專利名稱：胃腸腫瘤診斷和預示的新分子標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術和醫(yī)學領域，更具體的，本發(fā)明涉及一種胃腸癌癥標志物及 其用途，胃腸道癌癥診斷、動態(tài)檢測以及預后判斷的試劑或試劑盒及其使用方法。
背景技術：
近年來惡性腫瘤的發(fā)病率持續(xù)上升，其中60%以上為消化系統(tǒng)腫瘤，以胃癌、大腸 癌最為常見。在全球范圍內，胃癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中僅次于肺癌占第二位，在女性惡 性腫瘤中居第四位。而在我國死亡率居惡性腫瘤首位，年平均死亡率為每10萬人口中有 25. 53人。大腸癌包括結腸癌和直腸癌，是近幾十年來發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)在世界大多數(shù)國家和 地區(qū)上升最快的腫瘤之一。近年的流行病學資料顯示，大腸癌已上升為全球第三位最常見 的癌癥，2000年全世界有70萬人患大腸癌，其中50萬人因此而死亡。早期發(fā)現(xiàn)胃腸道腫瘤，早期治療，是提高胃腸道惡性腫瘤療效的關鍵。腫瘤分期 越高，則表明發(fā)現(xiàn)越晚。據國外資料報道I、II、III、IV期直腸癌患者5年生存率則分別為 93%、84%、44%和8%。但是胃腸道惡性腫瘤的臨床癥狀常常不典型，往往被我們自認為是 我們常說的胃炎、胃潰瘍、消化不良、便秘等，從而延誤診斷和治療。目前中國臨床診斷多為癥狀性篩選，即出現(xiàn)腹部不適、隱痛、泛酸、噯氣或消瘦、黑 便等癥狀后進行內鏡等檢查，最終檢出的癌絕大部分為進展期癌。現(xiàn)有的診斷方法如血清 學免疫檢測通常使用的標志物如CEA、CA系列抗原，普遍存在靈敏度低、特異性差，尤其對 早期癌檢出率、有效性都很低。常用的細胞學檢測雖然低廉簡便，靈敏度同樣偏低，而影像 學檢測僅對有較大占位的惡變腫瘤有很高的診斷率。中國是發(fā)展中的人口大國，經濟條件 欠發(fā)達，開展以影像為主的全民性普查篩選困難重重。另外，多數(shù)胃腸道癌癥患者臨床確診 時已屬中晚期，如何進行手術后病人預后的監(jiān)測和有效治療方法的選擇，是改善預后的有 效方法。發(fā)展具有高靈敏度、特異性強的胃腸道診斷產品，是提高胃腸癌癥早期檢出率、 改善患者預后的關鍵之一。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，作為組織蛋白酶的天然抑制蛋白 Cystatin基因家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。在組織和體液中，Cystatin家族蛋白可逆 性地結合半胱氨酸蛋白酶，防止組織蛋白酶的活性過度。Cystatin C是組織蛋白酶B最強 的抑制蛋白，但是在卵巢癌和頭頸部癌癥中，cystatin C的表達有不同水平的上升。而在非 小細胞肺癌中，stefin A (cystatin家族成員)的表達水平有所增加；在腦膜瘤中，stef inB 在mRNA水平上有明顯降低；cystatin F(亦稱為Ieukocystatin或CMAP)在多種腫瘤中的 表達水平都有顯著增加。研究結果顯示，cystatin的幾個家族成員在不同腫瘤中的表達水 平有所上升，很可能是由于在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中需要組織蛋白酶的參與，先誘導其表達 量增加，再激活機體本身的應激機制，導致cystatin的表達量上升以抑制過盛的蛋白酶活 性。但cystatin的表達量并不與腫瘤的發(fā)展成正相關的關系，因為在膠質瘤中，cystatin C的低表達意味著疾病的晚期，病人的生存期較短，且易于復發(fā)，該結論在mRNA和蛋白水平 上都得到了驗證。
本發(fā)明證實cystatin家族成員CSTl及其剪切子的表達水平與胃腸道腫瘤關系密 切。CST1，又名cystatin SN，是半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)家族成員，含141個氨 基酸，2個二硫鍵，16. 4Kda，分布于多種體液和分泌物中，如眼淚、唾液、血清、血漿等。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種預示和提供診斷胃腸腫瘤信息的檢測方法，解決了現(xiàn)有 技術中胃腸腫瘤難以早期檢測的難題。為了解決現(xiàn)有技術中的這些問題，本發(fā)明提供的技術方案是一種提供胃腸腫瘤易感性信息的檢測方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)獲取待測樣品；(2)測定選自下列編碼mRNA或cDNA的基因在樣品中的表達水平是否過表達，所 述基因為具有SEQ ID No 39的CSTl基因；或特異性識別CSTl基因的mRNA、CSTl剪切子、 CSTl基因的cDNA、CSTl剪切子的cDNA的其中一種的引物或/和探針所識別的基因；或通過 至少一種CSTl剪切子引物對應的擴增子所鑒定的基因。其中CSTlmRNA有2中剪切拼接方 式，第一種(splicel) (SEQ ID No :43)，包含 CSTl 外顯子 1 ((SEQ ID No :40)、外顯子 2 (SEQ ID No :41)、外顯子3(SEQ ID No 42)；而第二種剪切方式(splice2) (SEQ ID No 44)僅包 含CSTl外顯子1( (SEQ ID No 40)和外顯子2 (SEQ ID No 41)；當基因表達水平超過預定 閾值時則預示胃腸腫瘤易感或形成。優(yōu)選的，所述引物為具有SEQ ID No :1 2或SEQ ID No :4 21至少之一序列的 引物；所述探針為具有SEQ ID No 3序列的探針。優(yōu)選的，所述CSTl第一個剪切子引物對應的擴增子具有SEQ ID No 45的序列。優(yōu)選的，所述方法中特異性引物是具有SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的序列 形成的引物對以及具有SEQ ID No :3所示序列的探針。優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中檢測表達水平的方法采用基于核酸序列擴增法的體 外RNA擴增技術或多聚酶鏈式反應法。優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中檢測表達水平的方法采用實時定量PCR法，所述實時 定量PCR法選自基于非特異性雙核苷酸染料的實時PCR或基于特殊熒光探針的實時PCR。本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測胃腸功能的試劑盒，其特征在于所述試劑盒 包括用于捕獲SEQ ID No 39的CSTl基因和/或CSTl基因剪切子(SEQ ID No :43，44)的 引物或探針以及使CSTl和/或其剪切子及其捕獲引物或探針混合物可視化的反應試劑。