專利名稱：一種苯酚羥化酶基因工程菌轉(zhuǎn)化吲哚制備靛藍(lán)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及將苯酚羥化酶基因重組于大腸桿菌體內(nèi)形成 工程菌，用于轉(zhuǎn)化吲哚制備靛藍(lán)的方法。
背景技術(shù)：
靛藍(lán)是一種具有四千多年歷史的色素，廣泛用于印染、醫(yī)藥和食品工業(yè)。從1890 年起，化學(xué)合成靛藍(lán)逐漸取代了植物提取靛藍(lán)，但在化學(xué)合成過程中使用的原料和催化劑 對操作者的呼吸道、中樞神經(jīng)及肝臟有一定的損害，甚至有潛在的致癌毒性，還會產(chǎn)生含有 大量氯化鐵、硫酸鐵、硫酸鈉、氯化鈉、苯胺和硝基苯等有毒物質(zhì)的漂洗廢水，對環(huán)境有嚴(yán)重 的污染。生物法制備靛藍(lán)可以簡化工藝，防止環(huán)境污染。1983年，美國Texas大學(xué)微生物系 和應(yīng)用微生物學(xué)中心的Ens ley等利用遺傳工程技術(shù)，將假單胞菌P. put i da PpG7質(zhì)粒NAH7 中的片段克隆重組后轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coliHBlOl)，轉(zhuǎn)化子能夠在存在吲哚或 色氨酸的條件下合成靛藍(lán)。構(gòu)建高效的基因工程菌可以提高對芳香化合物的轉(zhuǎn)化效率，它 為解決野生菌活性低等問題提供了嶄新的途徑。1997年Doukyu等利用假單胞菌ST-200的加氧酶在兩相系統(tǒng)中進(jìn)行生物合成靛 藍(lán)，當(dāng)加入體積分?jǐn)?shù)為20%的二苯甲烷時，假單胞菌對吲哚的最大耐受量為4mg/mL，靛藍(lán) 的生成量僅為5 u g/mL。2000年，Li等利用色素細(xì)胞P450Ph87Leul88Ala74的純酶轉(zhuǎn)化吲 哚，只有當(dāng)NADPH存在時，該酶才能將吲哚轉(zhuǎn)化靛藍(lán)，NADPH是一種輔酶，通常作為生物合成 的還原劑，但其價格昂貴，不適于實際應(yīng)用?，F(xiàn)有的關(guān)于苯酚羥化酶制備靛藍(lán)的研究，涉及的酶資源較為單一，而且多集中在 轉(zhuǎn)化基因和轉(zhuǎn)化機理方面，實際應(yīng)用研究有限。2005年，Kim等從Pseudomonas sp. KL33 得到苯酚羥化酶的基因，將該基因重組于大腸桿菌體內(nèi)形成的工程菌，可以將吲哚轉(zhuǎn)化為 靛藍(lán)，其轉(zhuǎn)化反應(yīng)為將全細(xì)胞懸浮于50mmol/L磷酸緩沖溶液，并加入20mmol/L葡萄糖和 lmmol/L底物，反應(yīng)時間為48h，反應(yīng)速度較慢，效率低，產(chǎn)物濃度為19mg/L。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種苯酚羥化酶基因工程菌轉(zhuǎn)化吲哚制備靛藍(lán) 的方法，通過構(gòu)建苯酚羥化酶基因工程菌，用來轉(zhuǎn)化吲哚得到靛藍(lán)類色素物質(zhì)，實現(xiàn)生物法 制備靛藍(lán)，產(chǎn)物濃度高，周期短，生產(chǎn)清潔。本發(fā)明的技術(shù)方案如下苯酚羥化酶基因工程菌，是通過獲取高效苯酚降解菌Arthrobacter sp. ffl中總長 5490bp的苯酚羥化酶基因全長序列，連接至載體質(zhì)粒(pET28a(+) Vector)，并轉(zhuǎn)化至宿主 細(xì)胞大腸桿菌中構(gòu)建的；該苯酚羥化酶基因工程菌經(jīng)擴大培養(yǎng)即得全細(xì)胞培養(yǎng)物，作為全 細(xì)胞催化劑對吲哚進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到的產(chǎn)物為靛藍(lán)類物質(zhì)。高效苯酚降解菌Arthrobacter sp. ffl是從石化公司污水處理系統(tǒng)二沉池污泥中篩選到的，該菌株的16SrDNA序列的GenBank注冊號為EU339930。通過PCR反應(yīng)，擴增獲得 高效苯酚降解菌Arthrobacter sp. W1的苯酚羥化酶基因保守區(qū)序列，并采用染色體步移法 獲取未知的側(cè)翼序列，得到含有6個閱讀框、按KLMN0P六組分順序排列的5490bp苯酚羥化 酶基因，其Genbank注冊號為FJ610336。將編碼苯酚羥化酶的各組分基因序列翻譯成氨基 酸，利用BLASTX程序進(jìn)行同源序列分析，結(jié)果顯示，該苯酚羥化酶各組分的氨基酸序列與 其他已知的苯酚羥化酶的氨基酸序列相似性較低。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時，反應(yīng)液中苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞干重濃度為1 2g/L， 吲哚濃度為100 600mg/L，葡萄糖的濃度為0. 