專利名稱：抗癌胚抗原抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗癌胚抗原(CEA)人源化嵌合抗體，編碼該抗體的多核苷酸，包 含該多核苷酸的表達(dá)載體以及含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及它們?cè)谥苽溆糜谠\斷和 /或治療腫瘤的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
1965年，加拿大的Gold和Fredman用人結(jié)腸癌提取液免疫兔所得的血清檢測多 種人組織，發(fā)現(xiàn)由人內(nèi)胚葉來源的消化道腫瘤為染色強(qiáng)陽性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)2-6個(gè)月胎兒的 消化道組織也陽性，因而將這種在消化道腫瘤中表達(dá)呈陽性的抗原分子命名為癌胚抗原 (Carcinoembryonic antigen，CEA)。后來發(fā)現(xiàn)CEA抗原在由內(nèi)胚層細(xì)胞分化而來的腫瘤細(xì) 胞中的表達(dá)水平較正常組織高上百倍，是多種人惡性腫瘤重要的腫瘤抗原和標(biāo)志物。CEA是 一種由糖鏈和肽鏈組成的分子量約為180-200KD的糖蛋白，由于糖鏈的組成不同和來源不 同其生化特性及免疫原性顯示出極大的異質(zhì)性、多樣性和不均一性，是一個(gè)相對(duì)大的大分 子家族。CEA分子具有許多不同的抗原表位，這些不同的表位在成人不同正常組織、胎兒器 官和各種惡性腫瘤組織中的表達(dá)不同，特異性也有差別。Hammarstrom等于1989年提出把 CEA抗原表位分為5組，即Gold 1-5組(Gold分類)，研究表明Gold 1-5組的抗原表位分 別位于CEA分子的結(jié)構(gòu)域A3、B2、B3、Al和N，其中A3和B3結(jié)構(gòu)域與其它CEA相關(guān)分子的 同源性低，是CEA分子相對(duì)專一的結(jié)構(gòu)域。CEA主要在細(xì)胞胞膜和胞漿表達(dá)，在8周的胚胎的各胚層組織也有表達(dá)。3個(gè)月后 的胚胎組織中CEA主要表達(dá)于胃腸上皮組織，至成人組織CEA表達(dá)明顯減弱或消失，只有結(jié) 腸上皮細(xì)胞表面有微量表達(dá)。但當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變后，CEA在多種惡性腫瘤高表達(dá)，包括結(jié)腸 直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌、膽囊癌和食管癌等 11種腫瘤，其陽性率達(dá)50-90%，并且在這些惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移灶中CEA也高表達(dá)，且表達(dá)水 平高于原發(fā)病灶。在這些腫瘤中，結(jié)腸直腸癌CEA表達(dá)陽性率和強(qiáng)度均居首位，達(dá)95%以 上。幾乎所有的結(jié)直癌組織中都有CEA的高表達(dá)，而且其在轉(zhuǎn)移病灶如肝轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá) 水平和陽性率顯著高于原發(fā)病灶。大量的研究還證明CEA在惡性腫瘤的表達(dá)與腫瘤的負(fù) 荷、分期、轉(zhuǎn)移預(yù)后密切相關(guān)。因此CEA已被世界范圍公認(rèn)為惡性腫瘤特異的分子標(biāo)志物， 使之成為腫瘤靶向治療和診斷的最佳靶位之一。CEA陽性的惡性腫瘤發(fā)病率高，發(fā)病人數(shù)巨大，是全世界范圍內(nèi)對(duì)人民生命健康威 脅最大的疾病之一。以CEA高表達(dá)的結(jié)腸癌為例，結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，結(jié)腸直 腸癌的發(fā)病率在歐美發(fā)達(dá)國家居所有惡性腫瘤第三位，死亡率居第二位。全球每年新增病 例超過100萬，死于結(jié)腸直腸癌的病人達(dá)52. 9萬。每年我國新增結(jié)腸直腸癌病人近40萬 需要治療，有約近20萬的結(jié)腸直腸癌病人因?yàn)橹委熓』驘o效而死亡。到目前為止FDA批 準(zhǔn)的最常用的結(jié)腸癌化療藥有4種氟尿嘧啶(fluorouracie)、伊立替康(irinotacan)、 奧沙利鉬(oxaliplatin)和卡培他濱(capecitabine)，現(xiàn)有這些化療藥物和化療方案作為 術(shù)后輔助治療可以減少結(jié)腸直腸癌的復(fù)發(fā)率到約為15%左右，改善和提高5年生存率到約