優(yōu)選的，所述反應試劑通過選自瓊脂糖凝膠電泳、酶聯(lián)凝膠法、電化學發(fā)光技術、 原位雜交技術、熒光檢測法使CSTl和/或其剪切子及其捕獲引物或探針混合物可視。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括作為陽性參照品的胃癌細胞株、作為陰性參照品的正 常的胃細胞株、核酸提取試劑、逆轉錄試劑、聚合酶鏈反應試劑。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)該基因異常表達和胃腸癌具有密切的相關性，并根據該相關性提 供了基于特異性分子Marker的，用于診斷胃腸疾病、監(jiān)控胃腸疾病、監(jiān)控胃腸疾病治療效 果以及監(jiān)控和評價胃腸癌是否轉移復發(fā)的測定法、試劑盒及其使用方法，從而為胃腸癌癥 提供有效的分子診斷標記或評價胃腸癌癥是否轉移的分子標記或判斷胃腸癌癥患者預后 的分子標記，這些可以用于胃腸癌癥診斷、動態(tài)監(jiān)測以及預后判斷。
根據本發(fā)明的第一個方面，提供一種CSTl基因的用途，用于制備胃腸癌癥診斷、 動態(tài)監(jiān)測以及預后判斷的試劑或試劑盒。檢測方法包括檢測CSTl mRNA和/或CSTl剪切子過表達或檢測CSTl cDNA和/ 或CSTl剪切子CDNA過表達。優(yōu)選的，檢測方法包括使用至少一對能特異性結合CSTlmRNA和/或CSTl剪切子 的引物和/或一條至少與部分CSTlmRNA和/或CSTl剪切子互補的寡聚核苷酸。優(yōu)選的，檢測方法包括使用至少一對能特異性結合CSTl cDNA和/或CSTl剪切子 cDNA的引物和/或一條至少與部分CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA互補的寡聚核苷酸。優(yōu)選的，檢測方法包括基于核酸序列擴增法(Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)的體外 RNA 擴增技術、轉錄介導的擴增(Transcription-median amplification, TMA)、連接酶鏈反應(Ligase chain reaction, LCR)、適溫鏈置換 反應(thermophilicstrand displacement amplification, tSDA)、多聚酶鏈式反應 (polymerase chain reaction, PCR)、最佳的是實時定量 PCR(quantitative real-time PCR)。優(yōu)選的，實時定量PCR包括基于非特異性雙核苷酸染料如SYBR Green的實時PCR、 基于特殊熒光探針的實時PCR。優(yōu)選的，檢測方法進一步包括使CSTl和/或其剪切子及其捕獲試劑混合物可視化 的反應試劑。本發(fā)明提供了一種檢測受試者樣品胃腸功能的方法，該方法包括檢測所述樣品中 CSTl mRNA和/或CSTl剪切子的水平。優(yōu)選的，所述檢測進一步包括診斷所述受試者的胃、腸疾病，監(jiān)控所述受試者的 胃、腸疾病，判斷所述受試者的胃、腸疾病的預后，監(jiān)控給予所述受試者的胃、腸疾病治療的 效果，分期所述受試者的癌癥。優(yōu)選的，所述受試者包括胃、腸不適就醫(yī)者，慢性胃炎、腸炎患者，有家族性胃、腸 道癌癥者，且所述的檢測進一步包括對受試者進行篩查以檢測胃、腸道癌癥。優(yōu)選的，所述 受試者為胃、腸道癌癥患者，且所述的檢測進一步包括監(jiān)控所述受試者的胃、腸癌癥，判斷 所述受試者的預后，監(jiān)控給予所述受試者的治療效果。優(yōu)選的，所述檢測方法進一步包括定量所述樣品中CSTl mRNA和/或CSTl剪切子 的水平。優(yōu)選的，檢測方法包括使用至少一對能特異性結合CSTlmRNA和/或CSTl剪切子 的引物和/或一條至少與部分CSTlmRNA和/或CSTl剪切子互補的寡聚核苷酸。優(yōu)選的，檢測方法包括定量檢測CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA過表達的水平。優(yōu)選的，檢測方法包括使用至少一對能特異性結合CSTl cDNA和/或CSTl剪切子 cDNA的引物和/或一條至少與部分CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA互補的寡聚核苷酸。所述方法中所述待測樣品包括手術組織、鏡檢組織、淋巴結組織、骨髓、血清樣 品、血漿樣品、尿樣、血樣、全血樣品、血液級分樣品。優(yōu)選的檢測方法，包括基于核酸序
5列擴增法(Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)的體外RNA擴增技術、轉錄介導 W Γ ii (Transcription-median amplification, TMA) >Slljl Jx. IS (Ligase chain reaction, LCR)、適溫鏈置換反應(thermophilic strand displacement amplification, tSDA)、多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)、最佳的是實時定量 PCR(quantitativereal-time PCR)。實時定量PCR，包括基于非特異性雙核苷酸染料如SYBR Green的實時PCR、基于特 殊熒光探針的實時PCR。也可以進一步包括使CSTl和/或其剪切子及其捕獲試劑混合物可 視化的反應試劑?！N用于胃腸癌癥診斷、動態(tài)監(jiān)測以及預后判斷的試劑或材料，所述的試劑選自 下組CST1基因或轉錄本的特異性引物；和/或CSTl基因或轉錄本的特異性識別探針或表 面固定有所述探針的芯片。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑是引物，所述的引物是針對CSTl外顯子的引物。更 優(yōu)選的優(yōu)選例中，所述的引物是針對CSTl基因第一個剪切子(SEQ ID No 43)的特異性引 物；或所述的引物是針對CSTl第二個剪切(SEQ ID No 44)子的特異性引物；或所述的引物 是針對 CSTl 基因的外顯子 1 (Exonl) (SEQ ID No 40)和外顯子 2(Exon2) (SEQ ID No 41) 的特異性引物(即擴增產物跨越外顯子1和外顯子2)；或所述的引物是針對CSTl基因的外 顯子I(Exonl)和外顯子3(Εχοη3) (SEQ ID No 42)的特異性引物(即擴增產物跨越外顯子 1和外顯子3)；或所述的引物是針對CSTl基因的外顯子2 (Εχοη2)和外顯子3(Εχοη3)的特 異性引物(即擴增產物跨越外顯子2和外顯子3)。優(yōu)選的引物是針對CSTl基因第一個剪切子的外顯子1的特異性引物。在另一優(yōu) 選例中，所述的特異性引物是具有SEQ ID No :1和SEQID No :2所示的序列的引物對以及 SEQ ID No 3 的探針。