專利名稱：一種快速提取水稻dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速提取水稻DNA的方法。
背景技術(shù)：
基于PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記已廣泛地運(yùn)用于種子純度鑒定、親緣關(guān)系的分 析、分子標(biāo)記輔助育種、基因定位以及轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)等。尤其是，DNA分子標(biāo)記輔助選擇 育種已成為分子技術(shù)在作物改良中的一個(gè)重要應(yīng)用，即通過(guò)對(duì)與表型緊密連鎖的DNA分子 標(biāo)記的篩選，以快速獲取帶目的表型的理想植株。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展、水稻基因組測(cè) 序的完成、功能基因鑒定的日益增多，分子標(biāo)記輔助選擇育種越來(lái)越多地應(yīng)用于作物新品 種改良。為了應(yīng)用PCR檢測(cè)技術(shù)，人們需要從組織樣品中提取DNA。然而，DNA提取是一項(xiàng) 耗費(fèi)人力、物力的繁瑣工作，提取的DNA也僅在篩選、鑒定時(shí)使用了很少的一部分，剩余的 大部分DNA將作為累贅而被廢棄。盡管人們也一直致力于DNA抽提方法的探討，但目前應(yīng) 用的主要方法仍然煩瑣費(fèi)時(shí)。因此，在大規(guī)模的基于PCR的基因型檢測(cè)作業(yè)中，高效、快速、 簡(jiǎn)便的模板DNA制備顯得非常重要。目前已公開的一種用于PCR的植物基因組DNA快速制備方法(王蘭、龍?jiān)沏?、劉?光，分子植物育種.2009，7 (2) 425-428)，存在著如下缺陷1、操作較費(fèi)時(shí)，僅破碎組織樣品的時(shí)間就需要5min ；2、僅能以葉片為原料進(jìn)行提取，且最少要求有4mg的葉片；因此原料的適應(yīng)性較 差；3、所得的DNA溶液主要用于短期使用用TE制備的DNA在4°C下可保存IOd以上， 在冷凍下可保存半年；不利于長(zhǎng)期保存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速提取水稻DNA的方法，采用該方法能從 水稻組織中高效、快速、簡(jiǎn)便的提取模板DNA。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種快速提取水稻DNA的方法，包括以下步 驟1)、取0. OOlg 0. Olg水稻樣品放入離心管內(nèi)，然后向離心管內(nèi)加入500 μ 1試劑 C和200 μ 1氯仿，并加入1 2粒鋼珠；試劑C的制作方法如下先由試劑Α、試劑B、蒸餾水按1 2 7的體積比混合成 混合液，然后再加入占混合液0. 1 0. 3%體積比的β -巰基乙醇，得作為DNA提取液的試 劑C;試劑A包括100 200mM sorbitol (山梨醇)、100 150mM Tris (三羥甲基氨基 甲烷)、20 30mM EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二鈉)、400 600mM NaCl,15 25mM Na2S03、 質(zhì)量濃度0. 8%的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)和質(zhì)量濃度2%的sarkosyl (N-十二烷基肌氨酸鈉)，其余為蒸餾水；PH7. 5 ；試劑B包括90 IlOmM Tris (三羥甲基氨基甲燒)、450 550mM KC1、15 20mMMgCl2和質(zhì)量濃度的Triton X_100 (聚乙二醇辛基苯基醚)，其余為蒸餾水；pH9. 0 ；2)、對(duì)步驟1)所得的離心管內(nèi)的水稻樣品進(jìn)行破碎處理；
3)、將步驟2)所得的破碎后的樣品進(jìn)行離心處理；得含DNA的上清液。作為本發(fā)明的快速提取水稻DNA的方法的改進(jìn)將上述步驟3)所得的含DNA的上 清液繼續(xù)依次進(jìn)行以下步驟4)、取步驟3)所得的上清液于另一個(gè)離心管內(nèi)，加1 2體積倍的無(wú)水乙醇輕搖 混勻，沉淀30 60min后，8，000 10，OOOrpm離心10 15min ；棄上清液，得沉淀；5)、將步驟4)所得的沉淀用體積濃度60 80%的乙醇洗滌，8，000 10，OOOrpm 離心10 15min ；6)、棄步驟5)所得的上清液，得沉淀；所述沉淀為DNA。作為本發(fā)明的快速提取水稻DNA的方法的進(jìn)一步改進(jìn)取步驟3)所得的4 6μ 1 上清液直接作為模板DNA，以試劑D作為PCR反應(yīng)緩沖液，進(jìn)行PCR檢測(cè)；根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié) 果選擇所需的上清液進(jìn)行步驟4)；試劑D包括40 60mM Tris (三羥甲基氨基甲燒)、200 300mM KCl、8 IOmM MgCl2、質(zhì)量濃度0.5%的Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)和體積濃度5 10%的 BSA(牛血清白蛋白)，其余為去離子滅菌水；pH9. 