5 2mmol/L，在20 40°C溫度下，搖床轉(zhuǎn) 速為50 200r/min，振蕩反應(yīng)2 14小時。上述生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最佳參數(shù)為苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞干重濃度為 1. 2 1. 5g/L，吲哚濃度為150 250mg/L，葡萄糖濃度為1 1. 5mmol/L，在25 35°C溫 度下，搖床轉(zhuǎn)速為100 180r/min，振蕩反應(yīng)時間為4 8小時。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)前的苯酚羥化酶基因工程菌擴大培養(yǎng)按常規(guī)條件進(jìn)行。首先將苯 酚羥化酶基因工程菌接種到固體平板LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)(即平板活化種子)，再將其接種到 液體LB培養(yǎng)基中，制得種子培養(yǎng)液，然后按體積百分比2 5%的接種量接入液體LB培養(yǎng) 基中振蕩培養(yǎng)，待菌體生長至對數(shù)期0D6QQ = 0. 4 0. 6，加入80 100 ill (8 lOmmol/ L)的IPTG，誘導(dǎo)至0D_ =1.0-1.2,離心收集菌體，經(jīng)pH值為7. 0 7. 5、濃度為0. 1 0. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液懸浮，使其干重濃度達(dá)到1 2g/L。本發(fā)明的苯酚羥化酶基因工程菌對吲哚的轉(zhuǎn)化能力較強，且具有廣泛的底物廣譜 性。使用本發(fā)明的苯酚羥化酶基因工程菌生物轉(zhuǎn)化吲哚生成靛藍(lán)的方法，反應(yīng)條件溫和，環(huán) 境污染小，產(chǎn)物濃度高，可達(dá)到92. 5mg/L，生產(chǎn)周期短，成本低，提取步驟簡單，生產(chǎn)清潔，適 合工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用。


圖1為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)選定其他參數(shù)時，靛藍(lán)濃度隨苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞 濃度變化的曲線。圖中縱坐標(biāo)為生成的靛藍(lán)濃度(mg/mL)，橫坐標(biāo)為苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞 干重濃度(g/L)。圖2為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)選定其他參數(shù)時，靛藍(lán)濃度隨反應(yīng)時間變化的曲線。圖中縱坐標(biāo)為生成的靛藍(lán)濃度(mg/mL)，橫坐標(biāo)為時間(h)。圖3為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)選定其他參數(shù)時，靛藍(lán)濃度隨吲哚濃度變化的曲線。圖中縱坐標(biāo)為生成的靛藍(lán)濃度(mg/L)，橫坐標(biāo)為吲哚濃度(mg/L)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例1，苯酚羥化酶基因工程菌生物轉(zhuǎn)化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)，并考察部分參數(shù)對靛藍(lán) 濃度的影響。苯酚羥化酶基因工程菌擴大培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基配方為10g/L NaCl, 10g/L蛋白胨， 5g/L酵母提取物，調(diào)節(jié)pH至7. 0 7. 2。121°C條件下滅菌20min，培養(yǎng)基冷卻后添加終濃度為10 20mmol/L卡那霉素作為抗生素。固體平板培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加 15 20g/L瓊脂。步驟和參數(shù)如下1、將苯酚羥化酶基因工程菌接種固體平板LB培養(yǎng)基上，于37 °C靜置培養(yǎng)2天，4。C 冰箱保存，作為平板活化種子；2、用步驟1所得的平板活化種子，接種到液體LB培養(yǎng)基中，在30°C條件下，150r/ min振蕩培養(yǎng)12小時，制得種子培養(yǎng)液；3、使用步驟2所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比2 5%的接種量接入液體LB培 養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌體生長至對數(shù)期0D6QQ = 0. 