專利名稱：利用物理、化學(xué)誘變產(chǎn)生一株穩(wěn)定高產(chǎn)磷脂酶d的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物誘變技術(shù)領(lǐng)域，涉及到利用物理、化學(xué)誘變產(chǎn)生一株穩(wěn)定高產(chǎn) 磷脂酶D的菌株。
背景技術(shù)：
天然磷脂是良好的天然表面活性劑，但由于結(jié)構(gòu)和組成的原因，其應(yīng)用范圍受到 很大限制。為了改善磷脂的性能，人們通過磷脂改性技術(shù)研制和開發(fā)新型磷脂產(chǎn)品。具有 特殊生理功效的改性磷脂商業(yè)價(jià)值高、市場(chǎng)前景廣闊，這也使得磷脂的改性成為目前國內(nèi) 外研究的熱點(diǎn)，人們嘗試用各種方法對(duì)磷脂進(jìn)行改性研究。由于磷脂結(jié)構(gòu)的相似性，使得一般的物理化學(xué)改性方法難以制備高純度的單一磷 脂，如目前利用溶劑分提得到的磷脂產(chǎn)品純度低，溶劑消耗量大，且生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品溶劑 殘留也大。新興的生物技術(shù)改性磷脂方法即磷脂的酶法改性與傳統(tǒng)改性方法相比有著一些 獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如生物酶法改性具有更好的反應(yīng)特異性、溫和的反應(yīng)條件以及更少的環(huán)境污 染等。利用磷脂酶改性可獲取高純特定脂肪酸結(jié)構(gòu)的磷脂產(chǎn)品(結(jié)構(gòu)磷脂)，這些特殊結(jié)構(gòu) 的磷脂在自然界中含量極少，難以用化學(xué)方法合成，但容易用酶法改性獲得。酶法改性生成 的磷脂可保持其天然構(gòu)型，一般可省去分離步驟。但目前磷脂及其衍生物的酶法改性和合 成技術(shù)大多還處在實(shí)驗(yàn)室階段，磷脂酶活性低、成本高是磷脂改性規(guī)?；闹饕款i。磷脂酶D(PLD，EC 3. 1. 4. 4)是作用于磷脂分子中磷酰氧鍵(P_0)的一類酶，可催 化發(fā)生兩種反應(yīng)其一，水解磷脂生成磷脂酸和羥基化合物；其二，當(dāng)有另一種含羥基的化 合物存在時(shí)，可催化其結(jié)合到磷脂的堿基上，形成新的磷脂，此為PLD的轉(zhuǎn)磷酯化反應(yīng)或堿 基交換反應(yīng)。在磷脂的酶法改性和稀有磷脂生產(chǎn)領(lǐng)域，PLD有著重要的作用。PLD是在生 物膜、脂質(zhì)體、藥物的研究中對(duì)磷脂進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵性工具酶，它可催化制備自然界稀 少、難以分離提純的單體磷脂及磷脂衍生物，如磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷 脂酰肌醇(PI)等，在食品及醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用中起著重要的作用，因此，PLD來源和制備方法 研究是目前一個(gè)很活躍的領(lǐng)域。PLD主要來源于動(dòng)植物和微生物，盡管來源比較廣泛，但是由于含量低，分離提純 工藝復(fù)雜，且活力也不高，導(dǎo)致PLD價(jià)格昂貴，限制了 PLD的廣泛應(yīng)用。PLD的活性、穩(wěn)定 性和選擇性是影響磷脂酶工業(yè)應(yīng)用的重要因素，但由于PLD生產(chǎn)技術(shù)的不成熟，使PLD的 穩(wěn)定性和反應(yīng)選擇性不能得到保證，目前獲得高產(chǎn)PLD的菌株是解決這些問題的關(guān)鍵。天 津科技大學(xué)的李斌等利用表達(dá)載體pET-22b (+)，實(shí)現(xiàn)了色褐鏈霉菌PLD基因在大腸桿菌 BL21 (DE3)中的高效表達(dá)，并利用鎳親和柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，但重組PLD酶活力較低， 目前還無法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。獲得相對(duì)高產(chǎn)菌株的方法主要是通過誘變來實(shí)現(xiàn)的，常用的方法主要有紫外誘 變、化學(xué)誘變等。紫外誘變是一種使用時(shí)間長、效果好、設(shè)備簡(jiǎn)單、值得推廣的誘變方法，大 約有80%的高產(chǎn)抗生素產(chǎn)生菌都曾經(jīng)用過紫外誘變方法。