取1000個文庫克隆測序和生物信息學分析，獲得臘梅花ESTs序列。3.CpLEA3基因片段的克隆根據(jù)臘梅花ESTs序列中找出的編碼CpLEA3的cDNA序列，設計上下游引物， 并以臘梅花cDNA文庫為模板進行PCR擴增。特異性引物如下CpLEA3-Pl 5' -CGGGATCCATGGCTCGCTCTCTGTTG-3，，斜體堿基為 BamH I酶切位點；CpLEA3-P2 5，-CGAGCTCGTGGTTACGGAATTTCTGGG-3，，斜體堿基為 SacI酶切位點。
克隆PCR反應條件為94°C預變性3min ； 94°C變性50sec ； 54°C退火30sec ； 72°C延伸lmin，30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在 288bp位置上有一特異性的條帶(圖1)。按常規(guī)方法將片段克隆到pMD18-T Vector (購 自大連Takara公司)中，并經(jīng)上海生物工程公司進行測序。CpLEA3基因的序列分析經(jīng)測序該基因cDNA序列開放閱讀框包含288bp，含有一個完整的開放閱讀框 架，為序列表中的SEQ IDNO 1序列。編碼95個氨基酸，具有序列表中SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列，分子量大小為10.41299kDa，預測等電點為9.98，結(jié)果表明獲得 了全長基因的cDNA序列。利用 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Stracture/cdd/wrpsb.cgi)對該基因編碼
的氨基酸進行保守區(qū)域分析，結(jié)果表明該蛋白屬胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(LEA)。對 CpLEA3基因編碼的氨基酸序列進行BLAST，顯示的幾乎都為LEA3家族，與已確定功能 的其他物種氨基酸序列進行進化分析和同源性分析CpLEA3與柑橘LEA基因編碼的氨
基酸進化距離最近。利用SOPMA對CpLEA3進行二級結(jié)構(gòu)預測，發(fā)現(xiàn)含有61.11 %的α螺旋(h)， 6.32%的延伸鏈(e)，31.58%的隨機卷曲(c)。用TMpred軟件對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析， 預測該基因從第4個到第25個氨基酸為跨膜結(jié)構(gòu)域。根據(jù)CHLOROP軟件分析CpLEA3 前41個左右氨基酸為葉綠體運輸肽，是穩(wěn)定蛋白。實施例二 CpLEA3在菌株中的高效表達1.原核表達載體的構(gòu)建為了表明CpLEA3基因的編碼功能，將CpLEA3基因連接到pET_32a(+)的Sac I和BamH I位點之間，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得高效表達。設計并合成一對特異性引物5，-CGGGATCCATGGCTCGCTCTCTGTTG-3，，斜體堿基為 BamH I 酶切位 占.5，-CGAGCTCGTGGTTACGGAATTTCTGGG-3‘，斜體堿基為 Sac I 酶切位
點ο按分子克隆常規(guī)實驗程序，用PCR的方法擴增出兩端帶有特定酶切位點的基 因編碼序列，將基因和載體pMDIS-T(購于上海鼎國生物公司)連接，驗證正確。取 pMD18::CpLEA3質(zhì)粒和pET_32a(+)質(zhì)粒(購于上海鼎國生物公司)分別用BamHI、Sac I雙酶切、再連接(構(gòu)建過程見圖2)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株(購于凱基生 物公司)中，并用含lOOug/ml Amp的LB培養(yǎng)基篩選重組子。經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定和PCR鑒 定后，將連接正確的重組子進行測序，證明插入載體的DNA序列的閱讀框架是正確的。 將構(gòu)建成帶有CpLEA3基因的表達載體，命名pET-32a::CpLEA3，用于誘導表達分析。2.原核表達將含有pET-32a::CpLEA3重組子的菌株，接種于LB培養(yǎng)基(1L 蛋白胨10g， 酵母提取物5g，NaCLlO克)，37°C培養(yǎng)至菌液OD6tltl = 0.4-0.6。將BL21重組表達菌 株研磨及超聲破碎，我們得到了含有重組克隆質(zhì)粒pET-32a::CpLEA3的BL21宿主菌粗酶 液。進行12% SDS-PAGE電泳檢測，從圖3中可以看出，CpLEA3基因在BL21菌株中高效表達。實施例三低溫脅迫后菌株細胞活力測定分別取陽性克隆和轉(zhuǎn)空載體菌株的單菌落于5mL含100 μ g/mLAmp的LB液體 培養(yǎng)基中，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.5，加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼 續(xù)培養(yǎng)3h。分別分成2份，第1份稀釋10000倍后涂于含100 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng) 基上，在37°C培養(yǎng)過夜；第2份分別吸取ImL在-20°C進行24h、48h和72h低溫脅迫處 理，處理后分別稀釋10000倍后涂于含100 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜。 分別在次日統(tǒng)計菌落數(shù)(如圖4)，以脅迫后生長的菌落數(shù)與未脅迫對照組比值來計算存 活率(如圖5)。存活率=(脅迫后生長的菌落數(shù)/未脅迫對照組生長的菌落數(shù))X 100%結(jié)果表明低溫脅迫下陽性克隆菌株存活率明顯高于空載菌株，24h后陽性克 隆菌株存活率比空載菌株高21.19%，48h后陽性克隆菌株存活率比空載菌株高19.61%， 72h后陽性克隆菌株存活率比空載菌株高20.02%，說明CpLEA3基因能提高菌株的抗低 溫能力。實施例四低溫脅迫后菌株細胞膜通透性測定采用電導率法測定，分別挑取陽性克隆和轉(zhuǎn)空載體菌株的單菌落于5mL含 100 μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.5，加入 IPTG至終濃度lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3h。將誘導表達的陽性克隆和轉(zhuǎn)空載體的菌體用去 離子水懸浮至l*109du/mL，分別將其在_20°C下處理60min后，取IOml菌體懸浮液離心 (4000g, IOmin),上清液用于測定電導率Α。菌體再用IOml去離子水懸浮，置于100°C 下煮15min后，離心(4000g，IOmin)，上清液用于測定電導率B。相對電導率=(電導率A/電導率A+電導率B) X 100%結(jié)果表明(如圖6)低溫脅迫下陽性克隆菌株電導率僅為空載菌株的55%，說 明轉(zhuǎn)CpLEA3基因陽性克隆菌株細胞膜遭到破壞的程度明顯小于空載菌株，該基因可以 提高菌株的抗低溫能力。
權利要求
1.一種臘梅胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因，其特征在于它具有序列表中SEQID NO 1所示的核苷酸序列。
2.—種臘梅胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白，其特征在于它是由權利要求1所述的一種臘梅胚 胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因序列編碼、具有序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
3.—種重組原核表達載體，其特征在于含有如權利要求1所述的一種臘梅胚胎發(fā)育晚 期豐富蛋白的基因。
4.一種用權利要求3的重組原核表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞為大腸桿菌。
5.權利要求1所述的一種臘梅胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因，在菌株抗低溫基因工程 方面的應用。
全文摘要
一種臘梅胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因及其抗低溫應用屬分子生物學與基因工程領域，本發(fā)明提供了一種臘梅胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因和蛋白，同時提供了基因相應的表達載體和宿主細胞，本發(fā)明的有益效果在于一種臘梅胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白的基因的應用，能提高菌株的抗低溫能力。
文檔編號C12N15/70GK102010869SQ201010155358
公開日2011年4月13日 申請日期2010年4月26日 優(yōu)先權日2010年4月26日
發(fā)明者劉金亮, 張世宏, 張莉弘, 謝麗霞, 陽曉紅, 陳宣明, 高文 申請人:吉林大學