0。作為本發(fā)明的快速提取水稻DNA的方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟2)的破碎為將步驟 1)所得的離心管放入細(xì)胞破碎儀內(nèi)，于28HZ的頻率破碎1. 5 2. 5min ；所述步驟3)的離 心為將步驟2)所得的破碎后的樣品于8，000 10，OOOrpm離心4 6min。作為本發(fā)明的快速提取水稻DNA的方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟6)為棄步驟5)所得 的上清液，倒置離心管至晾干，附著于離心管壁上的沉淀為DNA。作為本發(fā)明的快速提取水稻DNA的方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟1)中鋼珠的粒徑為 4 6mm。在本發(fā)明中，試劑A、試劑B和試劑D均可利用HCl或NaOH對(duì)pH值進(jìn)行調(diào)整。實(shí) 際應(yīng)用時(shí)，在使用前，先將試劑A、試劑B、蒸餾水按1 2 7的體積比混合成混合液，然后 再加入占混合液0. 1 0. 3%體積比(優(yōu)選的0. 2%體積比)的β -巰基乙醇，得作為DNA 提取液的試劑C。試劑A可以破壞水稻組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，試劑B則協(xié)調(diào)提供一個(gè)細(xì)胞 裂解、DNA釋出的pH環(huán)境和離子環(huán)境；在使用前才進(jìn)行試劑C的配制是為了保證試劑A和 試劑B長(zhǎng)期存放的穩(wěn)定性。試劑D則為PCR反應(yīng)提供穩(wěn)定的環(huán)境和必需的因子。本發(fā)明的主要原理為采用試劑A破壞水稻組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，有助于細(xì)胞 中DNA的釋出，進(jìn)一步在機(jī)械破碎的作用下，使絕大部分的組織細(xì)胞破裂，DNA逸出。試劑B 則協(xié)調(diào)提供一個(gè)細(xì)胞裂解、DNA釋出的pH環(huán)境和離子環(huán)境，防止釋出的DNA發(fā)生沉淀或氧 化褐變。當(dāng)DNA釋出于由溶液A和溶液B配制的溶液C中時(shí)，通過(guò)氯仿的純化和離心后，獲 得的上清液可直接用于PCR反應(yīng)或通過(guò)乙醇沉淀析出DNA用于長(zhǎng)期保存或使用。本發(fā)明所得的DNA可于_20°C長(zhǎng)期保存?zhèn)溆没蚣?00 200 μ 1超純水溶解用于直 接使用。利用本發(fā)明能從水稻組織中高效、快速、簡(jiǎn)便地提取DNA，可以簡(jiǎn)化PCR檢測(cè)技術(shù)中提取DNA的耗費(fèi)人力、物力的繁瑣工作。與現(xiàn)有的植物DNA提取方法相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1)、快速、簡(jiǎn)便。本發(fā)明能夠在2min內(nèi)完成細(xì)胞破碎，且一次性可完成48份樣品 的破碎。10分鐘就可完成96份樣品的DNA提取，用于PCR擴(kuò)增。 而傳統(tǒng)的CTAB提取法，完成96份樣品的DNA提取則在5小時(shí)以上。
2)、成本低。提取過(guò)程中減少了多種試劑的使用量，使用本發(fā)明從水稻中快速提取 DNA僅應(yīng)用于PCR反應(yīng)時(shí)，無(wú)需使用乙醇或異丙醇沉淀。3)、DNA產(chǎn)量高。0. OOlg的水稻樣品用本試劑盒提取，可用作100次PCR擴(kuò)增的 DNA模板使用。而按照背景技術(shù)中告知的《用于PCR的植物基因組DNA快速制備方法》，以 0. 004g的水稻樣品為原料進(jìn)行提取，所得也無(wú)法滿足100次PCR擴(kuò)增的DNA模板所需使用量。4)、周期短。由于所需的水稻樣品少，催芽、播種5 8天就可取少量葉片用于PCR 檢測(cè)。5)、本發(fā)明不但可以葉片作為原料，還可以用別的組織(例如根、莖、老葉、嫩葉、 葉鞘、穗等)作為原料；一般來(lái)說(shuō)，根在催芽、播種的5 8天內(nèi)即能取得。6)、本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)短期使用，也可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存；具有更大的通用性；具體為利 用本發(fā)明所得的DNA溶液可用于短期使用，進(jìn)一步沉淀獲得的DNA與傳統(tǒng)方法獲得的DNA 是一樣的，在冷凍條件下可以保存若干年。