4 0. 6，加入80 100 ill (8 lOmmol/ L)的IPTG，誘導(dǎo)至0D_ =1.0-1.2,離心收集菌體，經(jīng)pH值為7. 0 7. 5、濃度為0. 1 0. 2mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后用相同緩沖液懸浮，使其干重濃度為1. 4g/L。4、制備吲哚/丙酮溶液(0. lg吲哚溶于lmL丙酮)，然后用濾膜過濾除菌，吲哚/ 丙酮溶液中吲哚濃度為lX105mg/L ；5、制備葡萄糖儲備液，取180. 16g葡萄糖溶于1L去離子水，儲備液中葡萄糖濃度 為 lmol/L06、在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞，步 驟4制備吲哚/丙酮溶液40 u L，步驟5制備葡萄糖儲備液26 u L，使反應(yīng)液中吲哚的濃度 為200mg/L，葡萄糖的濃度為1. 3mmol/L，在30°C下，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，振蕩反應(yīng)6小時。高效液相色譜(HPLC)測定靛藍(lán)產(chǎn)量反應(yīng)結(jié)束時，上清液用三氯甲烷萃取，并用 0.22UM的有機濾膜過濾，利用Agilent 1100高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，檢測波長280nm， 流速1. OmL/min,進(jìn)樣量為10 u L，柱溫為室溫；流動相A為甲醇，流動相B為超純水。每個 樣品的測定時間為35min，其中第1 20min時，流動相A為65 75%，流動相B為35 25 %，第21 35min時流動相A為75 65 %，流動相B為25 35 %。測得靛藍(lán)濃度為 92. 50mg/L。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)部分參數(shù)對靛藍(lán)濃度影響的實驗當(dāng)其他參數(shù)采用本實施例的數(shù)值時，靛藍(lán)濃度隨苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞濃 度變化的曲線如圖1所示。當(dāng)其他參數(shù)采用本實施例的數(shù)值時，靛藍(lán)濃度隨反應(yīng)時間變化的曲線如圖2所
7J\ o當(dāng)其他參數(shù)采用本實施例的數(shù)值時，靛藍(lán)濃度隨吲哚濃度變化的曲線如圖3所
7J\ o實施例2，苯酚羥化酶基因工程菌生物轉(zhuǎn)化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)。LB培養(yǎng)基配方及步驟1 5同實施例1，其中步驟3制得的苯酚羥化酶基因工程 菌全細(xì)胞干重濃度為1. 0g/L ；在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的菌株苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞， 步驟4制備的吲哚/丙酮溶液20 u L，步驟5制備的葡萄糖儲備液10 u L，使反應(yīng)液中吲哚 的濃度為100mg/L，葡萄糖的濃度為0. 5mmol/L ；20°C下，50r/min振蕩2小時。按實施例1所述的測量方法，測得靛藍(lán)濃度為37. 86mg/L。實施例3，苯酚羥化酶基因工程菌生物轉(zhuǎn)化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)。LB培養(yǎng)基配方及步驟1 5同實施例1，其中步驟3制得的苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞干重濃度為1. 2g/L ；在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的菌株苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞， 步驟4制備的吲哚/丙酮溶液30 u L，步驟5制備的葡萄糖儲備液20 u L，使反應(yīng)液中吲哚 的濃度為150mg/L，葡萄糖濃度為1. Ommol/L, 25°C下，100r/min振蕩反應(yīng)4小時。按實施例1所述的測量方法，測得靛藍(lán)濃度為77. 86mg/L。實施例4，苯酚羥化酶基因工程菌生物轉(zhuǎn)化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)。LB培養(yǎng)基配方及步驟1 5同實施例1，其中步驟3制得的苯酚羥化酶基因工程 菌全細(xì)胞干重濃度為1. 