310-13%?？贵w靶向藥物是近十年發(fā)展起來的另一類治療惡性腫瘤的新藥。在臨床上用于 治療某些血液系統(tǒng)腫瘤，如非霍杰金氏淋巴瘤等，已取得顯著的療效，可提高病人的5年生 存率。以CEA抗原為靶點(diǎn)的放射免疫抗體靶向治療劑雖然目前尚未有批準(zhǔn)上市治療腫瘤的 CEA抗體藥。但現(xiàn)已有2種CEA抗體放射免疫治療劑被批準(zhǔn)正在進(jìn)行I、II期臨床試用研 究。一種是美國Immimomedics公司于1999年研制開發(fā)的131I偶聯(lián)的重組CEA人源化抗體 hMN-14的mI-hMN-14抗體藥，目前已基本完成治療耐藥性轉(zhuǎn)移進(jìn)展期結(jié)腸直腸癌的II期 臨床研究，進(jìn)入III期臨床研究。另一種抗人CEA抗體藥物是美國FDA批準(zhǔn)美國City of Hope國家醫(yī)學(xué)中心研發(fā)的與放射核素9°y偶聯(lián)的cT84. 66人/鼠嵌合抗體，目前已完成治 療進(jìn)展期惡性腫瘤的I期臨床試驗(yàn)。然而，以上2種CEA抗體藥物還存在特異性還需進(jìn)一 步提高，毒副反應(yīng)需進(jìn)一步降低；抗體親合力過高，易造成放射免疫靶向治療時(shí)產(chǎn)生親合力 壁壘，從而顯著影響療效等問題。需要新的抗CEA抗體以克服現(xiàn)有技術(shù)抗CEA抗體存在的 問題?，F(xiàn)有的眾多研究已經(jīng)定論，抗體的結(jié)合特異性及親合力均是絕大部分由抗體的輕 鏈和重鏈超可變區(qū)(或稱互補(bǔ)決定區(qū)，complementary determinantregion，簡稱CDR)的氨 基酸序列決定的。美國食品及藥品監(jiān)督管理局(U. S. Food and Drug Administration,FDA) 在其指導(dǎo)原則中認(rèn)定，凡是具有相同互補(bǔ)決定區(qū)的同類型抗體屬于同一種抗體。因此，在獲 得一種有臨床治療價(jià)值的抗體的CDR之后，業(yè)界很容易根據(jù)成熟、公知的現(xiàn)有各項(xiàng)技術(shù)將 其非CDR區(qū)域的氨基酸序列改變而獲得具有相同甚至更好的生物活性的變體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于具有優(yōu)異的CEA結(jié)合特異性和適宜親合力的親本抗CEA鼠單克隆抗 體，通過克隆、鑒定與基因結(jié)構(gòu)的分析，確定了其⑶R區(qū)序列，構(gòu)建了相應(yīng)的人源化嵌合抗 體及其真核細(xì)胞表達(dá)載體，并獲得了表達(dá)并分泌該抗CEA人源化嵌合抗體的細(xì)胞株。本發(fā)明進(jìn)一步證明了所述的人源化嵌合抗體除了具有與原鼠單抗相匹配的適宜 的親合力外，還具有優(yōu)異的CEA結(jié)合特異性和體內(nèi)腫瘤靶向性，并在體內(nèi)可顯著抑制多種 結(jié)腸癌動(dòng)物模型的生長，同時(shí)由于具有人源性，將可減少其人體應(yīng)用時(shí)的毒副作用。本發(fā)明 進(jìn)一步采用動(dòng)物模型及放射免疫顯像等實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)充分證明了所述的人源化嵌合抗體具 有優(yōu)異的CEA陽性腫瘤的靶向性，因此可用于制備CEA陽性腫瘤的體內(nèi)診斷藥物。此外，本 發(fā)明還利用放射免疫治療等實(shí)驗(yàn)在多種動(dòng)物模型體內(nèi)證明了所述的人源化嵌合抗體具有 優(yōu)異的抑制CEA陽性腫瘤生長的能力，因此可用于制備CEA陽性腫瘤的治療藥物。因此，本發(fā)明主要涉及了以下幾個(gè)方面第一方面，本發(fā)明涉及一種抗癌胚抗原的人源化嵌合單克隆抗體或其功能變體， 其中所述單克隆抗體的重鏈包含SEQ ID NO :7-9所示的CDR區(qū)，所述單克隆抗體的輕鏈包 含 SEQ ID NO 10-12 所示的 CDR 區(qū)。