西北大學(xué)的郭浩對(duì)其篩選出的鏈 霉菌進(jìn)行紫外誘變，所得誘變菌產(chǎn)PLD酶活為0. 055U/mL，酶活較低。低溫等離子體誘變作為一種新型誘變方法，被用于微生物誘變。低溫等離子體的電離率較低，電子溫度遠(yuǎn)高于離 子溫度，離子溫度甚至可與室溫相當(dāng)，且低溫等離子體中存在著大量的種類繁多的活性粒 子，比通常的化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的活性粒子種類更多、活性更強(qiáng)，因此，近20多年來該技術(shù)在 滅菌和生物誘變方面的應(yīng)用已引起人們的廣泛關(guān)注。大連理工大學(xué)對(duì)等離子體誘變做了大 量研究，侯英敏、李爽、董曉宇等分別對(duì)大氣壓冷等離子體介質(zhì)阻擋放電法對(duì)產(chǎn)1，3_丙二 醇的克雷伯氏菌進(jìn)行誘變研究，篩選出不同目的的誘變菌株，取得了良好的效果。因此本實(shí) 驗(yàn)在利用紫外和氯化鋰復(fù)合誘變的基礎(chǔ)上也利用大氣壓冷等離子體介質(zhì)阻擋放電法對(duì)產(chǎn) PLD的色褐鏈霉菌進(jìn)行誘變育種。低溫等離子體在密閉的放電室中產(chǎn)生，斷電后消失，無任 何殘留物，其發(fā)生裝置簡(jiǎn)單，易于操作，因而具有安全、無污染等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用物理、化學(xué)誘變產(chǎn)生一株穩(wěn)定高產(chǎn)PLD的菌株，解決現(xiàn)有技 術(shù)PLD酶活較低、價(jià)格昂貴的問題，為PLD進(jìn)一步規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用物理、化學(xué)誘變產(chǎn)生一株穩(wěn)定高產(chǎn)PLD的菌株，其特征 是以色褐鏈霉菌(Str印tomyces chromofuscus) CCGMC 4. 331為出發(fā)菌株，將其單孢子菌 懸液依次進(jìn)行“紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變一大氣壓冷等離子體和氯化鋰復(fù)合誘變”，最后得 到一株高產(chǎn)PLD的色褐鏈霉菌，用于發(fā)酵制備PLD。步驟1將出發(fā)菌株CCGMC 4. 331進(jìn)行紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變，包括以下步驟(1)制備菌懸液將色褐鏈霉菌CCGMC 4. 331接種到馬鈴薯葡萄糖(PDA)斜面培養(yǎng)基上，25 35°C 恒溫培養(yǎng)5 10天，待孢子成熟后，加入3 10mL 0. 9 %無菌生理鹽水，用接種環(huán)將孢子輕 輕刮下，倒入盛有玻璃珠的試管中，充分振蕩，使孢子充分打散，成為單孢子懸液，用無菌生 理鹽水稀釋調(diào)整菌個(gè)數(shù)達(dá)到107 109個(gè)/mL左右。⑵誘變過程在黑暗條件下進(jìn)行紫外誘變(紫外燈功率15W)，在照射之前，開啟紫外燈預(yù)熱 20 30min，取4 7mL制備好的菌懸液于直徑為9cm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪 拌器，然后置磁力攪拌器上、紫外燈下30cm處，開啟培養(yǎng)皿蓋在攪拌下進(jìn)行照射，使處理均 勻，操作時(shí)將紫外誘變器用黑布包住，避免白熾光。誘變處理時(shí)間為15 120s。誘變結(jié)束 后用報(bào)紙包嚴(yán)，為防止誘變后光復(fù)活，將誘變后的菌懸液避光放置0. 5 3h，然后用10倍稀 釋法把經(jīng)過照射的菌懸液用無菌生理鹽水稀釋，將對(duì)照組稀釋涂于PDA平板培養(yǎng)基上，同 時(shí)將誘變組稀釋涂于含0. 3% 0. 4%氯化鋰PDA平板培養(yǎng)基上，然后將平板誘變菌放置于 25 35°C恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間7 10天。(3)突變株的篩選挑取24株突變菌和2株對(duì)照菌的單菌落，將其分別接入種子培養(yǎng)基中，25 35°C 培養(yǎng)24h后，分別再接入發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行搖瓶初篩；然后再選取5株P(guān)LD酶活相對(duì)較 高的突變株，對(duì)其進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩每組做三個(gè)平行，過程同搖瓶初篩，其篩選依據(jù)為PLD 酶活大小。步驟2
