專利名稱：一種檢測獼猴屬動物TRIMCyp基因型的PCR方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測動物基因型的方法，尤其涉及一種檢測獼猴屬動物TRIMCyp 基因型的PCR方法，屬于獼猴屬動物TRIMCyp基因型的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前研究表明，HIV-I不能在猴體內(nèi)有效復(fù)制的一個主要原因是在猴體內(nèi)存在 兩種抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞限制因子，即Tripartite motif protein 5_ α (TRIM5 α ) 禾口 Apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide 3G(AP0BEC3G)(Sakuma R, Noser J A, Ohmine S, Ikeda Y. Inhibition of HIV-I replication by simian restrictionfactors,TRIM5[alpha]and AP0BEC3G[J]. Gene Ther 2006 ； 14 (2) :185_189)。 本文研究限于TRIM5 α，該蛋白為一種組成型表達的胞漿蛋白，介導(dǎo)了逆轉(zhuǎn)錄病毒進入細(xì)胞 后的限制。TRIM5ci結(jié)合病毒的衣殼蛋白(capsid，CA)，主要限制了逆轉(zhuǎn)錄病毒進入胞漿 后的脫殼，并將TR IM5 α-CA靶向于蛋白酶體而降解(Stremlau M, Owens C, Perron Μ, et al.The cytoplasmic body component TRIM5α restricts HIV-I infection inOld World monkeys [J]. Nature, 2004 ；427 (6977) :848_853)。TRIM5 α 同源基因存在于一些靈長類生 物中(Sawyer SL, Wu Li, Emerman Μ, et al. Positive selection ofprimate TRIM5alpha identifies a critical species-specific retroviral restrictiondomain[J]. Proc Natl Acad Sci U S A 2005 ； 102 2832-2837 ；Song B, Gold B，0，HuiginC，et al. The B30. 2(SPRY)domain of the retroviral restriction factor TRIM5alphaexhibits lineage-specific length and sequence variation in primates[J]. J Virol 2005 ； 79 :6111-6121.)，包括人和類人猿。然而，在一些獼猴屬靈長類動物中，TRIM5基因座發(fā) 生天然的CypA轉(zhuǎn)座子插入突變，產(chǎn)生TRIMa-CypA融合基因，即TRIMCyp這種插入突變 使TRIM5ci所結(jié)合CA結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生變化，從而失去了限制HIV-I復(fù)制的作用(Liao C H, Kuang Y Q, Liu H L, et al. A novel fusion gene, TRIM5-Cyclophi 1 in A in the pig-tailed macaque determines its susceptibility to HIV-I infection[J]. AIDS, 2007 ；8 :S19-26.)。利用TRIMCyp基因型宿主，可使HIV-I較易突破猴的宿主限制性，并使 其他抑制活性較弱的限制因子作用得以更清晰表現(xiàn)，為研究逆轉(zhuǎn)錄病毒跨種間傳播和建立 新型艾滋病動物模型提供獨特平臺。獼猴屬的食蟹猴和恒河猴是研究艾滋病的主要非人靈長類模型動物。雖然國外已 報道在這2種猴中發(fā)現(xiàn)了 TRIMCyp基因突變個體，卻尚未能在中國恒河猴中找到TRIMCyp 基因型。國內(nèi)亦未見攜帶TRIMCyp基因的食蟹猴報道。因此，有必要開展中國地區(qū)獼猴屬 TRIMCyp基因存在情況調(diào)查，為艾滋病疫苗免疫保護性評價和治療藥物篩選提供靈長類實 驗動物的戰(zhàn)略資源儲備，以及建立更加有效的新模式動物平臺。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種檢測獼猴屬動物TRIMCyp基因型的PCR方法；