第二方面，本發(fā)明涉及一種抗CEA人源化嵌合單克隆抗體或其功能變體，其中該 抗CEA人源化嵌合抗體的輕鏈蛋白質(zhì)氨基酸序列為SEQ IDNO :1，重鏈蛋白質(zhì)氨基酸序列為 SEQ ID NO :2。第三方面，本發(fā)明涉及具有與所述人源化嵌合抗體相同的CDR序列的多肽，其具 有與本發(fā)明所述的人源化嵌合抗體相同或更高的生物活性。本領(lǐng)域公知，抗體的結(jié)合特異性及親合力均主要由CDR序列決定，根據(jù)成熟、公知的現(xiàn)有各項(xiàng)技術(shù)可輕易地將非CDR區(qū)域 的氨基酸序列改變而獲得具有相同甚至更好的生物活性的變體。第四方面，本發(fā)明涉及編碼編碼第一方面或第二方面所述的單克隆抗體或其變體 或第三方面所述的多肽的核酸。本領(lǐng)域公知，即使改變核苷酸的序列，只要最后按照三聯(lián)密 碼子遺傳法則可翻譯出含氨基酸序列SEQ IDNO 1和氨基酸序列SEQ ID NO 2的抗體蛋白 質(zhì)，均為編碼該抗CEA人源化嵌合抗體的多核苷酸。所述的核酸可為DNA或RNA。第五方面，本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體，其中含有編碼氨基酸序列SEQ IDNO=I 或SEQ ID NO :2的多核苷酸，優(yōu)選所述表達(dá)載體在真核細(xì)胞中高效表達(dá)。優(yōu)選地，所述 真核細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的表達(dá)載體為圖4所示的 pSRNC-C κ -CEA 或圖 5 所示的 pSRDC-C y 1-CEA。第六方面，本發(fā)明涉及一種宿主細(xì)胞，其包含第五方面所述的表達(dá)載體。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，具體是保藏號(hào)為CGMCC No. 3803的細(xì)胞。第七方面，本發(fā)明涉及治療有效量的第一到第三方面之一所述的抗體或多肽或它 們的功能變體或它們的偶聯(lián)物或融合蛋白，或第四方面所述的核酸，或第五方面所述的載 體，或第六方面所述的宿主細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的用途。所述的腫瘤選自結(jié)直腸癌、胃 癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌、膽囊癌和食管癌組成的組，優(yōu) 選為結(jié)直腸癌。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的抗腫瘤的藥物包含與放射核素偶聯(lián)的第一到 第三方面之一所述的抗體或多肽作為活性藥物成分，優(yōu)選所述放射核素是碘131。第八方面，本發(fā)明涉及第一到第三方面之一所述的抗體或多肽或它們的功能變體 或它們的偶聯(lián)物或融合蛋白，或第四方面所述的核酸，或第五方面所述的載體，或第六方面 所述的宿主細(xì)胞在制備腫瘤診斷劑中的用途。所述的腫瘤選自結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺 癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌、膽囊癌和食管癌組成的組，優(yōu)選為結(jié)直腸 癌。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的腫瘤診斷藥物包含與放射免疫顯像劑偶聯(lián)的第一到第三 方面之一所述的抗體或多肽作為活性藥物成分，優(yōu)選所述放射免疫顯像劑是錸188。