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將經(jīng)過紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變的高產(chǎn)PLD的菌株再進(jìn)行大氣壓冷等離子體和 氯化鋰復(fù)合誘變，包括以下步驟(1)制備菌懸液 將經(jīng)過紫外和氯化鋰復(fù)合誘變的菌株接種至PAD斜面培養(yǎng)基上，25 35°C恒溫培 養(yǎng)5 10天，待孢子成熟后，加入3 IOmL 0. 9%無菌生理鹽水，用接種環(huán)將孢子輕輕刮 下，倒入盛有玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩，使孢子充分打散，再經(jīng)紗布過濾即可得到懸浮 液，用無菌生理鹽水稀釋調(diào)整至菌個(gè)數(shù)達(dá)到IO7 IO9個(gè)/mL左右。(2)誘變過程采用介質(zhì)阻擋放電(DBD)實(shí)驗(yàn)裝置，等離子體產(chǎn)生于兩個(gè)不同直徑的圓形放電電 極之間，上電極直徑為45mm，與高壓電相連，下電極60mm與地線相連。取0. 4 0. 7mL制 備好的單孢子菌懸液于直徑60mm的石英玻璃平板上，然后將其放到下電極上，調(diào)整上電極 到菌液液面的距離約為3 4mm。打開等離子體電源，誘變處理時(shí)間為10 90s。放電峰 值電壓12 15kV ；頻率6. 0 8. OkHz0將處理后菌液稀釋涂平板，培養(yǎng)基中添加0. 3% 0. 5 %的氯化鋰作為助誘變劑，對(duì)照菌直接稀釋涂于PDA平板培養(yǎng)基中，每樣做三個(gè)平行， 25 35°C避光培養(yǎng)3 10天后統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)，取平均值計(jì)算誘變致死率。選擇誘變時(shí)間， 對(duì)菌種進(jìn)行誘變處理。(3)突變株的篩選挑取24株突變菌和2株對(duì)照菌的單菌落，將其分別接入種子培養(yǎng)基中，25 35°C 培養(yǎng)24h后，分別再接入發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行搖瓶初篩；然后再選取4株P(guān)LD酶活相對(duì)較 高的突變株，對(duì)其進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩每組做三個(gè)平行，過程同搖瓶初篩，其篩選依據(jù)為PLD 酶活大小。上述所用的馬鈴薯葡萄糖(PDA)斜面培養(yǎng)基為去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水 1L，煮沸30min，然后用紗布過濾，再按比例加入20g葡萄糖及1. 5% 2. 0%瓊脂，再定容 至lL，pH自然；誘變用PDA斜面培養(yǎng)基為上述PDA培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入0. 3% 0. 5%的氯化 鋰；培養(yǎng)條件為將所需要培養(yǎng)的菌種接到PDA斜面培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)7 10天。本發(fā)明的效果和益處是誘變篩選得到一株高產(chǎn)PLD的色褐鏈霉菌菌株，為PLD工 業(yè)化生產(chǎn)提供了有較高應(yīng)用價(jià)值的高產(chǎn)菌株，同時(shí)也為PLD的發(fā)酵培養(yǎng)及應(yīng)用奠定了良好 的基礎(chǔ)，并且為微生物誘變育種提供了一種良好可行的方法。本發(fā)明采用的誘變和篩選方 法具有操作簡(jiǎn)單、效率高等特點(diǎn)，對(duì)具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的菌株篩選具有實(shí)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖10.0g/L，酵母浸粉20.0g/L，蛋白胨 5. Og/L，K2HPO4 2. Og/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，ρΗ7· 0 ；培養(yǎng)條件為28°C恒溫振蕩培養(yǎng) 24h。