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種檢測獼猴屬動物TRIM5基因座突變的PCR方法，包括(1)從獼猴屬動物的毛 發(fā)中提取DNA ；⑵以所提取的DNA為模板，以SEQ ID N0:UPSEQ ID NO :2為引物進行PCR 擴增；(3)如果擴增的產(chǎn)物為一條2300-2400bp的片段，則待檢測獼猴屬動物的TRIM5基因 座沒有發(fā)生因CypA插入而導(dǎo)致的突變；如果擴增的產(chǎn)物分別得到兩條片段，其中為一條為 2300-2400bp的片段，另一條為3000-3150bp的片段，則待檢測獼猴屬動物的TRIM5基因座 因CypA插入而發(fā)生雜合突變；如果擴增產(chǎn)物僅為一條3000-3150bp的片段，則待檢測獼猴 屬動物的TRIM5基因座因CypA插入而發(fā)生純合突變。優(yōu)選的，上述檢測方法中，如果擴增的產(chǎn)物為一條2，400bp的片段，則待檢測獼猴 屬動物的TRIM5基因座沒有發(fā)生因CypA插入而導(dǎo)致的突變；如果擴增的產(chǎn)物分別得到兩 條片段，其中為一條為2，400bp的片段，另一條為3，IOObp的片段，則待檢測獼猴屬動物的 TRIM5基因座因CypA插入而發(fā)生雜合突變；如果擴增產(chǎn)物僅為一條3，IOObp的片段，則待 檢測獼猴屬動物的TRIM5 α基因座因CypA插入而發(fā)生純合突變。其中，所述的獼猴屬包括平頂猴(Macaca nemestrina),食蟹猴 (Macacafascicularis)(Macaca mulatta) sK^Hf^ (Macaca thibetana)；步驟(2)中所述的PCR擴增體系優(yōu)選為2 μ L IOX擴增緩沖液，IuL待檢測的模 板，1.6yL dNTP，上下游引物各0. 4yL，0. 16 μ L LA Taq酶，補水至20 μ L體系；所述的PCR 擴增條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性40s，64°C退火40s，72°C延伸2. 5min，35個循環(huán)， 720C IOmin。本發(fā)明建立了從獼猴屬動物毛發(fā)中檢測TRIMCyp基因型的PCR方法，成功地篩 選出了突變基因陽性個體。本發(fā)明主要應(yīng)用毛發(fā)基因組PCR法對獼猴屬的平頂猴、恒河 猴以及食蟹猴TRIMCyp突變體進行了檢測。檢測的3份平頂猴樣本均為TRIMCyp純合突 變，與已報道結(jié)果相符，是平頂猴易感HIV-I的主要原因(KuangY Q，Tang X，Liu F L，et al. Genotyping of TRIM5 locus in Northern pig-tailed macaques(Macaca eonine), a primate species susceptible to human immunodeficiency virus typel infection[J]. Retrovirology,2009 ；6(1) :58)。食蟹猴是艾滋病常用動物模型之一。雖有檢出TRIMCyp 基因型個體的報道，但其在群體中比例不詳(Brennan，G，Y. Kozyrev, Shiu-Lok Hu. TRIMCyp expression in Old World primates Macaca nemestrinaand Macaca fascicularis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A 2008 ；105(9) :3569_74·)。本發(fā)明檢測了 7 只食蟹猴的樣本， 分別檢測出1個純合TRIMCyp突變體，2個TRIMCyp雜合突變體和4個野生型TRIM5個體。本發(fā)明了用獼猴屬動物的毛發(fā)和血液中提取的染色體DNA進行了 TRIMCyp的PCR 擴增效果，二者的檢測結(jié)果相同，表明本發(fā)明方法從獼猴屬動物毛發(fā)中提取基因組DNA進 行PCR檢測，能夠準(zhǔn)確的檢測出獼猴屬動物的TRIMCyp基因型，檢測結(jié)果可信，可以用于調(diào) 查TRIMCyp在中國地區(qū)獼猴中分布，篩選陽性個體。本發(fā)明方法減輕了采樣過程對猴體的 刺激，避免可能的損傷，同時也提高了采樣的效率。


圖1引物Pl序列和位置。圖2引物Ρ2序列和位置。
