專利名稱：一種快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)火雞皰疹病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)火雞皰疹病毒的快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
馬立克氏病(Marek' s Disease，簡(jiǎn)稱MD)是雞的一種高度傳染性、淋巴組織增生 性疾病，并以身體各組織發(fā)生單核細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)而最終形成腫瘤為特征。該病的病原為馬立 克氏病毒(Marek' s Disease Virus，簡(jiǎn)稱MDV)，根據(jù)其致病性和血清型反應(yīng)差別，可分為 三類，即MDVI (強(qiáng)毒株及其致弱變異株)、MDV II (自然無(wú)致病性毒株)、MDV III (異源火雞 皰疹病毒，herpesvirus of turkey，下簡(jiǎn)稱為HVT)。其中只有MDV I的強(qiáng)毒株及其變異超 強(qiáng)株對(duì)雞才有致病性。MDV III即火雞皰疹病毒(HVT)，最早是由Kawamura和Witter從正常的火雞體內(nèi) 分離得到的，普遍存在于家養(yǎng)火雞中，對(duì)雞沒(méi)有致病性。美國(guó)Calnek等發(fā)現(xiàn)HVT用細(xì)胞裂 解法可釋放出脫離細(xì)胞的HVT完整病毒，從而成功地將HVTFcl26疫苗株研制成了安全高效 的凍干疫苗，在MDV的預(yù)防中發(fā)揮了極其重要的作用，此外，由于HVT具有可凍干保存、運(yùn)輸 及不從羽毛囊散毒的特點(diǎn)，已被廣泛用于防治MDV的疫苗上，成為世界范圍內(nèi)迄今最廣泛 使用的疫苗。用它制成的疫苗用于雞的免疫，能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)性，。用HVT作疫苗， 不僅生產(chǎn)成本低，而且可以凍干的形式易于貯存和運(yùn)輸。目前疫苗用HVT多是由細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)，如雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、JBJ等多種細(xì)胞 都可以用于HVT的擴(kuò)繁。在細(xì)胞培養(yǎng)病毒檢測(cè)上，常規(guī)的方法有瓊脂擴(kuò)散法，噬斑計(jì)數(shù)法等 方法，但是這些常規(guī)方法操作較繁瑣，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，而且需要的病毒量較多。近年來(lái)，隨著 分子生物技術(shù)的發(fā)展，PCR被廣泛用于病毒的檢測(cè)，但是進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)需要先提取純的 DNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)火雞皰疹病毒(HVT)的方法，具有快速、簡(jiǎn)便、靈 敏、高特異性的特點(diǎn)。本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)火雞皰疹病毒的方法，包括如下步驟(1)樣品處理用胰酶消化待檢測(cè)的細(xì)胞，離心后取沉淀，用緩沖液懸浮該沉淀， 即得到樣品DNA ；(2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)以樣品DNA作為模板，以HVT_F、HVT_R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反 應(yīng)，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；所述HVT_F 的序列為 5，-TTCGACATTCATGATGTTCTGGTG-3，，所述HVT_R 的序列為 5，-TGCGCTCGAAGAGTTACCGATC-3，；(3)電泳檢測(cè)及結(jié)果分析取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若PCR電泳圖譜中， 對(duì)應(yīng)于樣品DNA的泳道在666bp處有特異性擴(kuò)增條帶，則該樣品感染了火雞皰疹病毒。步驟⑵所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為樣品DNA、2. 5 μ L的10XPCR緩沖液、2 μ L濃度為 25mM 的MgCl2、0. 5μ L濃度為 IOmM 的 dNTPs、l. 5μ L濃度為 10 μ mol/L 的HVT_F、1· 5 μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 HVT_R、0. 5 μ L 濃度為 5U/ μ L 的 TaqDNA 聚合酶、14. 5 μ L 的 ddH20 ；所 述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性IOmin ；94°C變性45sec、54_57°C退火45sec、72°C延伸 Imin, 35次循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。所述的退火溫度最好為55°C ；本發(fā)明根據(jù)HVT核苷酸序列設(shè)計(jì)引物HVT_F/HVT_R，實(shí)現(xiàn)了 HVT的快速檢測(cè)。該方法克服了常規(guī)的噬斑檢測(cè)、瓊脂雙擴(kuò)散、常規(guī)PCR等方法在該病毒檢測(cè)上的缺陷，無(wú)需提取 純的DNA，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)方便。


附圖是檢測(cè)火雞皰疹病毒的電泳圖，其中M-標(biāo)準(zhǔn)分子量，1-陰性對(duì)照，2-陽(yáng)性對(duì) 照，3-接種 HVT-FC126 的 CEF。
具體實(shí)施例方式實(shí)例一采用本發(fā)明方法檢測(cè)HVT病毒以感染HVT-FC126的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)為檢測(cè)對(duì)象，以HVT-FC126凍干苗為 陽(yáng)性對(duì)照，以未感染的CEF細(xì)胞為陰性對(duì)照。其中HVT-FC126凍干苗購(gòu)于南京天邦生物科技有限公司；雞胚成纖維細(xì)胞(CEF) 按照常規(guī)方法制備(參照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》2000年版P442，雞胚成纖 維單層(CEF)的制備)；感染HVT-FC126的雞胚成纖維細(xì)胞是用HVT-FC126凍干苗擴(kuò)繁的