所用發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨20. Og/L，可溶性淀粉25. 0g/L, MgSO4 · 7H200. 5g/ L，CaCO3 1. Og/L, Tween 80 20. Og/L ；培養(yǎng)條件為發(fā)酵周期為7d，發(fā)酵溫度為28°C，發(fā)酵 液初始PH值為6. 0，接種量為3 %，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為lOmL/lOOmL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速為 200rpm。所用PLD酶活測(cè)定方法為取卵磷脂0.5g，加乙醚ImL制成500mg/mL的溶液， 加水10mL，冰浴下振蕩至形成乳液。取IOOyL置試管中，加入0. lmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH6. 0) lOOii L、0. lmol/L 氯化鈣溶液 50ii L、7. 5% Triton X-100150 ii L 和酶液 100 u L, 立即置37 °C水浴中反應(yīng)lOmin。力卩入含50mmol EDTA的0. lmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH8. 0) 200 u L，置沸水浴中5min,終止反應(yīng)，冷卻至室溫。加入1. 0mol/L Tris-HCl緩沖 液(pH8. 0) 2mL (其中含有2U膽堿氧化酶，2U過氧化酶，4-氨基安替比林2mg，苯酚lmg和 Triton X-100 20mg)，置37°C水浴中20min。反應(yīng)后的混合液于500nm處測(cè)定吸光度。以水 代替酶液，同法操作，作為空白對(duì)照。以氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)物代替酶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將其轉(zhuǎn)化 為膽堿濃度，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出所測(cè)粗酶液水解產(chǎn)生的膽堿的含量，從而確定PLD的 酶活。PLD的酶活力定義為以卵磷脂為底物，在pH = 6. 0，37°C條件下，每分鐘產(chǎn)生1 y mol 膽堿所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，記為U/mL。酶活計(jì)算公式為酶活(U/mL)= [ (A500nm-0. 005 1) /0. 0979 ( u mol/mL) X 0. 1 (mL) ] / [(10(min) X0. 1 (mL)]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。以色褐鏈霉菌為出發(fā)菌株，將其單孢子菌懸液依次進(jìn)行“紫外線和氯化鋰復(fù)合誘 變一大氣壓冷等離子體和氯化鋰復(fù)合誘變”，最后得到一株可高產(chǎn)PLD的色褐鏈霉菌，可用 于液體發(fā)酵制備PLD。包括以下兩個(gè)部分，下面分別予以說明。1、利用紫外和氯化鋰復(fù)合誘變產(chǎn)生一株穩(wěn)定的高產(chǎn)PLD的菌株，包括以下步驟(1).制備單孢子菌懸液將色褐鏈霉菌CCGMC 4. 331接種在馬鈴薯葡萄糖(PDA)斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫 培養(yǎng)7天，待孢子成熟后，加入5mL 0. 9%無菌生理鹽水，用接種環(huán)將孢子輕輕刮下，倒入盛 有玻璃珠的試管中，充分振蕩，使孢子充分打散，成為單孢子菌懸液，用無菌生理鹽水稀釋 調(diào)整菌個(gè)數(shù)達(dá)到108個(gè)/mL左右。(2).誘變過程在黑暗條件下進(jìn)行紫外誘變(紫外燈功率15W)，在正式照射之前，開啟紫外燈預(yù) 熱20 30min，取5mL制備好的菌懸液于直徑為9cm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌 器，然后置磁力攪拌器上、15W紫外燈下30cm處，開啟培養(yǎng)皿蓋正式在攪拌下照射30s，使處 理均勻，操作時(shí)紫外誘變器用黑布包住，避免白熾光。