圖1顯示采用瓊脂糖凝膠電泳分析所提取的親本鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞總 RNA。泳道1.分子量標(biāo)準(zhǔn)品，ADNA/Hind III。泳道2.親本鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞總 RNA。圖2顯示采用瓊脂糖凝膠電泳分析親本鼠單克隆抗體VL、VH基因的PCR產(chǎn)物。泳 道1.分子量標(biāo)準(zhǔn)品，ADNA/Hind III。泳道2.親本鼠單克隆抗體VL基因PCR產(chǎn)物。泳 道3.親本鼠單克隆抗體VH基因PCR產(chǎn)物。圖3顯示所擴(kuò)增獲得的親本鼠單克隆抗體VL、VH基因的核苷酸序列、氨基酸序列 及⑶R序列。圖4顯示抗CEA人源化嵌合抗體輕鏈真核表達(dá)載體pSRNC-C κ -CEA的結(jié)構(gòu)示意 圖。Pw，弱化的真核啟動(dòng)子；Neo，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因；PhCMV-IE，人巨細(xì)胞病毒 立早啟動(dòng)子及增強(qiáng)子；VL基因，帶有前導(dǎo)肽序列及5’內(nèi)含子端剪接位點(diǎn)序列的輕鏈可變區(qū) 基因片段；Ck基因，人抗體輕鏈κ鏈恒定區(qū)基因片段；BGH poly A，牛生長激素poly A加尾位點(diǎn)；Ap，氨芐抗性基因。圖5顯示抗CEA人源化嵌合抗體重鏈真核表達(dá)載體pSRDC-C y I-CEA的結(jié)構(gòu)示意 圖。Pw，弱化的真核啟動(dòng)子；dhfr，二氫葉酸還原酶(dhfr)基因；PhCMV-IE，人巨細(xì)胞病毒立 早啟動(dòng)子及增強(qiáng)子；VH基因，帶有前導(dǎo)肽序列及5’內(nèi)含子端剪接位點(diǎn)序列的重鏈可變區(qū)基 因片段；C Yl基因，人抗體重鏈Yl鏈恒定區(qū)基因片段；BGH poly A，牛生長激素poly A加 尾位點(diǎn)；Ap，氨芐抗性基因。圖6顯示高水平分泌表達(dá)抗CEA人源化嵌合抗體的細(xì)胞株的構(gòu)建、篩選過程。圖7顯示采用ELISA法測定分泌表達(dá)抗CEA人源化嵌合抗體的細(xì)胞株CHO的上清 中嵌合抗體的含量。其中，CHO上清(1 1000)，0D490 = 1.520，對(duì)應(yīng)于0.08 48/1111，上清 原液濃度0. 08 X 1000 = 80 μ g/ml。圖8顯示采用RT-PCR分析抗CEA人源化嵌合抗體的抗原特異性。泳道1. λ DNA/ Hind III。泳道2. 320bp標(biāo)記。泳道3.抗CEA人源化嵌合抗體VL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。泳 道4.抗CEA人源化嵌合抗體VH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道5，6.陰性對(duì)照。圖9顯示采用免疫熒光分析抗CEA人源化嵌合抗體的抗原特異性。圖10顯示抗CEA人源化嵌合抗體可以識(shí)別多種CEA表達(dá)的癌細(xì)胞上的CEA抗原。圖11顯示采用Western印跡分析抗CEA人源化嵌合抗體的人源性.泳道1.分 子量標(biāo)記。泳道2.嵌合抗體，抗人IgG Fc-HRP為二抗。泳道3.鼠單克隆抗體，抗人IgG Fc-HRP為二抗。泳道4.嵌合抗體，抗人κ鏈為一抗。泳道5.鼠單克隆抗體，抗人κ鏈為 一抗。圖12顯示抗CEA人源化嵌合抗體的每克組織放射劑量攝入百分比研究(ID% / g)結(jié)果。圖13顯示抗CEA人源化嵌合抗體的腫瘤組織與正常組織放射劑量比值研究(T/ NT)結(jié)果。圖14顯示抗CEA人源化嵌合抗體在體內(nèi)放射免疫顯像CEA陽性結(jié)腸癌的腫瘤。圖15顯示了抗CEA人源化嵌合抗體與碘131的偶聯(lián)物單次治療荷人結(jié)腸癌裸鼠 移植瘤模型的結(jié)果(生長曲線)。圖16顯示了抗CEA人源化嵌合抗體與碘131的偶聯(lián)物多次治療荷人結(jié)腸癌裸鼠 移植瘤模型的結(jié)果(生長曲線)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所涉及的抗CEA人源化嵌合抗體基因的抗體可變區(qū)來自于我們以往以CEA 免疫小鼠制備獲得的一株抗CEA鼠單克隆抗體C24，其可得自2010年5月4日保藏的保藏號(hào) 為CGMCC No. 3802的雜交瘤細(xì)胞。以往的多項(xiàng)研究表明(盧寶蘭.程明.強(qiáng)來英.等.癌 胚抗原單克隆抗體的制各及免疫學(xué)性狀的研究.生物工程學(xué)報(bào).1986，15 (2) :37)，該鼠單 克隆抗體具有非常優(yōu)異的適于靶向治療的生物學(xué)特性，包括具有極強(qiáng)的特異性和適宜的親 合力。