細(xì)胞毒。引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI上已報(bào)道的HVT核酸序列(X68653)設(shè)計(jì)引物，引物序列如 下HVT_F 5，-TTCGACATTCATGATGTTCTGGTG-3，，
HVT_R 5’ -TGCGCTCGAAGAGTTACCGATC-3’。理論上擴(kuò)增出的目的條帶大小為666bp。(1)樣品處理用0. 25% (質(zhì)量百分比)胰酶消化待檢測(cè)的細(xì)胞，IOOOrpm離心5min，棄上清，沉 淀用Iml的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度約為1 X IO5 1 X IO7,取2 μ L重懸細(xì)胞液作為 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(2) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)以樣品DNA作為模板，以HVT_F、HVT_R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物；所述HVT_F的序列為5，-TTCGACATTCATGATGTTCTGGTG-3，，所述HVT_R的序列為 5’ -TGCGCTCGAAGAGTTACCGATC-3’。PCR反應(yīng)體系包括樣品DNA2μ L10 X PCR 緩沖液2. 5 μ LMgCl2(25mM)2 μ LdNTPs (IOmM)0. 5 μ L
HVT_F (10 μ mol/L) 1· 5 μ LHVT_R(10ymol/L) 1. 5μ LTaqDNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5 μ LddH2014. 5 μ L總體積25 μ L反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 IOmin ；94°C變性 45sec、54_57°C退火 45sec、72°C延伸 lmin,35次循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。退火溫度最好為55°C，該產(chǎn)物
于4°C保存。PCR反應(yīng)使用的以上試劑均購(gòu)于Takara公司。(3)電泳檢測(cè)及結(jié)果分析取10 μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1 % (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠在0. 5X TBE (Tris-硼酸)緩 沖液和120V電壓條件下電泳40min，在0. 5 μ g/mL的溴化乙錠(EB)中染色lOmin，染色后 于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。從圖1可見(jiàn)，對(duì)應(yīng)于接種HVT-FC126的CEF的泳道在666bp處有 特異性擴(kuò)增條帶，則該樣品感染了火雞皰疹病毒。
權(quán)利要求
一種快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)火雞皰疹病毒的方法，包括如下步驟(1)樣品處理用胰酶消化待檢測(cè)的細(xì)胞，離心后取沉淀，用緩沖液懸浮該沉淀，即得到樣品DNA；(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)以樣品DNA作為模板，以HVT_F、HVT_R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；所述HVT_F的序列為5′-TTCGACATTCATGATGTTCTGGTG-3′，所述HVT_R的序列為5′-TGCGCTCGAAGAGTTACCGATC-3′；(3)電泳檢測(cè)及結(jié)果分析取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若PCR電泳圖譜中，對(duì)應(yīng)于樣品DNA的泳道在666bp處有特異性擴(kuò)增條帶，則該樣品感染了火雞皰疹病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)火雞皰疹病毒的方法，其特征在于步驟(2) 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為樣品DNA、2. 5 μ L的10 X PCR緩沖液、2 μ L濃度為25mM的MgCl2、 0. 5 μ L 濃度為 IOmM 的 dNTPs、1. 5 μ L 濃度為 10 μ mol/L 的 HVT_F、1· 5 μ L 濃度為 10 μ mol/ L的HVT_R、0. 5 μ L濃度為5U/ μ L的TaqDNA聚合酶、14. 5 μ L的ddH20 ；所述PCR擴(kuò)增反應(yīng) 程序?yàn)?4°C預(yù)變性IOmin ；94°C變性45sec、54_57°C退火45sec、72°C延伸lmin，35次循環(huán)； 最后72°C延伸lOmin，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)火雞皰疹病毒的方法，其特征在于所述的退 火溫度為55°C。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)火雞皰疹病毒的方法，涉及病毒檢測(cè)領(lǐng)域。該檢測(cè)方法包括如下步驟樣品處理；PCR擴(kuò)增反應(yīng)以樣品DNA作為模板，以HVT_F、HVT_R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；電泳檢測(cè)及結(jié)果分析取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若PCR電泳圖譜中，對(duì)應(yīng)于樣品DNA的泳道在666bp處有特異性擴(kuò)增條帶，則該樣品感染了火雞皰疹病毒。本發(fā)明根據(jù)HVT核苷酸序列設(shè)計(jì)引物HVT_F和HVT_R，實(shí)現(xiàn)了HVT的快速檢測(cè)，無(wú)需提取DNA，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)方便。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101812542SQ201010157599
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者于漾, 何家惠, 侯繼波, 吳培培, 唐應(yīng)華, 揭鴻英 申請(qǐng)人:國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心