專(zhuān)利名稱(chēng)：植物中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是植物中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件，具 體要求涉及茄科作物中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的啟動(dòng)子保守區(qū)域中的兩個(gè) 重要順式調(diào)控元件及其啟動(dòng)子序列序列，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磷(P)是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，廣泛參與植物體內(nèi)的生化合 成、能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝過(guò)程。磷在土壤中主要以無(wú)機(jī)磷酸鹽(Pi)的形態(tài)被植物吸 收利用。由于磷在土壤中容易被固定，使其成為世界范圍內(nèi)有效性最差的營(yíng)養(yǎng)元素之一 (Raghothama，1999)。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化中已形成對(duì)磷缺乏的適應(yīng)機(jī)制，其中很廣譜且重 要的機(jī)制之一便是與土壤中的菌根(Mycorrhiza)真菌形成共生體系(Harrison，2006)。 植物通過(guò)在根系細(xì)胞膜上表達(dá)多種不同親和力的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)土壤中的有效 磷。迄今為止，大多數(shù)被分離和鑒定的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都屬于高親和的Phtl家族。茄科作物 (Solanaceous species)是僅次于禾本科和豆科作物的世界第三大經(jīng)濟(jì)作物。在部分茄科 作物中已經(jīng)相繼克隆到了 5個(gè)Phtl家族的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，其中3個(gè)(Phtl ； 3-Phtl ；5)都 與菌根信號(hào)有關(guān)(Chen et al.，2007 ；Xu et al.，2007)。研究它們的功能特別是表達(dá)調(diào)控 模式對(duì)于提高作物對(duì)土壤中有限的有效磷資源的吸收能力及利用效率有著不可估量的意 義。雖然茄科作物中Phtl ；3-Phtl ；5基因的表達(dá)模式十分確定，而對(duì)于它們的受菌根 信號(hào)的調(diào)控方式及其上游轉(zhuǎn)錄因子還知之甚少。本發(fā)明從茄子和煙草中分離到了 Phtl ； 3-Phtl ；5基因的啟動(dòng)子，并確定了其保守區(qū)域中能介導(dǎo)其菌根誘導(dǎo)表達(dá)模式的兩個(gè)順式 調(diào)控元件P1BS和MYCS，提出了利用P1BS和MYCS克隆菌根信號(hào)途徑中的轉(zhuǎn)錄因子繼而通過(guò) 其提高作物吸收、利用磷素營(yíng)養(yǎng)能力的遺傳改良方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于公開(kāi)茄科作物中Phtl ；3-Phtl ；5基因的啟動(dòng)子保守區(qū)域中的 兩個(gè)順式調(diào)控元件及其啟動(dòng)子序列，這兩個(gè)順式調(diào)控元件可作為酵母單雜交系統(tǒng)(Yeast one-hybrid system)中的誘餌(bait)，克隆到菌根信號(hào)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子并繼而導(dǎo)入 植物，提高植物的磷素吸收利用能力，以進(jìn)行植物品種改良。技術(shù)方案本發(fā)明是植物中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件包 括MYCS和P1BS，其特征序列如下MYCS :TKTCTTGTT
P1BS :GNATATNC其中K= G 或 T ;N = A 或 G 或 C 或 T。含有上述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SmPT3的 啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 1。含有上述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtPT3的 啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 2。含有上述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SmPT4的 啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 3。含有上述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtPT4的 啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 4。含有上述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SmPT5的 啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 5。含有上述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtPT5的 啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 6。兩個(gè)對(duì)Phtl基因的菌根誘導(dǎo)表達(dá)模式起不可或缺作用的順式調(diào)控元件MYCS和 P1BS存在于上述啟動(dòng)子序列中靠近ATG 200bp內(nèi)為保守區(qū)域。有益效果1、本發(fā)明公開(kāi)了茄科作物中Phtl ；3-Phtl ；5基因的啟動(dòng)子及其保守區(qū)域中的 兩個(gè)順式調(diào)控元件，這兩個(gè)順式調(diào)控元件可作為酵母單雜交系統(tǒng)(Yeast one-hybrid system)中的誘餌(bait)克隆到菌根信號(hào)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子并繼而倒入植物，提高植 物的磷素吸收利用能力，以進(jìn)行植物品種改良。2、本發(fā)明人提供的MYCS和P1BS兩個(gè)順式調(diào)控元件參與植物對(duì)菌根信號(hào)的應(yīng)答反 應(yīng)，啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因表達(dá)分析表明MYCS和P1BS在缺磷且菌根真菌根內(nèi)球囊霉菌 (Glomus intraradices)侵染的條件下對(duì)Phtl ；3-Phtl ；5的菌根誘導(dǎo)表達(dá)模式不可或缺。3、本發(fā)明的MYCS和P1BS順式調(diào)控元件來(lái)自茄科作物茄子和煙草，其在其它茄科 作物(番茄、土豆、辣椒等)，甚至是遠(yuǎn)緣物種(如豆科植物苜蓿)的Phtl基因的啟動(dòng)子中 也有分布，證明其可應(yīng)用的廣譜性。