誘變結(jié)束后用報(bào)紙包嚴(yán)，為防止誘變 后光復(fù)活，將誘變后的菌懸液避光放置lh，然后用10倍稀釋法把經(jīng)過照射的菌懸液用無菌 生理鹽水稀釋，將對(duì)照組稀釋涂于PDA平板培養(yǎng)基上，同時(shí)將誘變組稀釋涂于含0. 4%氯化 鋰PDA平板培養(yǎng)基上，然后將平板誘變菌放置于28°C恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間7天。(3).突變株的篩選挑取24株突變菌和2株對(duì)照菌的單菌落，將其分別接入種子培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng) 24h后，分別再接入發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行搖瓶初篩，篩選依據(jù)為PLD酶活大小，篩選得到5 株產(chǎn)PLD酶活相對(duì)較高的突變株。然后再選取這5株突變株，對(duì)其進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩每組做三個(gè)平行，過程同搖瓶 初篩，篩選依據(jù)為PLD酶活大小，篩選得到一株產(chǎn)PLD酶活較高的突變株。經(jīng)過紫外和氯化鋰復(fù)合誘變產(chǎn)生一株穩(wěn)定的PLD的菌株，將其命名為PU-4，其產(chǎn) PLD酶活達(dá)到0. 636U/mL,比出發(fā)菌株(0. 562U/mL)酶活提高了 13. 17%，且通過傳代實(shí)驗(yàn)， 驗(yàn)證了此菌的遺傳穩(wěn)定性。
2、利用大氣壓冷等離子體與氯化鋰對(duì)PU-4進(jìn)行復(fù)合誘變，從而得到一株穩(wěn)定的 高產(chǎn)PLD的菌株，包括以下步驟(1).制備單孢子菌懸液將經(jīng)過紫外和氯化鋰復(fù)合誘變的一株菌接種至PAD斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng) 7天，待孢子成熟后，加入5mL 0. 9%無菌生理鹽水，用接種環(huán)將孢子輕輕刮下，倒入盛有玻 璃珠的錐形瓶中，充分振蕩，使孢子充分打散，再經(jīng)紗布過濾即可得到單孢子菌懸液，用無 菌生理鹽水稀釋調(diào)整至菌個(gè)數(shù)達(dá)到108個(gè)/mL左右。(2).誘變過程本實(shí)驗(yàn)采用介質(zhì)阻擋放電(DBD)實(shí)驗(yàn)裝置，等離子體產(chǎn)生于兩個(gè)不同直徑的圓形 放電電極之間，上電極直徑為45mm，與高壓電相連，下電極60mm與地線相連。取0. 5mL制 備好的單孢子菌懸液于直徑60mm的石英玻璃平板上，然后將其放到下電極上，調(diào)整上電極 到菌液液面的距離約為3mm。打開等離子體電源，誘變處理時(shí)間為10 90s。該實(shí)驗(yàn)最佳 物理放電參數(shù)為放電峰值電壓13kV ；頻率7. 0kHz。將處理后菌液稀釋涂平板，培養(yǎng)基中 添加0. 4%的氯化鋰作為助誘變劑，對(duì)照菌直接稀釋涂于PDA平板培養(yǎng)基中，每樣做三個(gè)平 行，28°C避光培養(yǎng)3天后統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)，取平均值計(jì)算誘變致死率。選擇誘變時(shí)間，對(duì)菌種 進(jìn)行誘變處理。(3).突變株的篩選挑取24株突變菌和2株對(duì)照菌的單菌落，將其分別接入種子培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng) 24h后，分別再接入發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行搖瓶初篩，篩選依據(jù)為PLD酶活大小。篩選得到四 株產(chǎn)PLD酶活相對(duì)較高的突變株。然后再選取4株P(guān)LD酶活相對(duì)較高的突變株，對(duì)其進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩每組做三個(gè) 平行，過程同搖瓶初篩，其篩選依據(jù)為PLD酶活大小。篩選得到一株產(chǎn)PLD酶活相對(duì)較高的 突變株。利用大氣壓冷等離子體和氯化鋰對(duì)PU-4進(jìn)行復(fù)合誘變，得到一株穩(wěn)定的高產(chǎn) PLD的菌株，將其命名為PUP-8，其產(chǎn)PLD酶活達(dá)到0. 878U/mL,比出發(fā)菌株P(guān)U-4的酶活 (0. 636U/mL)提高了 38. 05%，比出發(fā)菌株的酶活(0. 562U/mL)提高了 56. 23%，且通過傳代 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了此菌的遺傳穩(wěn)定性。