一種用于預示或檢測胃腸腫瘤的基因芯片，其特征在于所述基因芯片包括用于捕 獲對應于SEQ ID No 39的CSTl基因或對應于SEQ ID No :43的CSTl基因第一個剪切子的 引物或探針。根據本發(fā)明的第一個方面，提供了檢測受試者樣品的方法，包括檢測樣品中CSTl 第一個剪切子mRNA的水平。根據本發(fā)明所述的第一個方面優(yōu)選實施方案中的特征，檢測包 括診斷受試者的胃腸疾病，監(jiān)控受試者的胃腸疾病，監(jiān)控受試者胃腸疾病治療效果，受試者 癌癥分期或樣品中CSTl第一個剪切子mRNA的水平。根據本發(fā)明更進一步的特征，受試者為胃腸部不適就醫(yī)者，且檢測包括對受試者 進行篩查以檢測胃腸癌癥。根據本發(fā)明更進一步的特征，受試者為慢性胃炎、腸炎患者，且 檢測包括對受試者進行篩查以檢測胃腸癌癥。根據本發(fā)明更進一步的特征，受試者有家族 性胃腸癌癥，且檢測包括對受試者進行篩查以檢測胃腸癌癥。根據如下所述的優(yōu)選方案，樣 品包括胃腸手術、胃腸鏡、淋巴結、骨髓、血清、血漿、血樣、尿樣。根據優(yōu)選實施方案的特征， 血樣可包括全血樣品或血液級分樣品。本發(fā)明的另外方面提供了胃腸癌癥診斷、動態(tài)監(jiān)測以及預后判斷的試劑盒，所述 的試劑盒中含有針對CSTl基因的至少一對引物和一條探針。根據如下所述的優(yōu)選方案， 試劑盒中的引物對為SEQ ID No 1和SEQ ID No :2，探針為SEQ ID No :3。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有胃癌細胞株和正常的胃細胞株分別作為陽性和陰性參照品，其中優(yōu)選方案為胃癌細胞株(NCI-N87)，人胃上皮細胞株(GES-I)； CSTl重組質粒作為標準品。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有腸癌細胞株和不表達CSTl的腸癌 細胞株分別作為陽性和陰性參照品，其中優(yōu)選方案為腸癌細胞株(SW480)，腸癌細胞株 (HCT116) ；CSTl重組質粒作為標準品。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有核酸提取試劑、逆轉錄試劑、聚合酶鏈 反應(PCR)試劑、描述胃癌診斷、動態(tài)監(jiān)測以及預后判斷方法的說明書。根據本發(fā)明所述的優(yōu)選方案的更進一步的特征，檢測試劑盒可用于實際場所，包 括但不限于醫(yī)院、診所以及私人住宅。根據本發(fā)明的另一面，提供用于根據受試者樣品評價受試者是否為胃腸癌癥，或 胃腸癌癥是否轉移復發(fā)的測定法，包括針對CSTl基因的至少一對引物和一條探針，取自樣 品中的總RNA，逆轉錄試劑、聚合酶鏈反應(PCR)試劑，由此能評估是否為胃腸癌癥、治療效 果如何以及是否轉移復發(fā)。優(yōu)選的檢測試劑盒由以下幾個部分組成CST1和/或其剪切子的捕獲物；一種使 CSTl和/或其剪切子及其捕獲試劑混合物可視化的方法；反應試劑以及使用說明書。其中 所述CSTl和/或其剪切子的捕獲物包括至少一對能特異性結合CSTlmRNA和/或CSTl剪 切子的引物和/或一條至少與部分CSTlmRNA和/或CSTl剪切子互補的寡聚核苷酸。其中 所述CSTl和/或其剪切子的捕獲物也可以包括至少一對能特異性結合CSTl cDNA和/或 CSTl剪切子cDNA的引物和/或一條至少與部分CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA互補 的寡聚核苷酸。所述使CSTl和/或其剪切子及其捕獲試劑混合物可視化的方法，包括瓊 脂糖凝膠電泳、酶聯(lián)凝膠法(enzyme-linked gel assay, ELGA)、電化學發(fā)光技術 (electroluminescence，ECL)、原位雜交技術(in situ hybridization，ISH)、熒光檢測法。 可以按照如下步驟進行檢測從受試者處獲得樣品；檢測樣品中CSTlmRNA和/或其剪切子 水平；檢測結果與對照樣本中CSTl水平比較，從而判斷受試者胃腸狀況。所述的樣品包括 手術組織、鏡檢組織、淋巴結組織、骨髓、血清樣品、血漿樣品、尿樣、血樣、全血樣品、血液級 分樣品。對照樣品，包括正常人樣品、患者治療的不同階段的樣品。受試者胃腸狀況可以分 為正常、炎、癌，改善、未改善，治療措施有效、無效。本發(fā)明的檢測試劑盒可以用實際場所如醫(yī)院、診所、私人住宅。本發(fā)明人經過深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)CSTl第一個剪切子表達水平的改變與胃腸 癌癥或胃腸癌癥組織轉移密切相關。具體的，CSTl基因表達的上調與胃腸癌癥或胃腸癌癥 組織轉移密切相關。因此可以通過檢測CSTl基因表達(特別是CSTl mRNA表達)來診斷 胃腸癌癥或胃腸癌癥組織轉移。CSTl基因是半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，其含有兩個個剪切子，三個外顯 子。本發(fā)明人通過對大量的胃癌、腸癌或胃癌、腸癌組織轉移患者的組織進行研究，并與胃 炎、腸炎患者的組織或正常對照等進行比較，從而有力的證實了 CSTl基因與胃癌、腸癌或 胃癌、腸癌組織轉移的相關性。在本發(fā)明的實施例中，首先，本發(fā)明人比較了人體不同組織 中CSTl mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)除唾液腺外，人體正常組織中CSTl均低度表達，因此對于CSTl 用于病理條件下檢測極為有利。然后，本發(fā)明人比較已經報道的CST1，2，4 ；CSTl ；CST2 ；CST4在胃癌、腸癌和對應癌旁中的表達量差異，發(fā)現(xiàn)CSTl在胃癌和癌旁以及腸癌和癌旁 中的表達量差異最大，其次是CST4，均優(yōu)于報道的CST1，2，4。然后，本發(fā)明人分別比較了 胃癌與癌旁手術組織中CSTl兩種剪切方式(splicel、splice2)表達差異，發(fā)現(xiàn)第一種剪 切方式(splicel) (SEQ ID No 43)在癌與癌旁組織中的表達差異程度優(yōu)于第二中剪切方 式(spliCe2) (SEQ ID No 44)；接著，本發(fā)明人分別比較了胃癌與癌旁手術組織、胃癌與炎 /正常人胃鏡組織、胃癌轉移陽性淋巴結與陰性淋巴結、胃癌與炎/正常人血漿cell-free RNA CSTl第一個剪切子mRNA表達差異，發(fā)現(xiàn)胃癌中CSTl第一個剪切子mRNA的表達中位 數(shù)比癌旁組織高57. 5倍，胃鏡樣本高24倍，轉移樣本高11. 469倍，血漿Cell-freeRNA高 37. 18倍。本發(fā)明人還分別比較了腸癌與癌旁手術組織、腸癌與炎/正常人腸鏡組織、腸癌 轉移陽性淋巴結與陰性淋巴結、腸癌與炎/正常人血漿cell-free RNA CSTl第一個剪切子 mRNA表達差異，發(fā)現(xiàn)腸癌中CSTl第一個剪切子mRNA的表達中位數(shù)比癌旁組織高48. 