該單克隆抗體與CEA抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，在體外能特異地與多種人腫瘤結(jié)合，包 括胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等，但極少與人的正常組織細(xì)胞結(jié) 合特異性強(qiáng)，數(shù)千例的免疫組織化學(xué)研究證明該抗體與上述多種腫瘤組織結(jié)合的陽性率 達(dá)60% -90%，而與正常組織結(jié)合的陽性率僅在5% -10%之間；此外，該單克隆抗體除了特異性強(qiáng)以外的另一個(gè)適用于靶向治療的優(yōu)點(diǎn)是親合力適宜，按照抗原抗體結(jié)合的動(dòng)力學(xué) 計(jì)算結(jié)果，過高親合力的抗體用于靶向治療時(shí)反而導(dǎo)致靶向治療抗體被吸附阻礙于腫瘤的 表面，而不能繼續(xù)滲透深入腫瘤內(nèi)部更好地發(fā)揮療效，因而具有適宜親合力的抗體更適用 于腫瘤的靶向治療。而本發(fā)明中的抗CEA鼠單克隆抗體具有適宜的親合力，親合常數(shù)約為 IX lO-l-1，可以預(yù)計(jì)其人源化抗體將在臨床治療腫瘤中擁有更良好的療效和應(yīng)用前景。定義單克降抗體如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”是指得自一群基本同源的抗體的抗體，即包含除 了可能以很小量存在的天然發(fā)生的突變之外是相同的各個(gè)抗體。單克隆抗體是針對(duì)單一靶 位點(diǎn)的高度特異性的抗體。另外，與常規(guī)的(多克隆)抗體制備物(其典型包括針對(duì)不同決 定簇(表位)的不同抗體)相反，每個(gè)單克隆抗體均針對(duì)靶上的一個(gè)單一決定簇。除了其 特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)勢是可以通過雜交瘤培養(yǎng)而合成，不被其它免疫球蛋白污染。 修飾語“單克隆”表示抗體得自基本上同質(zhì)的抗體群的這一特征，而不是指需要通過任何特 殊方法產(chǎn)生該抗體。例如，本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過使用熟知的技術(shù)分離自噬菌 體抗體文庫。根據(jù)本發(fā)明使用的親代單克隆抗體可以通過由Kohler和Milstein，Nature 256，495 (1975)首先描述的雜交瘤方法產(chǎn)生，或者可以通過重組方法產(chǎn)生?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)如本文所用，術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”是指結(jié)合分子如免疫球蛋白的可變區(qū)中的序列， 其通常主要提供在形狀和電荷分布方面與抗原上被識(shí)別的表位互補(bǔ)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。CDR 區(qū)可以特異于線性表位、不連續(xù)表位或者蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的構(gòu)象表位，這些表位以其 天然構(gòu)象存在于蛋白質(zhì)上或者在一些情況中作為例如通過在SDS中增溶而變性的形式存 在于蛋白質(zhì)上。表位也可以由翻譯后修飾的蛋白質(zhì)組成。多核苷酸如本文所用，“多核苷酸”包括脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其具有天然核 糖核苷酸的必需性質(zhì)的類似物，只要其在嚴(yán)格雜交條件下，與天然核苷酸一樣和基本上相 同的核苷酸序列雜交和/或與天然核苷酸一樣可以翻譯成相同的氨基酸。多核苷酸可以是 天然或異源結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)基因的全長或亞序列。除非特別指出，該術(shù)語包括特異的序列以及 其互補(bǔ)序列。因此，本文中術(shù)語“多核苷酸”包含具有為了穩(wěn)定性或其它原因而修飾的主鏈 的 DNA 或 RNA。