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權(quán)利要求
利用物理、化學(xué)誘變產(chǎn)生一株穩(wěn)定高產(chǎn)磷脂酶D的菌株，其特征在于以色褐鏈霉菌(Streptomyces chromofuscus)CCGMC 4.331為出發(fā)菌株，將其單孢子菌懸液依次進(jìn)行“紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變→大氣壓冷等離子體和氯化鋰復(fù)合誘變”，最后得到一株高產(chǎn)磷脂酶D的色褐鏈霉菌，用于發(fā)酵制備磷脂酶D。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用物理、化學(xué)誘變產(chǎn)生一株穩(wěn)定高產(chǎn)磷脂酶D的菌株，其特 征在于步驟1將出發(fā)菌株CCGMC 4. 331進(jìn)行紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變，包括以下步驟(1)制備單孢子菌懸液 將色褐鏈霉菌CCGMC 4. 331接種到馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基上，25 35°C恒溫培養(yǎng) 5 10天，待孢子成熟后，加入3 IOmL 0. 9%無菌生理鹽水，用接種環(huán)將孢子輕輕刮下， 倒入盛有玻璃珠的試管中，充分振蕩，使孢子充分打散，成為單孢子菌懸液，用無菌生理鹽 水稀釋調(diào)整菌個(gè)數(shù)達(dá)到IO7 IO9個(gè)/mL左右；(2)誘變過程在黑暗條件下進(jìn)行紫外誘變，紫外燈功率15W，在照射之前，開啟紫外燈預(yù)熱20 30min,取4 7mL制備好的菌懸液于直徑為9cm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌器， 然后置磁力攪拌器上、紫外燈下30cm處，開啟培養(yǎng)皿蓋在攪拌下進(jìn)行照射，使處理均勻，操 作時(shí)紫外誘變器用黑布包住，避免白熾光，誘變處理時(shí)間為15 120s，誘變結(jié)束后用報(bào)紙 包嚴(yán)，為防止誘變后光復(fù)活，將誘變后的菌懸液避光放置0. 5 3h，然后用10倍稀釋法把經(jīng) 過照射的菌懸液用無菌生理鹽水稀釋，將對(duì)照組稀釋涂于馬鈴薯葡萄糖平板培養(yǎng)基上，同 時(shí)將誘變組稀釋涂于含0. 3% 0. 5%氯化鋰馬鈴薯葡萄糖平板培養(yǎng)基上，然后將平板誘 變菌置于25 35°C恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間7 10天；(3)突變株的篩選挑取24株突變菌和2株對(duì)照菌的單菌落，將其分別接入種子培養(yǎng)基中，25 35°C培養(yǎng) 24h后，分別再接入發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行搖瓶初篩；然后再選取5株磷脂酶D酶活相對(duì)較 高的突變株，對(duì)其進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩每組做三個(gè)平行，過程同搖瓶初篩，其篩選依據(jù)為磷 脂酶D酶活大小；步驟2將經(jīng)過紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變的高產(chǎn)磷脂酶D的菌株再進(jìn)行大氣壓冷等離子體和 氯化鋰復(fù)合誘變，包括以下步驟(1)制備單孢子菌懸液將經(jīng)過紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變產(chǎn)生的一株穩(wěn)定高產(chǎn)磷脂酶D的突變菌株接至PAD斜 面培養(yǎng)基上，25 35°C恒溫培養(yǎng)5 10天，待孢子成熟后，加入3 IOmL 0. 