95倍， 腸鏡樣本高約23倍，轉移樣本高11. 469倍，血漿Cell-free RNA高約20倍。因此，以CSTl 第一個剪切子作為診斷的標志物，靈敏度高(可高于95% )且特異性良好(可達100% )。因此，基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，可利用CSTl基因(1)進行胃癌或胃癌組織轉移 的鑒別診斷、和/或易感性分析；(2)評估相關人群的胃癌或胃癌組織轉移治療藥物、藥物 療效、預后，以及選擇合適的治療方法；(3)早期評估相關人群胃癌或胃癌組織轉移患病風 險，早期檢測早期預防；(4)進行腸癌或腸癌組織轉移的鑒別診斷、和/或易感性分析；(5) 評估相關人群的腸癌或腸癌組織轉移治療藥物、藥物療效、預后，以及選擇合適的治療方 法；(6)早期評估相關人群腸癌或腸癌組織轉移患病風險，早期檢測早期預防。本發(fā)明還提供了用于檢測胃腸癌癥或胃腸癌癥組織轉移的試劑。所述試劑可以 是CST1基因或轉錄本的特異性(與人類其它基因沒有序列重復或互補)引物；或CSTl基 因或轉錄本的特異性(不識別人類其它基因)探針；或表面固定有所述探針的芯片。作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述的試劑是引物和探針，所述的引物是針對CSTl基因 外顯子的引物和探針，更佳的是針對CSTl第一個剪切子外顯子一的引物和探針；或針對 CSTl第一個剪切子外顯子二、三的引物和探針。作為本發(fā)明的更優(yōu)選的方式，所述的引物和探針是針對CSTl第一個剪切子外顯 子一的引物和探針，該引物和探針能僅識別CSTl第一個剪切子，與CSTl第二個剪切子及人 類其它基因均不會互補結合。所述的特異性引物是具有SEQ ID No :1和SEQ ID No:2，探 針為SEQ ID No:3。所述的引物和探針特異性好，擴增效果良好。本發(fā)明還提供一種檢測胃腸癌癥或胃腸癌癥組織轉移的試劑盒，所述的試劑盒比 已有的胃腸癌癥檢測試劑盒具有更好的特異性和選擇性。所述的試劑盒中含有用于檢測 胃腸癌癥或胃腸癌癥組織轉移的試劑。所述的試劑可以是CST1基因或轉錄本的特異性引 物；或CSTl基因或轉錄本的特異性探針；或同時包括引物和探針。通常，所述的試劑存在于 適當?shù)娜萜髦小？墒褂孟♂寗┤缛ルx子水將每種所述的引物和探針調整到至少一種需要量 的濃度，分裝于容器中。為了便于進行分析和比對，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還含有胃腸 癌細胞株和不表達CSTl的細胞株分別作為陽性和陰性參照品和制備標準曲線所用的標準
P
ΡΠ O此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取核酸的試劑，用于PCR的試劑，用于染色
8或顯色的試劑等。例如，這些試劑包括但不限于抽提液、擴增液、雜交液、顯色液、洗液等。此外，所述的試劑盒中還可包括描述胃腸癌癥診斷、動態(tài)檢測以及預后判斷的說 明書和/或芯片圖像分析軟件等。本發(fā)明所述的試劑盒可包含適于實用(如針對不同的檢測方法)的多種不同試 劑，并不限于目前所列舉的試劑，只要是基于CSTl基因或轉錄本的檢測來進行胃腸癌癥診 斷、動態(tài)檢測以及預后判斷的產品均包含在本發(fā)明范圍內。所述的試劑也可以是CSTl基因或轉錄本的特異性識別探針或表面固定有所述的 芯片。探針或芯片的制備方法是本領域的常規(guī)技術，制備方法例如可參照王申五主編的 《基因診斷技術_非放射性操作手冊》；J. L. erisi，V. R. iyer，P. 0. BROWN. Exploring the metabolicand genetic control of gene expression on a genomic scale. Science, 1997 ；278 :680。所述的針對CSTl基因或轉錄本的特異性識別探針，包括但不限于TaqMan水解探 針、MGB探針、雜交探針、分子信標等。檢測受試者組織樣品中CSTl基因或轉錄本的表達的方法優(yōu)選的是Real-time PCR方法。本發(fā)明優(yōu)選方案是Real-time PCR方法檢測診斷受試者的胃腸疾病，監(jiān)控受試者 的胃腸疾病，監(jiān)控受試者胃腸疾病治療效果，受試者癌癥分期或樣品中CSTlmRNA水平。本發(fā)明試劑盒所針對的受試者可以為胃腸不適就醫(yī)者，且檢測包括對受試者進行 篩查以檢測胃腸癌癥。本發(fā)明試劑盒所針對的受試者可以為慢性胃炎、腸炎患者，且檢測包括對受試者 進行篩查以檢測胃腸癌癥。本發(fā)明試劑盒所針對的受試者可以為有家族性胃腸癌癥者，且檢測包括對受試者 進行篩查以檢測胃腸癌癥。一種檢測方法是獲得組織樣品，從所述組織樣品分離RNA ；使用CSTl特異性引物 和探針從RNA樣品中擴增cDNA拷貝，量化擴增的cDNA拷貝，使用量化的擴增cDNA拷貝來 評估胃腸疾病進展或治療效果。檢測CSTl mRNA表達的方法還有很多種，，包括但不限于基于核酸序列擴增法 ((Nucleic Acid based Amplificatin,NASBA)的體外 RNA擴增技術。當然，RNA體外擴增技 術不限于NASBA，其它已知的RNA擴增方法和即刻的方法和試劑盒也是可用的。非限制性的 例子有多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)，擴增產物通過Beacon方法用 熒光探針在均勻相中被檢測，或產物可通過熒光或測熱法(fluorescent orcalorimetric method)在固相中被檢測。根據當前發(fā)明檢測和/或定量靶基因RNA，多種熒光、側熱或酶 法可以被應用。最佳的是，基于特殊熒光探針的實時PCR技術，其中熒光探針可以是標記 了熒光的特異互補于CSTl的序列，也可以是非特異性的雙核苷酸染料，包括但不限于SYBR Green, Eve Green，LC Green 等。組織樣品的獲得是本領域的常規(guī)技術，優(yōu)選可選擇非侵入性或具有最低程度侵入 性的方法獲得。所述的組織樣品可以是(但不限于)外周血、血清、血漿、唾液、胃液、腸道 分泌物、骨髓、淋巴結、腹腔清洗液、尿樣等。根據本發(fā)明所述的檢測試劑盒可用于實際場所，包括但不限于醫(yī)院診所以及私人住宅。此外，還可應用多變量統(tǒng)計學分析，將待測樣品的數(shù)據與對照數(shù)據比較，有利于作出 關于胃腸癌癥診斷、進展或治療效果的判斷。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1、首次發(fā)現(xiàn)并證實CSTl基因與胃腸癌癥診斷、動態(tài)監(jiān)測以及預后判斷具有密切 相關性，并且證實CSTl第一個剪切子在胃腸癌癥診斷、動態(tài)監(jiān)測以及預后判斷方面更具有 優(yōu)越性，驗證的樣本量多，結果準確。該相關性的提出為胃腸癌癥診斷、動態(tài)監(jiān)測以及預后 判斷提供了新的途徑。2、開發(fā)了適合于胃腸癌癥診斷、動態(tài)監(jiān)測以及預后判斷的試劑或試劑盒，檢測靈 敏度良好。