本文中使用的術(shù)語“多肽”可與“肽”和“蛋白質(zhì)”互換使用，指氨基酸殘基的聚合 物。該術(shù)語用于氨基酸聚合物，其中一或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然氨基酸的人造化學(xué) 類似物，以及用于天然氨基酸聚合物。這種天然氨基酸的類似物的必需性質(zhì)是當(dāng)其摻入 蛋白質(zhì)中時(shí)，該蛋白質(zhì)特異與由相同的但是完全由天然氨基酸組成的蛋白質(zhì)引發(fā)的抗體反 應(yīng)。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)，，也包括修飾，包括但不限于磷酸化、糖基化、脂質(zhì)附著、 硫化、谷氨酸殘基的Y "羧基化、羥基化和ADP-核糖基化。特異性結(jié)合如本文所用，針對(duì)抗體與其結(jié)合配偶體例如抗原之間的相互作用而提及的術(shù)語 “特異性結(jié)合”，是指所述相互作用依賴于結(jié)合配偶體上特定結(jié)構(gòu)的存在，例如抗原決定簇或表位的存在。換句話說，甚至當(dāng)所述結(jié)合配偶體存在于其它分子或生物體的混合物中時(shí)， 所述抗體也優(yōu)先結(jié)合或識(shí)別所述結(jié)合配偶體。所述結(jié)合可以由共價(jià)或非共價(jià)相互作用或者 這兩種作用介導(dǎo)。再換句話說，術(shù)語“特異性結(jié)合”是指免疫特異性結(jié)合抗原或其片段及非 免疫特異性結(jié)合其它抗原。免疫特異性結(jié)合抗原的結(jié)合分子可以以較低親和性結(jié)合其它肽 或多肽，根據(jù)例如放射性免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、BIAC0RE或者本領(lǐng)域 已知的其它測定法確定。免疫特異性地結(jié)合抗原的結(jié)合分子或其片段可以與相關(guān)抗原交叉 反應(yīng)。優(yōu)選地，免疫特異性地結(jié)合抗原的結(jié)合分子或其片段與其它抗原不交叉反應(yīng)。功能變體如本文所用，術(shù)語“功能變體”是指包含與親代結(jié)合分子的核苷酸和/或氨基酸序 列相比改變了一或多個(gè)核苷酸和/或氨基酸的核苷酸序列和/或氨基酸序列但仍能競爭性 結(jié)合親代結(jié)合分子的結(jié)合配偶體例如CEA的結(jié)合分子。換句話說，親代結(jié)合分子的氨基酸 和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的或含有所述氨基 酸序列的結(jié)合分子的結(jié)合特性，即所述結(jié)合分子仍能識(shí)別并結(jié)合其靶位。所述功能變體可 具有保守的序列修飾，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本領(lǐng)域已 知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，例如定點(diǎn)誘變和隨機(jī)PCR介導(dǎo)的誘變，并且可以包含天然以及非天然 核苷酸和氨基酸。保守的氨基酸取代包括氨基酸殘基由具有相似結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基置 換。本領(lǐng)域已經(jīng)明確了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例 如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如 甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如 丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支的側(cè)鏈(例如 蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基 酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚也可以應(yīng)用除了上述之外的其它氨基酸殘基家族分類。另外，變 體可具有非保守的氨基酸取代，例如將氨基酸殘基用具有不同結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘 基置換。