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1是從水稻葉片中快速提取DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后實(shí)施的效果圖；RM8213、RM17713、RM13、RM19234、RM217、RM3183 引物序列來(lái)自 GRAMENE 網(wǎng)站 (http://www. gramene. org/)的公開信息，并委托上海申能博彩公司合成用于PCR擴(kuò)增； Marker為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量圖譜。圖2是經(jīng)沉淀提取的DNA經(jīng)光密度測(cè)定得出的含量對(duì)比圖，1 5為5份樣品的測(cè)定值。 圖3是來(lái)自不同組織樣品的模板DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、一種快速提取水稻DNA的方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、取0.005g水稻葉片(日本晴經(jīng)浸種、催芽后，播種7天后的幼嫩葉片)放入 2ml的圓底離心管(江蘇海門耀華玻璃儀器廠生產(chǎn))，加入500 μ 1試劑C和200 μ 1氯仿， 并加入1粒鋼珠(為粒徑5mm的碳素鋼鋼珠，購(gòu)自上海自行車鋼珠廠)；試劑C的制作方法如下先由試劑A、試劑B、蒸餾水按1 2 7的體積比混合成 混合液，然后再加入占混合液0. 2%體積比的β -巰基乙醇，得試劑C ；該試劑C作為DNA提 取液。試劑A 包括 150mM sorbitol, 125mM Tris,25mM EDTA-Na2,500mM NaCl, 20mMNa2S03，質(zhì)量濃度0. 8%的CTAB，質(zhì)量濃度2%的sarkosyl ；其余為蒸餾水；pH7. 5 ；
試劑B 包括 IOOmM Tris,500mM KCl, 18mM MgCl2，質(zhì)量濃度 1 % 的 Triton X-100， 其余為蒸餾水；PH9. 0 ；2)、將步驟1)所得的離心管放入細(xì)胞破碎儀(TiSSueLySerII，QIAGEN，德國(guó))內(nèi)， 于28HZ的頻率破碎2min ；從而實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻葉片進(jìn)行破碎。3)、將步驟2)所得的破碎后樣品于10，OOOrpm離心5min ；得上清液。4)、以2 μ 1的試劑D作為PCR反應(yīng)緩沖液，取5 μ 1上清液直接作為模板DNA，進(jìn)行 PCR檢測(cè)。試劑D 包括 50mM Tris,250mM KCl,9mM MgCl2，質(zhì)量濃度 0. 5%的 Triton X-100， 體積比10%的BSA(牛血清白蛋白)，其余為去離子滅菌水；pH9.0。該試劑D為10XPCR反 應(yīng)緩沖液，即試劑D占PCR反應(yīng)體系的總體積的1/10。用于PCR檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系具體如下5μ 1 上清液，2μ 1 試劑 D，lunit Taq 酶，200mM dNTP (包括 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各50mM)，引物濃度0. 2mM,加ddH20補(bǔ)至20 μ L·所用引物分別為以下任意一種RM8213、RM17713、RM13、RM19234、RM217 和 RM3183 ；上述引物均可從 gramene 網(wǎng)站 (http //www. Rramene. ors/)上獲得。PCR反應(yīng)過(guò)程控制條件如下94 "C 6 分鐘94 "C 50 秒55 "C 30 秒72 "C 40 秒 42cycle72 °C 15 分鐘15°C 保存所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果如圖1所示不同的引物均能擴(kuò)增 出清晰的條帶。從而證明步驟3)所得的上清液的確含有足夠含量DNA可用于PCR擴(kuò)增， 并且不同引物均能擴(kuò)出良好的效果。實(shí)施例2、一種快速提取水稻DNA的方法，在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果 選擇所需的上清液繼續(xù)依次進(jìn)行以下步驟4)、取400μ 1步驟3)所得的上清液于另一個(gè)離心管內(nèi)，加600 μ 1無(wú)水乙醇輕搖 混勻，沉淀45min后，10，OOOrpm離心15min ；棄上清液，得沉淀；5)、將步驟4)所得的沉淀用500 μ 1體積濃度70%的乙醇洗滌，10，OOOrpm離心 15min ；6)、棄步驟5)所得的上清液，倒置離心管至晾干；所得DNA可長(zhǎng)期保存。也可將其 加100 μ 1超純水溶解獲得含DNA的溶液。上述6個(gè)步驟總計(jì)花費(fèi)在2小時(shí)。經(jīng)測(cè)試0. 005克葉片克最終能獲得25 μ g左右的核酸。5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù) 如圖2所示。