下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述圖1為CSTl與Pmdl8_T重組質粒圖譜；圖2為CSTl在人體正常組織中的表達情況(芯片)，所述組織包括扁桃體、垂體 后葉、甲狀腺、唾液腺、骨骼肌、骨髓、除去紅細胞和血小板的外周血、肺、胃、肝臟、心臟、腎、 腎上腺、腸、結腸、胰臟脾臟、膀胱、前列腺、卵巢、子宮、胎盤、睪丸以及腸癌細胞株SW480， Caco2，LOVO, HCT16，胃癌細胞株NCI-N87，人胃上皮細胞株GES-1 ；圖3為染料法實時定量PCR給出的CSTl，2，4 ;CST1 ；CST2 ;CST4在20對胃癌和癌 旁組織中的表達量差異；圖4a為染料法實時定量PCR給出的20對胃癌、癌旁組織中ACTB CP值；圖4b為染料法實時定量PCR反映的是CSTl第一種剪切方式(splicel)、第二種剪 切方式(splice2)在20對胃癌、癌旁組織中癌旁的CP值與對應癌組織的CP之差的中位數(shù) 比較；圖5為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個剪切子在100例胃癌和
癌旁組織中的表達量分布；圖6為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個剪切子在36例胃癌以及 29例胃炎胃鏡表中的表達量分布；圖7為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個剪切子在20枚胃癌病理 陽性淋巴結，15枚病理陰性淋巴結中表達量分布；圖8為通過Real-time PCR絕對定量法檢測外周血游離胃癌細胞的準確度與細胞 學檢測的對比；圖9為通過Real-time PCR絕對定量法檢測胃癌骨髓轉移的準確度與細胞學檢測 的對比；圖IOa為通過Real-time PCR絕對定量法，胃癌病人(50例)血漿Cell-free RNA 中CSTl第一個剪切子量與炎(30例)/正常人(30例)的差異；圖IOb為通過Real-time PCR絕對定量法獲得的ROC曲線，區(qū)分胃癌/炎/正常 的敏感性和特異性；圖11為通過連接酶鏈反應(Ligase chain reaction, LCR)方法，胃癌病人(50 例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎(30例)/正常人(30例)的差異；
圖 12 為通過適溫鏈置換反應(thermophilic strand displacement amplification, tSDA)方法，胃癌病人(50例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子 量與炎(30例)/正常人(30例)的差異；圖 13 為通過核酸序列擴增法(Nucleic Acid based Amplif icatin，NASBA)，20 例 胃癌，10例胃炎，10例正常人尿樣中CSTl第一個剪切子量的表達差異。圖 14 為通過轉錄介導的擴增(Transcription-mediated amplification, TMA), 檢測50例胃癌(ρ Μ分期，Ι+ΙΙ 30例，III+IV50例)不同分期CSTl第一個剪切子表達量
的差異。圖15為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個剪切子在100例腸癌和
癌旁組織中的表達量分布。圖16為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個剪切子在36例腸癌以 及29例腸炎腸鏡組織表中的表達量分布。圖17為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個剪切子在20枚腸癌病 理陽性淋巴結，15枚病理陰性淋巴結中表達量分布。圖18a為通過Real-time PCR絕對定量法，腸癌病人(50例)血漿Cell-free RNA 中CSTl第一個剪切子量與炎(30例)/正常人(30例)的差異。圖18b顯示了通過Real-time PCR絕對定量法得到的ROC曲線，區(qū)分胃癌/炎/ 正常的敏感性和特異性。圖 19 為通過核酸序列擴增法(Nucleic Acid based Amplif icatin，NASBA)，30 例 腸癌，20例腸炎，20例正常人尿樣中CSTl第一個剪切子量的表達差異。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中為注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份 數(shù)按重量計算。材料和方法實施例中所用標本均與病人簽署知情同意書后按醫(yī)院規(guī)定途徑獲取。內鏡下獲取的病理部位標本和非病理部位樣本作為對比，也可是非鏡檢方式如手 術或胃腸壁擦拭法獲取的細胞、手術中獲取的淋巴結等樣本應立即提取RNA或置于液氮或 RNAlater (Ambion公司產品)中保存。外周血、骨髓或尿液樣本首先通過離心機4000rpm，4°C，離心20分鐘，取上清， 13000rpm，4°C，離心10分鐘，分離上清和沉淀，立即提取RNA或置于_20°C至_80°C保存。TaqMan水解探針的Real-time PCR法上述樣本用商業(yè)化的核酸抽提方法進行， 一個常用的非限制性例子是酚/氯仿抽提方法，如用Invitrogen公司生產的Trizol方 法抽提總RNA，并進行RNA質量鑒定，相關方法可參照《分子生物學實驗》等參考書描述。 mRNA的逆轉錄過程采用商業(yè)化逆轉錄試劑盒并按操作說明書進行，所得cDNA按比例稀釋 成需要的工作濃度。所用特異性引物經優(yōu)化設計，CSTl的第一個剪切子的上下游引物設計
11在外顯子1上。制備包含CSTl第一個剪切子擴增子的重組質粒，所需的質粒為商業(yè)化的 Pegm-T (promega)(圖1)，上下游引物設計在外顯子1，2上。采用基于TaqMan水解探針的 Real-time PCR法進行CSTl第一個剪切子擴增。針對CSTl第一個剪切子的引物和探針，最優(yōu)的如下上游引物TCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQID No 1)下游引物TTATCCTATCCTCCTCCTTGG(SEQID No 2)探針5'-FAM-CTCCAGCTTTGTGCTCTGCCTCT-TAMRA-3' (SEQ ID No :3)擴增長度 為 141bp。針對制備包含CSTl第一個剪切子擴增子的重組質粒的引物，最優(yōu)的如下上游引物GGGCTCCCTGCCTCGGGCTCTCAC(SEQID No 22)下游引物ACGGTCTGTTGCCTGGCTCTTAGT(SEQID No 23)實驗組，陽性對照組，陰性對照組與重組質粒標準品一起擴增。