9%無菌生理 鹽水，用接種環(huán)將孢子輕輕刮下，倒入盛有玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩，使孢子充分打散， 再經(jīng)紗布過濾即可得到單孢子菌懸液，用無菌生理鹽水稀釋調(diào)整至菌個(gè)數(shù)達(dá)到IO7 IO9個(gè) /mL左右；(2)誘變過程采用介質(zhì)阻擋放電實(shí)驗(yàn)裝置，等離子體產(chǎn)生于兩個(gè)不同直徑的圓形放電電極之間，取 0. 4 0. 7mL制備好的單孢子菌懸液于直徑60mm的石英玻璃平板上，然后將其放到下電極上，調(diào)整上電極到菌液液面的距離約為3 4mm，打開等離子體電源，誘變處理時(shí)間為10 90s，將處理后菌液稀釋涂平板，培養(yǎng)基中添加0. 3% 0. 5%的氯化鋰作為助誘變劑，對(duì)照 菌直接稀釋涂于馬鈴薯葡萄糖平板培養(yǎng)基中，每樣做三個(gè)平行，25 35°C避光培養(yǎng)3 10 天后統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)，取平均值計(jì)算誘變致死率，選擇誘變時(shí)間，對(duì)菌種進(jìn)行誘變處理；(3)突變株的篩選挑取24株突變菌和2株對(duì)照菌的單菌落，將其分別接入種子培養(yǎng)基中，25 35°C培養(yǎng) 24h后，分別再接入發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行搖瓶初篩；然后再選取4株磷脂酶D酶活相對(duì)較 高的突變株，對(duì)其進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩每組做三個(gè)平行，過程同搖瓶初篩，其篩選依據(jù)為磷 脂酶D酶活大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用物理、化學(xué)誘變產(chǎn)生一株穩(wěn)定高產(chǎn)磷脂酶D的菌株， 其特征在于所用的馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基為去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1L，煮 沸30min，然后用紗布過濾，再按比例加入20g葡萄糖及1. 5% 2. 0%瓊脂，再定容至1L， PH自然；誘變用馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基為上述馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入0.3% 0. 5%的氯化鋰；25 35°C恒溫培養(yǎng)7 10天。
全文摘要
利用物理、化學(xué)誘變產(chǎn)生一株穩(wěn)定高產(chǎn)磷脂酶D的菌株，屬于微生物誘變技術(shù)領(lǐng)域。其特征是以色褐鏈霉菌作為出發(fā)菌株，將其單孢子菌懸液依次進(jìn)行“紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變→大氣壓冷等離子體和氯化鋰復(fù)合誘變”，最后得到一株高產(chǎn)磷脂酶D的色褐鏈霉菌，用于發(fā)酵制備磷脂酶D。本發(fā)明的效果和益處是誘變篩選得到一株高產(chǎn)磷脂酶D的色褐鏈霉菌菌株，為磷脂酶D工業(yè)化生產(chǎn)提供了有較高應(yīng)用價(jià)值的高產(chǎn)菌株，同時(shí)也為磷脂酶D的發(fā)酵培養(yǎng)及應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)，并且為微生物誘變育種提供了一種良好可行的方法。本發(fā)明采用的誘變和篩選方法具有操作簡(jiǎn)單、效率高等特點(diǎn)，對(duì)具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的菌株篩選具有實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/465GK101875929SQ20101016158
公開日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者楊天奎, 牟英, 趙紫薇 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)