具體實(shí)施例方式(一 )茄子和煙草Phtl ；3-Phtl ；5基因啟動(dòng)子序列的克隆將茄子(Solanum melongena) suqi 禾口煙草(Nicotiana tabacum) 86 (南京農(nóng)旺豐 農(nóng)貿(mào)有限責(zé)任公司)基因組DNA分別用限制性內(nèi)切酶EcoRV、Dral和PvuII充分酶切，酶 切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的介導(dǎo)下經(jīng)自身環(huán)化后作為PCR擴(kuò)增模板，在Phtl ；3，Phtl ；4及 Phtl ；5 基因(SmPhtl ；3 :EF091668 ；NtPhtl ；3 :EF091669 ；SmPhtl ；4 :EF091671 ；NtPhtl ； 4 :EF091672 ；SmPhtl ；5 :EF091674 ；NtPhtl ；5 :EF091675)的各自的編碼區(qū)設(shè)計(jì)反向 PCR (inverse PCR, iPCR)引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為SmPT3-iPCR-Fl :SEQ ID NO. 7，SmPT3_iPCR-Rl :SEQ ID NO. 8，SmPT3-iPCR-F2 :SEQ ID NO. 9，SmPT3_iPCR-R2 :SEQ ID NO. 10 ；NtPT3-iPCR-Fl :SEQ ID NO. 11，NtPT3_iPCR_Rl :SEQ ID NO. 12，
NtPT3--iPCR--F2:SEQIDNO.13，NtPT3--iPCR--R2:SEQIDNO.14
SmPT4--iPCR--F1:SEQIDNO.15，SmPT4--iPCR--R1:SEQIDNO.16，
SmPT4--iPCR--F2:SEQIDNO.17，SmPT4--iPCR--R2:SEQIDNO.18
NtPT4--iPCR--F1:SEQIDNO.19，NtPT4--iPCR--R1:SEQIDNO.20，
NtPT4--iPCR--F2:SEQIDNO.21，NtPT4--iPCR--R2:SEQIDNO.22
SmPT5--iPCR--F1:SEQIDNO.23，SmPT5--iPCR--R1:SEQIDNO.24，
SmPT5--iPCR--F2:SEQIDNO.25，SmPT5--iPCR--R2:SEQIDNO.26
NtPT5--iPCR--F1:SEQIDNO.27，NtPT5--iPCR--R1:SEQIDNO.28，
NtPT5--iPCR--F2:SEQIDNO.29，NtPT5--iPCR--R2:SEQIDNO.30 以SmPhtl ;4基因的啟動(dòng)子分離為例，經(jīng)過(guò)兩次巢式PCR (nested PCR)反應(yīng)后 (上表引物F1和R1進(jìn)行第一次PCR，以EcoRV酶切-連接產(chǎn)物為模版；然后用F2和R2為 引物，以第一次PCR產(chǎn)物為模板再進(jìn)行第二次PCR)，第二次PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)了約1200bp的 特異產(chǎn)物。PCR采用20微升體系10x Buffer :2ul ；2. 5mM dNTP 1. 6ul ；正向引物0. 8ul ；反向引物0. 8ul ；模板 2ul ；dH20 補(bǔ)足到 20ulPCR反應(yīng)條件如下步驟一95 °C，4 分鐘；步驟二94°C，30 秒；55°C，30 秒；72°C，2 分鐘，步驟二循環(huán) 30 次；步驟三72°C，7分鐘步驟四4°C保溫將擴(kuò)增條帶純化后連接到pMD19_T(日本TaKaRa公司)克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a (南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，利用酶切和PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序。對(duì)測(cè)序 結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)該序列的3’端127個(gè)堿基與SmPhtl ；4基因cDNA的5'端序列完全一致， 說(shuō)明擴(kuò)增得到的產(chǎn)物包含了 SmPhtl ；4基因的啟動(dòng)子。將序列兩端與基因編碼區(qū)重疊的部 分去除后我們得到了從翻譯起始位點(diǎn)ATG到上游-865bp的啟動(dòng)子片段> pSmPT4。通過(guò)相同的方法，我們成功的從煙草和茄子基因組中分離到Phtl ；3-Phtl ；5共 6個(gè)基因的啟動(dòng)子片段序列，SmPT3啟動(dòng)子(SEQ ID NO. 1)，NtPT3啟動(dòng)子(SEQ IDN0. 2)， SmPT4 啟動(dòng)子(SEQ ID NO. 3)，NtPT4 啟動(dòng)子(SEQ ID NO. 4)，SmPT5 啟動(dòng)子(SEQ ID NO. 5) 及NtPT5啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO. 6)本發(fā)明的茄子和煙草Phtl ；3-Phtl ；5基因的啟動(dòng)子序列為首次報(bào)道，有望應(yīng)用于 植物尤其是雙子葉植物的磷素營(yíng)養(yǎng)高效利用遺傳改良。( 二)茄子和煙草Phtl ；3-Phtl ；5基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析茄子和煙草Phtl ;3_1 ;5啟動(dòng)子的全長(zhǎng)序列已于上述內(nèi)容中給出。DNAMAN軟件 的分析結(jié)果表明，Phtl ；3、Phtl ；4和Phtl ；5啟動(dòng)子在各自的直系同源基因(orthologous genes)之間分別存在著較為保守的區(qū)域，且該保守區(qū)域集中分布在靠近ATG的200bp以內(nèi)。利用PLACE 程序(Higo et al.，1999 ；Xiao et al.