依據重組質粒濃度 梯度和擴增后對應的CP (cross point)作標準曲線。依據該標準曲線給出實驗組、陽性對 照組和陰性對照組的拷貝數(shù)。染料法實時定量PCR 樣本處理同TaqMan水解探針的Real-time PCR法，CST1，2，4 引物，上游AGTCCCAGCCCAACTTGGA(SEQ ID No 24)下游GGGAACTTCGTAGATCTGGAAAGA (SEQ ID No 25) ；CSTl的第一種剪切子的上下游引物同TaqMan水解探針的Real-time PCR法；CSTl的第二種剪切子的上下游引物，上游GCACTGGGGAAGAGAGGCAT(SEQ ID No 26)下游AGGAGCAGCAGGGTACTCAGATA(SEQ ID No :27)CST2 弓丨物，上游 CAGAAGAAACAGTTGTGCTC (SEQ ID No :28)下游GGAGTAGGAGGTGGTCAG(SEQ ID No :29)CST4 引物，上游GCTCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQ ID No 30)下游TATCCTATTCTCCTCCTTGG (SEQ ID No 31)內參基因 β-actin，上游引物AAGATCATTGCTCCTCCTG(SEQ ID No:32)，下游引物: CGTCATACTCCTGCTTGC(SEQ ID No :33)。癌和癌旁組織目的基因和內參基因一起擴增，通過 2"(-Δ ACT)公式計算目的基因在癌和癌旁組織中的相對表達量。熒光染料如SYBR Green, Eve Green, LC Green 等。核酸序列擴增法(NucleicAcid based Amplif icatin, NASBA)的體外 RNA 擴增 技術T7RNA聚合酶，RNase H，禽骨髓白血病病毒(AMV)逆轉錄酶，核糖核苷酸(NTP)，脫氧 核糖核苷酸(dNTP)，CSTl的第一個剪切子的上下游引物同TaqMan水解探針的Real-time PCR法，RNA熒光染料(Ribo-Green fluorescent dye)。42度，2小時，可將RNA模板擴增 2" (9-12)，反應產物放入熒光檢測儀內檢測熒光強度(U)，從而反應初始模板量。實施例1.人體不同組織中CSTl的表達差異所用人體組織標本除正常胃黏膜，結腸黏膜組織為發(fā)明人從合作醫(yī)院收集外，其 它各組織均從商業(yè)化機構購買。采用Affymetrix的核苷酸芯片HG_U95Av進行各正常組織 CSTl mRNA表達比較，操作過程參照產品說明書。本實驗的相對表達量的值是通過管家基因 β -actin熒光值進行歸一化處理后的標準化信號值。結果如圖2所示，除唾液腺中CSTl表達量較高外，其它組織中CSTl不表達，說明 CSTlmRNA表達在正常組織中的背景值很低，這對CSTl用于病理條件下檢測極為有利。在胃 癌細胞株NCI-N87，結腸癌細胞株SW480，Caco2中過表達，在人胃上皮細胞GES-I，大腸癌細 胞株L0V0，HCTl 16中不表達，說明CSTl極有可能可作為胃癌，腸癌分子診斷的Marker。
實施例2.胃癌及癌旁手術組織樣本CSTl與CST1，2，4，CST2 mRNA表達量比較通過比較20對(G1-G20)胃癌及癌旁組織中CST1, CST1，2，4，CST2 mRNA表達量， 發(fā)現(xiàn)CSTl mRNA在胃癌和癌旁組織中表達量差異最大，結果見圖3。上述標本均通過病理證 明，采用染料法實時定量PCR。實施例3.胃癌、癌旁組織樣本中CSTl第一種剪切方式(splicel)，第二種剪切方 式(spliCe2)表達量差異通過手術取樣的樣本均經病理驗證后才進行RNA抽提和逆轉錄cDNA，采用染料 法實時定量PCR，首先檢測樣本中管家基因ACTB表達量，發(fā)現(xiàn)樣本ACTB中CP值基本一 致，如圖4a，也就是說樣本中總的cDNA量基本一致，然后比較了 CSTl第一種剪切方式 (splicel)，第二種剪切方式(spliCe2)在20對胃癌、癌旁組織中的癌旁的CP值與癌之差 的中位數(shù)，見圖4b，發(fā)現(xiàn)CSTl第一種剪切方式(splicel)在癌與癌旁中的表達量差異明顯 優(yōu)于splice2，也就是說CSTl第一種剪切方式(splicel)在判別是否為癌時，更具有優(yōu)越 性。實施例4.胃癌、癌旁及正常手術組織樣本CSTl的第一個剪切子(splicel)的表 達差異通過手術取樣的樣本均經病理驗證后才進行RNA抽提和逆轉錄cDNA， Real-timePCR絕對定量法鑒定CSTl第一個剪切子在胃癌、癌旁以及正常組織中的表達差 異，測試樣本數(shù)為100例。圖5的結果表明，胃惡性病理條件下特異性高表達CSTl的第一個剪切子mRNA，而 癌旁及正常組織低表達。癌拷貝的中位數(shù)是癌旁/正?？截愔形粩?shù)的57. 5倍，提示CSTl 的第一個剪切子mRNA可作為良好的胃癌分子標志物。在100. 68拷貝處劃線，可將癌與正 常區(qū)分開來，因此100. 68拷貝可作為胃癌臨床診斷的一個參考值。實施例5.胃鏡下取樣的胃癌、胃炎中CSTl的第一個剪切子的表達差異胃鏡下取樣與手術取樣的樣本具有較大差別，主要表現(xiàn)在取樣組織中胃癌細胞的 比例變動很大，有時可能僅占到整塊組織的很小一部分，有的甚至沒有。因此本發(fā)明人統(tǒng)計 比較了 36例胃癌以及36例胃炎病人胃鏡取樣標本中CSTl的第一個剪切子的表達差異，癌 標本拷貝數(shù)的中位數(shù)是炎標本拷貝數(shù)中位數(shù)的24倍，如果在98. 89拷貝處劃線，可以將癌 和炎區(qū)分開來，可為胃鏡下取樣胃癌診斷提供一參考值。結果見圖6，方法同樣采用Real-time PCR絕對定量的方法。實施例6. CSTl的第一個剪切子在胃癌轉移陽性淋巴結和陰性淋巴結中的表達差
已 升手術中獲得的經病理證明為胃癌轉移陽性的淋巴結20枚，且轉移灶大小不等。病 理陰性淋巴結15枚主要取自早期胃癌病人，原因是盡可能減少病理診斷陰性但實際有微 轉移存在的淋巴結，以避免實驗誤差。實驗采用Real-time PCR檢測方法，具體材料和過程 同實施例2。圖7的結果表明，CSTl的第一個剪切子在轉移陽性淋巴結中高表達，而在陰性淋 巴結中只有較低表達。轉移陽性淋巴結CSTl的第一個剪切子mRNA表達量是陰性淋巴結中 的11. 469倍。如果從98. 5拷貝處劃線，基本可區(qū)分胃癌轉移陽性和陰性淋巴結。病理陰 性淋巴結中有兩例檢出CSTl的第一個剪切子弱陽性的淋巴結，經病理醫(yī)師連續(xù)切片細致觀察，鑒定有微轉移的存在。因此，從CSTl的第一個剪切子mRNA表達程度劃分不僅100% 區(qū)分了細胞學檢測結果，而且能檢測細胞血不能檢出的有微轉移存在的淋巴結，相比細胞 學檢測該檢測方法具有更高的靈敏度。實施例7.定量PCR檢測外周血中游離胃癌細胞的準確度與細胞學檢測對比除去紅細胞和血小板的外周血有核細胞提取RNA，經Real-time PCR方法定量檢 測CSTl的第一個剪切子mRNA表達水平，通過和胃炎病人和正常人表達量的對比，判斷胃癌 患者的外周血中是否有游離胃癌細胞的存在，并和細胞學檢測比對。圖8的結果表明，本發(fā)明的檢測方法100%確認細胞學鑒定的陽性結果，同時可檢 測出細胞學鑒定胃陰性的病例中有部分轉移病例，說明該方法比細胞學檢測具有更高的靈 敏度，能檢測到細胞學無法檢測的微轉移的存在。實施例8.定量PCR方法檢測胃癌骨髓轉移與細胞學檢查結果對比穿刺等方法獲得的胃癌患者骨髓經Real-time PCR方法定量檢測CSTl的第一個 剪切子mRNA表達水平，通過和正常骨髓的比較判斷CSTl的第一個剪切子mRNA是否高表 達，確認骨髓是否存在轉移和微轉移，并與細胞學結果進行了比較。圖9的結果表明，本發(fā)明的檢測方法可95%確認細胞學陽性結果，同時陽性率高 于細胞學結果，表明敏感性比細胞學檢測方法要高。實施例9.胃癌病人血漿Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎/正常人的