圖3TRIM5及TRIMCyp的基因結(jié)構(gòu)和PCR引物位置。1-8分別標(biāo)注8個外顯子，CypA 標(biāo)記插入的該基因片段。圖4平頂猴毛發(fā)DNA樣品PCR檢測TRIMCyp突變結(jié)果；M =DNA MarkerDL15000+2000 ；1 =H2O ；2 從恒河猴白血細(xì)胞中所提取的基因組DNA ；3 從平頂猴血 液中所提取的基因組DNA ；4-7 從平頂猴毛發(fā)中所提取的基因組DNA。圖5恒河猴毛發(fā)DNA樣品PCR檢測TRIMCyp突變結(jié)果；M :DNA MarkerDL15000+2000 ；1 =H2O ；2 從恒河猴白血細(xì)胞中所提取的基因組DNA ；3 從平頂猴血 液中所提取的基因組DNA ；4-8 從恒河猴毛發(fā)中所提取的基因組DNA。圖6食蟹猴毛發(fā)DNA樣品PCR檢測TRIMCyp突變結(jié)果；M =DNA MarkerDL15000+2000 ；1 =H2O ；2 從恒河猴白血細(xì)胞中所提取的基因組DNA ；3 從平頂猴血 液中所提取的基因組DNA ；4-9 從食蟹猴毛發(fā)中所提取的基因組DNA。圖7食蟹猴白細(xì)胞DNA樣品PCR檢測TRIMCyp突變結(jié)果；M =DNA MarkerDL15000+2000 ；1 =H2O ；2 從恒河猴白血細(xì)胞中所提取的基因組DNA ；3 從平頂猴血 液中所提取的基因組DNA ；4-9 從食蟹猴白血細(xì)胞中所提取的基因組DNA。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1材料和方法1. 1實驗材料試驗用平頂猴、食蟹猴毛發(fā)取自華南靈長類研發(fā)中心，恒河猴毛發(fā)為 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所慢病毒研究室提供(說明平頂猴、食蟹猴以及恒河猴 的毛發(fā)都可從各地的獼猴養(yǎng)殖場購買得到，例如，可以從廣東藍島生物技術(shù)公司、四川宜賓 生物技術(shù)公司購買得到)，采樣后均存于-20°C，直至使用。毛發(fā)基因組提取試劑盒DNA IQ System購自Promega。LA Taq酶，DNAMarker，dNTP均購自寶生物工程(大連)有限公司。1. 2引物設(shè)計獼猴TRIM5基因包含8個外顯子，已發(fā)現(xiàn)的獼猴屬TRIMCyp基因型中的CypA插入到第8外顯子后的3’ UTR0參照已發(fā)表猴基因組14號染色體序列 (Genbank No. NW_001100384. 11 Mmul4_WGA20947_l :640913_675268，NC_007871. 1)，分另Ij 在TRIM5 α第6外顯子和3’ UTR序列設(shè)計PCR引物，篩選出一對穩(wěn)定性好、特異性強的 引物。上游引物Pl在第6外顯子上，位于第6外顯子的第10 27位堿基。其序列為 CATGACCTTGAAGAAGCC(SEQ ID NO :1)。下游引物Ρ2在3，UTR上，位于第8外顯子后的第 1058 1079位堿基，其序列為TAGCATATCCATCACCTCAAAT(SEQ ID NO 2)(引物序列詳細(xì)位 置見圖1和圖2)。引物由Irwitrogen公司合成。按設(shè)計，如果沒有CypA插入，PCR擴增產(chǎn) 物將為一條2，343bp片段。CypA插入個體有雜合體和純合體2種狀態(tài)。用該PCR引物對擴 增雜合突變體DNA，分別形成一條2，343bp和一條3，IlObp的片段；而擴增來自純和突變體 DNA時則僅形成一條3，IlObp片段(圖3)。1. 3毛發(fā)中染色體DNA提取以及目的片段的PCR擴增
取帶有毛囊的毛發(fā)1-2根，按照毛發(fā)基因組提取試劑盒DNA IQ System的說 明書提取染色體DNA。以提取的DNA為模板，通過PCR擴增目的片段，反應(yīng)體系為2 μ L 10 X buffer，IuL 模板，1·6μ L dNTP,上下游引物各 0. 4 μ L，0. 16 μ L LATaq 酶，補水至 20 μ L體系；反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性40s，64°C退火40s，72°C延伸2. 5min， 35 個循環(huán)，72°C IOmin。2試驗結(jié)果2. 1平頂猴TRIMCyp突變個體檢測結(jié)果根據(jù)報道，100%的平頂猴為TRIMCyp基因型，以提取的3只平頂猴毛發(fā)DNA為模 板進行PCR擴增，對其產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。作為對照，應(yīng)用常規(guī)方法分別從 1只平頂猴和一只已知TRIMCyp突變陰性恒河猴白細(xì)胞中提取的染色體DNA樣品亦同時進 行了 PRC擴增和電泳檢測。結(jié)果顯示，平頂猴和恒河猴白細(xì)胞DNA樣品分別擴增出1條大小 約為3，IOObp和2，400bp的單一、清晰條帶，與推算TRIMCyp基因型和TRIM5基因型相符。 3份平頂猴毛發(fā)DNA樣品均呈現(xiàn)一條大小約為3，IOObp的TRIMCyp基因型片段，但同時在較 低分子量處出現(xiàn)若干非特異性條帶(見圖4)。對擴增的TRIMCyp基因型片段進行克隆后的 測序結(jié)果證實了該PCR方法的特異性。2. 2恒河猴TRIMCyp突變個體檢測結(jié)果