5g/L ；在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的菌株苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞， 步驟4制備的吲哚/丙酮溶液50 u L，步驟5制備葡萄糖儲備液30 u L，使反應(yīng)液中吲哚的 濃度為250mg/L，葡萄糖濃度為1. 5mmol/L, 35°C下，180r/min振蕩反應(yīng)8小時。按實施例1所述的測量方法，測得靛藍(lán)濃度為89. 50mg/L。實施例5，苯酚羥化酶基因工程菌生物轉(zhuǎn)化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)。LB培養(yǎng)基配方及步驟1 5同實施例1，其中步驟3制得的苯酚羥化酶基因工程 菌全細(xì)胞干重濃度為2. Og/L ；在50mL的錐形瓶中加入20mL步驟3制得的菌株苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞， 步驟4制備的吲哚/丙酮溶液120 u L，步驟5制備的葡萄糖儲備液40 u L，使反應(yīng)液中吲哚 的濃度為600mg/L，葡萄糖濃度為2. 0mmOl/L，40°C下，200r/min振蕩反應(yīng)14小時。按實施例1所述的測量方法，測得靛藍(lán)濃度為26. 50mg/L。
權(quán)利要求
一種苯酚羥化酶基因工程菌轉(zhuǎn)化吲哚制備靛藍(lán)的方法，其特征在于，苯酚羥化酶基因工程菌是通過獲取GenBank注冊號為EU339930的高效苯酚降解菌Arthrobacter sp.W1中總長為5490bp、Genbank注冊號為FJ610336的苯酚羥化酶基因全長序列，連接至載體質(zhì)粒(pET28a(+)Vector)，并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞大腸桿菌中構(gòu)建的；生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時，反應(yīng)液中苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞干重濃度為1～2g/L，吲哚濃度為100～600mg/L，葡萄糖濃度為0.5～2mmol/L，在20～40℃溫度下，搖床轉(zhuǎn)速為50～200r/min，振蕩反應(yīng)2～14小時。
2.如權(quán)利要求1所述的苯酚羥化酶基因工程菌轉(zhuǎn)化吲哚制備靛藍(lán)的方法，其特征在 于，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)時，反應(yīng)液中苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞干重濃度為1. 2 1. 5g/L，吲 哚濃度為150 250mg/L，葡萄糖濃度為1 1. 5mmol/L，在25 35°C溫度下，搖床轉(zhuǎn)速為 100 180r/min，振蕩反應(yīng)時間為4 8小時。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及將苯酚羥化酶基因重組于大腸桿菌體內(nèi)形成工程菌，用于轉(zhuǎn)化吲哚制備靛藍(lán)的方法。通過獲取GenBank注冊號為EU339930的高效苯酚降解菌Arthrobacter sp.W1中總長為5490bp、Genbank注冊號為FJ610336的苯酚羥化酶基因全長序列，連接至載體質(zhì)粒(pET28a(+)Vector)，并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞大腸桿菌中構(gòu)建苯酚羥化酶基因工程菌；生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中苯酚羥化酶基因工程菌全細(xì)胞干重濃度為1～2g/L，吲哚濃度為100～600mg/L，葡萄糖濃度為0.5～2mmol/L，在20～40℃溫度下，控制搖床轉(zhuǎn)速在50～200r/min，振蕩反應(yīng)2～14小時。本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化方法反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物濃度高，生產(chǎn)周期短，適合工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/53GK101851649SQ201010161539
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者喬森, 呂紅, 周集體, 張愛麗, 時勝男, 曲媛媛, 李慧, 項學(xué)敏 申請人:大連理工大學(xué)