，2006)對(duì) Phtl ；3，Phtl ；4 及 Phtl ；5啟動(dòng)子的順式元件進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)Phtl ；3，Phtl ；4及Phtl ；5啟動(dòng)子都存在 P1BS(PHR1 Binding Sequence, GNATATNC)這一已知的與缺磷誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)的順式作用元 件，而其中PIBS除了在SmPht 1 ；5啟動(dòng)子中存在兩個(gè)拷貝，在其它5個(gè)Pht 1基因的啟動(dòng)子中均只含有1個(gè)拷貝，且都位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游_160bp以內(nèi)。此外通過(guò)序列比對(duì)分析，在六 個(gè)啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游200bp以內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)保守的基序元件(TTTCTTGT)，由于 在現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有找到相對(duì)應(yīng)的基序，我們將之命名為MYCS(Ml￡orrhiza Sequence) 基序，該基序在茄子和煙草Phtl ；4啟動(dòng)子中都存在著兩個(gè)拷貝。(三)含有P1BS和MYCS突變或敲除的Phtl；3-1 ；5啟動(dòng)子融合⑶S報(bào)告基因的 轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得從茄子和煙草基因組中用重疊延伸PCR擴(kuò)增分別獲得了 Phtl ；3-Phtl ；5的啟動(dòng) 子序列及其內(nèi)部突變或缺失P1BS和MYCS基序的擴(kuò)增片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物先克隆到PMD19-T 載體，Hindlll和BamHI雙酶切后回收產(chǎn)物片段并定向替換pBI121表達(dá)載體的35S啟動(dòng)子。 重組后的表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草。(四)Phtl；3-Phtl ；5的啟動(dòng)子序列及其內(nèi)部突變或缺失P1BS和MYCS的啟動(dòng)子 片段在菌根侵染條件下驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)活性的檢測(cè)如實(shí)施方式(三)中所述構(gòu)建各轉(zhuǎn)基因植株，用提取煙草總DNA繼而PCR驗(yàn)證方 法鑒定出陽(yáng)性植株。用1ml根內(nèi)球囊霉菌(Glomus intraradices)(加拿大PremierTech Biotechnologies公司)孢子懸液接種陽(yáng)性植株，孢子懸液每毫升含400個(gè)孢子，采用低磷 處理(50PM Pi)接種后的陽(yáng)性植株，6-7周后，即植物根系與菌根真菌形成穩(wěn)定的共生體 系時(shí)，采取植株根系進(jìn)行GUS染色鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，完整的啟動(dòng)子能夠?qū)е翯US報(bào)告基因的 表達(dá)，即根系染色后，其部分皮層細(xì)胞(含有菌根菌共生的叢枝結(jié)構(gòu))呈現(xiàn)藍(lán)色；而突變或 缺失P1BS和MYCS的啟動(dòng)子不能驅(qū)動(dòng)⑶S報(bào)告基因的表達(dá)。結(jié)果表明，P1BS和MYCS對(duì)于 Phtl ；3-1 ；5的菌根誘導(dǎo)表達(dá)模式是極為重要且不可或缺的兩個(gè)正調(diào)控元件。
權(quán)利要求
植物中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件，包括MYCS和P1BS，其特征序列如下MYCSTKTCTTGTTP1BSGNATATNC其中K＝G或T；N＝A或G或C或T。
2.含有權(quán)利要求1所述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 SmPT3的啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 1。
3.含有權(quán)利要求1所述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 NtPT3的啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 2。
4.含有權(quán)利要求1所述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 SmPT4的啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 3。
5.含有權(quán)利要求1所述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 NtPT4的啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 4。
6.含有權(quán)利要求1所述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 SmPT5的啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 5。
7.含有權(quán)利要求1所述順式調(diào)控元件的茄子中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 NtPT5的啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO. 6。
全文摘要
本發(fā)明首次公開(kāi)了植物中菌根誘導(dǎo)表達(dá)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件，屬于基因工程領(lǐng)域。這兩個(gè)順式調(diào)控元件MYCS和P1BS介導(dǎo)了Pht1；3-5的菌根特異表達(dá)。對(duì)于后續(xù)工作中克隆菌根信號(hào)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因，以及通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法提高作物對(duì)土壤中有限的磷素營(yíng)養(yǎng)的吸收能力及利用效率等奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101851623SQ201010156720
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者徐國(guó)華, 陳愛(ài)群, 顧冕 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)