差異應用商品化的試劑盒，抽提血漿中Cell-free RNA, Real-time PCR檢測胃癌病人 (50例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎(30例)，正常人(30例)的差
已 升。結果如圖10所示，圖IOa顯示CSTl第一個剪切子在癌中拷貝數(shù)的中位數(shù)是炎/正 常的約20倍，在拷貝數(shù)13. 972處劃線，可將癌和炎/正常區(qū)分開來。圖IOb的ROC曲線顯 示基于CSTl第一個剪切子表達量診斷胃癌的方法具有較高的靈敏度和特異性，因此CSTl 可作為非侵入性的血漿樣本胃癌診斷的特異性Marker。實施例10.連接酶鏈反應(Ligase chain reation, LCR)方法檢測胃癌病人血樣 Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎/正常人的差異應用商品化的試劑盒，抽提血漿中Cell-free RNA, Real-time PCR檢測胃癌病人 (50例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎(30例)，正常人(30例)的差
已結果如圖11所示，CSTl第一個剪切子在癌中相對熒光強度(relative light units, RLU)的中位數(shù)是炎/正常的約19倍，在相對熒光強度13. 66RLU處劃線，可將癌和 炎/正常區(qū)分開來。實施例11 適溫鏈置換擴增(thermophilic strand displacement amplification, tSDA)方法胃癌病人血樣Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎/正 常人的差異應用商品化的試劑盒，抽提血漿中Cell-free RNA, Real-time PCR檢測胃癌病人 (50例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎(30例)，正常人(30例)的差
巳 ^to
14
結果見圖12，CSTl第一個剪切子在癌中相對熒光強度(relative light units, RLU)的中位數(shù)是炎/正常的約19倍，在相對熒光強度12. 44RLU處劃線，可將癌和炎/正常 區(qū)分開來。實施例12.胃癌病人尿樣Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎/正常人 的差異應用商品化的試劑盒，抽提尿液中Cell-free RNA，熒光檢測的核酸序列擴增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)檢測胃癌病人(20 例)尿樣 Cell-free RNA 中CSTl第一個剪切子量與炎(10例)，正常人(10例)的差異。結果如圖13所示，CSTl第一個剪切子在癌中熒光強度的中位數(shù)是炎/正常的約7 倍，在14. 329U處劃線，可將癌和炎/正常區(qū)分開來，即可作為非侵入性的尿液樣本胃癌診 斷的一個參考值。實施例13. CSTl第一個剪切子表達量與胃癌pTW分期的關系應用商 品化的試劑盒，抽提血漿中Cell-free RNA,應用Gen-probe轉錄介導的擴增 (Transcription-Mediated amplification, TMA)方法，檢測 50例胃癌(pTNM分期，I+II 30 例，III+IV50例)不同分期CSTl第一個剪切子表達量的差異。結果見圖14，CSTl第一個剪切子在胃癌I+II中相對熒光強度(relative light units, RLU)的中位數(shù)是III+IV的2. 1倍，在相對熒光強度(relative light units, RLU) 12. 44RLU處劃線，可將癌和炎/正常區(qū)分開來。實施例14.大腸癌及癌旁手術組織樣本CSTl的第一個剪切子的表達差異通過手術取樣的樣本均經病理驗證后才進行RNA抽提和逆轉錄cDNA， Real-timePCR絕對定量法鑒定CSTl第一個剪切子在大腸癌和癌旁組織中的表達差異，測 試樣本數(shù)為100對。圖15的結果表明，結腸惡性病理條件下特異性高表達CSTl的第一個剪切子mRNA， 而癌旁的正常組織低表達。癌拷貝的中位數(shù)是癌旁拷貝中位數(shù)的48. 95倍，提示CSTl的第 一個剪切子mRNA可作為良好的腸癌分子標志物。在77. 7拷貝處劃線，可將癌與正常區(qū)分 開來，因此77. 7拷貝可作為大腸癌臨床診斷的一個參考值。實施例15.腸鏡下取樣的腸癌、腸炎中CSTl的第一個剪切子的表達差異。腸鏡下取樣與手術取樣的樣本具有較大差別，主要表現(xiàn)在取樣組織中腸癌細胞的 比例變動很大，有時可能僅占到整塊組織的很小一部分，有的甚至沒有。因此本發(fā)明人統(tǒng)計 比較了 36例腸癌以及36例腸炎病人腸鏡取樣標本中CSTl的第一個剪切子的表達差異，癌 標本拷貝數(shù)的中位數(shù)是炎標本拷貝數(shù)中位數(shù)約23. 1倍，如果在87. 5拷貝處劃線，可以將癌 和炎區(qū)分開來，可為腸鏡下取樣胃癌診斷提供一參考值。結果見圖16，方法同樣采用Real-time PCR絕對定量的方法。實施例16. CSTl的第一個剪切子在腸癌轉移陽性淋巴結和陰性淋巴結中的表達 差異手術中獲得的經病理證明為腸癌轉移陽性的淋巴結20枚，且轉移灶大小不等。病 理陰性淋巴結15枚主要取自早期腸癌病人，原因是盡可能減少病理診斷陰性但實際有微 轉移存在的淋巴結，以避免實驗誤差。實驗采用Real-time PCR檢測方法，具體材料和過程 同實施例2。