以提取的5只恒河猴猴毛發(fā)DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行1 %瓊脂 糖凝膠電泳，各樣品均可見一大小約為2，400bp的TRIM5基因型條帶，即5只恒河猴皆為 TRIMCyp陰性個體(見圖5)。作為對照，平頂猴和已知TRIMCyp突變陰性恒河猴白細(xì)胞中提 取的染色體DNA樣品亦同時進行了 PCR擴增和電泳檢測，分別擴增出1條大小約為3，IOObp 和2，400bp單一條帶。2. 3食蟹猴TRIMCyp突變檢測結(jié)果雖然食蟹猴是艾滋病研究主要動物模型之一，目前國內(nèi)尚無食蟹猴TRIMCyp突變 體的報道。本發(fā)明對7只食蟹猴進行了 TRIMCyp突變體的檢測，結(jié)果顯示，其中4只為TRIM5 基因型，1只為TRIMCyp基因純合子個體，2只為TRIMCyp基因雜合子個體(圖6)。為了證 實從毛發(fā)中提取DNA進行TRIMCyp突變體PCR檢測的可靠性，本發(fā)明從這7只食蟹猴的白 細(xì)胞中提取了染色體DNA，以此為模板進行了 PCR，檢測TRIMCyp突變體。結(jié)果顯示，血液樣 品檢測的基因型與毛發(fā)樣品測試結(jié)果一致，擴增后片段瓊脂糖凝膠電泳顯示的特異性和條 帶的清晰度亦無明顯差別(圖7)。
權(quán)利要求
一種檢測獼猴屬動物TRIM5基因座突變的PCR方法，包括(1)從獼猴屬動物的毛發(fā)中提取DNA；(2)以所提取的DNA為模板，以SEQ ID NO1和SEQ IDNO2為引物進行PCR擴增；(3)如果擴增的產(chǎn)物為一條2300-2400bp的片段，則待檢測獼猴屬動物的TRIM5基因座沒有發(fā)生因CypA插入而導(dǎo)致的突變；如果擴增的產(chǎn)物分別得到兩條片段，其中為一條為2300-2400bp的片段，另一條為3000-3150bp的片段，則待檢測獼猴屬動物的TRIM5基因座因CypA插入而發(fā)生雜合突變；如果擴增產(chǎn)物僅為一條3000-3150bp的片段，則待檢測獼猴屬動物的TRIM5基因座因CypA插入而發(fā)生純合突變。
2.按照權(quán)利要求1所述的PCR方法，其特征在于步驟(3)中，如果擴增的產(chǎn)物為一條 2，400bp的片段，則待檢測獼猴屬動物的TRIM5基因座沒有發(fā)生因CypA插入而導(dǎo)致的突變； 如果擴增的產(chǎn)物分別得到兩條片段，其中為一條為2，400bp的片段，另一條為3，IOObp的片 段，則待檢測獼猴屬動物的TRIM5基因座因CypA插入而發(fā)生雜合突變；如果擴增產(chǎn)物僅為 一條3，IOObp的片段，則待檢測獼猴屬動物的TRIM5 α基因座因CypA插入而發(fā)生純合突 變。
3.按照權(quán)利要求1所述的PCR方法，其特征在于所述的獼猴屬包括平頂猴(Macaca nemestrina)食蟹猴(Macaca fascicularis)恒河猴(Macaca mulatta) 或藏酋猴 (Macaca thibetana)。
4.按照權(quán)利要求1所述的PCR方法，其特征在于步驟⑵中所述的PCR擴增體系為 2yL IOX擴增緩沖液，IuL待檢測的模板，1.6μ L dNTP，上下游引物各0. 4 μ L，0. 16 μ L LATaq酶，補水至20 μ L體系。
5.按照權(quán)利要求1所述的PCR方法，其特征在于步驟(2)中所述的PCR擴增條件為 95°C預(yù)變性 5min，95°C變性 40s，64°C退火 40s，72°C延伸 `2. 5min，35 個循環(huán)，72°C IOmin0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測獼猴屬動物TRIM5基因座突變的PCR方法，包括(1)從獼猴屬動物毛發(fā)中提取DNA；(2)以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2為引物進行PCR擴增；(3)如果擴增產(chǎn)物為一條2300-2400bp片段，則待檢測動物TRIM5基因座沒有發(fā)生突變；如果擴增產(chǎn)物分別為2300-2400bp和3000-3150bp的兩條片段，則TRIM5基因發(fā)生雜合突變；如果擴增產(chǎn)物僅為一條3000-3150bp的片段，則TRIM5基因座發(fā)生純合突變。本發(fā)明方法能夠準(zhǔn)確的檢測出獼猴屬動物的TRIMCyp基因型，可以用于調(diào)查TRIMCyp在中國地區(qū)獼猴中分布，篩選陽性個體。
文檔編號C12Q1/68GK101818204SQ201010163049
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者于長青, 劉曉明, 呂曉玲, 周建華, 湯艷東, 胡哲, 那雷, 饒軍華 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所;廣東藍島生物技術(shù)有限公司