實(shí)施例3、分別選用水稻(日本晴)的老葉、莖、鞘、穗、根各0. 005克作為原料替代實(shí)施例1中的幼嫩葉片，以RM8213作為引物，其余同實(shí)施例1 ；老葉、莖、鞘、穗、根均為90天所得；最 終所得的結(jié)果如圖3所示。圖3證明不同組織所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果相一致。對(duì)比實(shí)施例1 選用同實(shí)施例1的水稻葉片0. 005g水稻葉片，按照背景技術(shù)所告知的DNA快速制 備方法進(jìn)行提取，所得的上清液再按照上述實(shí)施例2的步驟4) 步驟6)進(jìn)行操作，最終僅 能獲得IOyg左右的核酸。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種快速提取水稻DNA的方法，其特征是包括以下步驟1)、取0.001g～0.01g水稻樣品放入離心管內(nèi)，然后向離心管內(nèi)加入500μl試劑C和200μl氯仿，并加入1～2粒鋼珠；試劑C的制作方法如下先由試劑A、試劑B、蒸餾水按1∶2∶7的體積比混合成混合液，然后再加入占混合液0.1～0.3％體積比的β-巰基乙醇，得作為DNA提取液的試劑C；所述試劑A包括100～200mM山梨醇、100～150mM三羥甲基氨基甲烷、20～30mM乙二胺四乙酸二鈉、400～600mM NaCl、15～25mM Na2SO3、質(zhì)量濃度0.8％的十六烷基三甲基溴化銨和質(zhì)量濃度2％的N-十二烷基肌氨酸鈉，其余為蒸餾水；pH7.5；所述試劑B包括90～110mM三羥甲基氨基甲烷、450～550mM KCl、15～20mM MgCl2和質(zhì)量濃度1％的聚乙二醇辛基苯基醚，其余為蒸餾水；pH9.0；2)、對(duì)步驟1)所得的離心管內(nèi)的水稻樣品進(jìn)行破碎處理；3)、將步驟2)所得的破碎后的樣品進(jìn)行離心處理；得含DNA的上清液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是將上述步驟3)所得的含 DNA的上清液繼續(xù)依次進(jìn)行以下步驟4)、取步驟3)所得的上清液于另一個(gè)離心管內(nèi)，加1 2體積倍的無(wú)水乙醇輕搖混勻， 沉淀30 60min后，8，000 10，OOOrpm離心10 15min ；棄上清液，得沉淀；5)、將步驟4)所得的沉淀用體積濃度60 80%的乙醇洗滌，8，000 10，OOOrpm離心 10 15min ；6)、棄步驟5)所得的上清液，得沉淀；所述沉淀為DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是取步驟3)所得的 4 6 μ 1上清液直接作為模板DNA，以試劑D作為PCR反應(yīng)緩沖液，進(jìn)行PCR檢測(cè)；根據(jù)PCR 檢測(cè)結(jié)果選擇所需的上清液進(jìn)行步驟4)；所述試劑D包括40 60mM三羥甲基氨基甲燒、200 300mM KC1、8 IOmM MgCl2、質(zhì) 量濃度0. 5%的Triton X-100和體積濃度5 10%的BSA，其余為去離子滅菌水；pH9. 0。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是所述步驟2)的破碎為將步驟1)所得的離心管放入細(xì)胞破碎儀內(nèi)，于28HZ的頻率破 碎 1. 5 2. 5min ；所述步驟3)的離心為將步驟2)所得的破碎后的樣品于8，000 10，OOOrpm離心4 6min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是所述步驟6)為棄步 驟5)所得的上清液，倒置離心管至晾干，附著于離心管壁上的沉淀為DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是所述步驟1)中鋼珠的 粒徑為4 6mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速提取水稻DNA的方法，包括以下步驟1)取0.001g～0.01g水稻樣品放入離心管內(nèi)，然后向離心管內(nèi)加入500μl試劑C和200μl氯仿，并加入1～2粒鋼珠；試劑C的制作方法如下先由試劑A、試劑B、蒸餾水按1∶2∶7的體積比混合成混合液，然后再加入占混合液0.1～0.3％體積比的β-巰基乙醇，得作為DNA提取液的試劑C；2)對(duì)步驟1)所得的離心管內(nèi)的水稻樣品進(jìn)行破碎處理；3)將步驟2)所得的破碎后的樣品進(jìn)行離心處理；得含DNA的上清液。采用本發(fā)明的方法能從水稻組織中高效、快速、簡(jiǎn)便的提取模板DNA。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101812446SQ20101015740
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者劉堅(jiān), 張光恒, 曾大力, 楊窯龍, 胡江, 郭龍彪, 錢前, 饒玉春, 高振宇 申請(qǐng)人:中國(guó)水稻研究所