圖17的結果表明，CSTl的第一個剪切子在轉移陽性淋巴結中高表達，而在陰性淋 巴結中只有較低表達。轉移陽性淋巴結CSTl的第一個剪切子mRNA表達量是陰性淋巴結中 的11. 469倍。如果從100拷貝處劃線，基本可區(qū)分腸癌轉移陽性和陰性淋巴結。病理陰性 淋巴結中有兩例檢出CSTl的第一個剪切子弱陽性的淋巴結，經病理醫(yī)師連續(xù)切片細致觀 察，鑒定有微轉移的存在。因此，從CSTl的第一個剪切子mRNA表達程度劃分不僅100%區(qū) 分了細胞學檢測結果，而且能檢測細胞血不能檢出的有微轉移存在的淋巴結，相比細胞學 檢測該檢測方法具有更高的靈敏度。實施例17.腸癌病人血漿Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎/正常人 的差異應用商品化的試劑盒，抽提血漿中Cell-free RNA, Real-time PCR檢測腸癌病人 (50例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎(30例)，正常人(30例)的差
已 升。結果如圖18所示，圖18a顯示CSTl第一個剪切子在癌中拷貝數(shù)的中位數(shù)是炎/正 常的約20倍，在拷貝數(shù)13. 89處劃線，可將癌和炎/正常區(qū)分開來。圖18b的ROC曲線顯 示基于CSTl第一個剪切子表達量診斷腸癌的方法具有較高的靈敏度和特異性，因此CSTl 可作為非侵入性的血漿樣本腸癌診斷的特異性Marker。實施例18.腸癌病人尿樣Cell-free RNA中CSTl第一個剪切子量與炎/正常人 的差異應用商品化的試劑盒，抽提尿液中Cell-free RNA，熒光檢測的核酸序列擴增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)檢測腸癌病人 C30 例)尿樣 Cell-free RNA 中CSTl第一個剪切子量與炎(20例)，正常人(20例)的差異。結果如圖19所示，CSTl第一個剪切子在癌中拷貝數(shù)的中位數(shù)是炎/正常的約7 倍，在拷貝數(shù)16. 96U處劃線，可將癌和炎/正常區(qū)分開來，即可作為非侵入性的尿液樣本腸 癌診斷的一個參考值。實施例19. CSTl第一個剪切子表達量用于胃癌、腸癌治療過程中動態(tài)監(jiān)測應用實時定量PCR方法，通過檢測病人血液中CSTl第一個剪切子表達量，實時監(jiān) 測胃癌化療病人3人，放療病人2人，腸癌化療病人3人，放療2人，治療效果。結果見表1，治療有效的病人CSTl第一個剪切子表達量隨著療程的增加逐漸降 低，影像學結果也顯示，腫塊逐漸減小；而治療無效的病人CSTl第一個剪切子表達量隨著 療程的增加逐漸增加，影像學結果顯示，腫塊有變大的趨勢。因此，CSTl第一個剪切子可作 為胃癌、腸癌患者治療過程中一個動態(tài)監(jiān)測的指標。表1為通過實時定量PCR檢測放化療過程中胃腸腫瘤患者血液中CSTl第一個剪
切子的量
1權利要求
一種用于預示和診斷胃腸腫瘤的檢測方法，其特征在于所述方法包括(1)獲得待測樣品；(2)檢測選自下列的編碼mRNA的基因在待測樣品中是否過表達；所述基因選自i)對應于SEQ ID No39的CST1基因；或ii)特異性識別選自CST1基因的mRNA、CST1剪切子、CST1基因或CST1基因剪切子的cDNA的其中一種的引物或探針所識別的基因；或iii)通過至少一種CST1引物對應的擴增子所鑒定的基因；當基因表達水平超過預定閾值時則預示胃腸腫瘤容易產生或已經形成。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟(2)中引物選自對應于SEQ ID No :1 2或SEQ ID No :4 21中至少之一的引物；所述探針為對應于SEQ ID No:3序 列的探針。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述引物為對應于SEQIDNo :1和SEQ ID No 2的引物對，所述探針為對應于SEQ ID No 3的探針。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述CSTl基因或剪切子的引物對應的擴 增子的擴增方法選自聚合酶鏈反應法、實時定量PCR法、轉錄介導的擴增法、連接酶鏈反應 法、適溫鏈置換擴增法、基于核酸序列的擴增方法。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述獲得對應于SEQID No:43的CSTl 基因第一個剪切子的引物相對應的擴增子為CSTl基因第一個剪切子的引物通過實時定量 PCR法進行擴增而得。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述CSTl第一個剪切子的擴增子為對應于 SEQ ID No 45的擴增子。
7.一種用于預示或檢測胃腸腫瘤的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括用于捕獲對應 于SEQ ID No 39的CSTl基因或對應于SEQ ID No :43的CSTl基因第一個剪切子的引物或 探針。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括使對應于SEQID No 39的CSTl基因或對應于SEQ ID No 43的CSTl基因第一個剪切子的引物相對應的擴增子 可視化的反應試劑；所述反應試劑包括通過選自瓊脂糖凝膠電泳、酶聯(lián)凝膠法、電化學發(fā)光 技術、原位雜交技術、熒光檢測法使CSTl基因或CSTl基因第一個剪切子的引物對應的擴增 子可視化的試劑。
9.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括陽性參照品的胃癌細胞 株、作為陰性參照品的正常的胃細胞株、標準品、核酸提取試劑、逆轉錄試劑、聚合酶鏈反應 試劑、對應于SEQ ID No :1 2的引物對和對應于SEQ ID No 3的探針。
10.一種用于預示或檢測胃腸腫瘤的基因芯片，其特征在于所述基因芯片包括用于捕 獲對應于SEQ ID No :39的CSTl基因或對應于SEQ ID No :43的CSTl基因第一個剪切子的 引物或探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于預示和診斷胃腸腫瘤的檢測方法及其試劑盒和基因芯片，該方法包括以下步驟(1)獲取待測樣品；(2)檢測選自下列編碼mRNA基因在樣品中是否過表達，所述基因為具有SEQ ID No39的CST1基因；或特異性識別CST1基因的mRNA、CST1剪切子(SEQ ID No43，SEQ ID No44)、CST1基因的cDNA、CST1剪切子的cDNA的其中一種的引物或/和探針所識別的基因；或通過至少一種CST1引物對應的擴增子所鑒定的基因。該方法可應用于胃腸癌癥診斷、動態(tài)監(jiān)測以及預后判斷方面，該方法具有驗證的樣本量多，結果準確可靠、靈敏度高等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101985651SQ20101016068
公開日2011年3月16日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權日2010年4月30日
發(fā)明者渠香云, 王弢, 陳菲 申請人:蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司