相似的小變化也可以包括氨基酸缺失或插入或者這兩者。確定氨基酸殘基可以被 取代、插入、或缺失而不消除其免疫學(xué)活性的指導(dǎo)可以使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序發(fā)現(xiàn)。核苷酸序列中的突變可以是在基因座產(chǎn)生的單一改變(點(diǎn)突變)，如轉(zhuǎn)換或顛換 突變，或者可以在一個(gè)單基因座插入、缺失或改變多個(gè)核苷酸。另外，可以在核苷酸序列內(nèi) 的任意數(shù)目的基因座中產(chǎn)生一或多個(gè)改變。突變可以通過本領(lǐng)域已知的合適方法進(jìn)行。嵌合抗體產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的。例如輕鏈和重鏈可使用例如免 疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈在單獨(dú)的質(zhì)粒中分別表達(dá)。然后將其純化并在體外裝配為 完整抗體；對(duì)實(shí)現(xiàn)這種裝配的方法已有描述。見例如Scharff，M.，Harvey Lectures 69: 125(1974)所述。也見于 0i 等，BioTechniques 4(4) :214_221 (1986)；及 Sun 等，Hybridoma 5(1986)Suppll 517-20 所述。從還原的分離的輕鏈和重鏈中形成IgG抗體的體外反應(yīng)參數(shù)也已經(jīng)描述。見例如 Beychok, S.，Cells of Immunoglobulin Synthesis，學(xué)術(shù)出版社，紐約，p. 69，1979。輕鏈 和重鏈在相同細(xì)胞中共表達(dá)以實(shí)現(xiàn)重鏈和輕鏈胞內(nèi)締合及連接成為完整的H2L2IgG抗體也 是可能的。這種共表達(dá)可以使用相同宿主細(xì)胞中的相同或不同質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。
人源化抗體非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列 的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如抗體的Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2片 段或者其它結(jié)合靶的亞序列)。一般而言，人源化抗體包含基本上全部的至少一個(gè)、通常為 兩個(gè)可變區(qū)，其中所有或者基本上所有CDR區(qū)域均相應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些區(qū)域，并 且所有或者基本上所有FR區(qū)域是人免疫球蛋白共有序列的那些區(qū)域。人源化抗體也可以 包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是所選擇的人免疫球蛋白模板的至少一部分 免疫球蛋白恒定區(qū)。^^術(shù)語“載體”是指一種核酸分子，其中可以插入另一種核酸分子以用于將其導(dǎo)入宿 主中以便其復(fù)制、在一些情況中表達(dá)。換句話說，載體能轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的核酸分子。克隆以 及表達(dá)載體均涵蓋在本發(fā)明所用術(shù)語“載體”中。載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、細(xì)菌人工 染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)及衍生自噬菌體或植物或動(dòng)物(包括人)的病毒的 載體。載體包含由指定宿主識(shí)別的復(fù)制起源，在表達(dá)載體情況中還包含由宿主識(shí)別的啟動(dòng) 子及其它調(diào)節(jié)區(qū)。含有另一種核酸分子的載體通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染，或者通過利用病毒進(jìn)入機(jī)制 而導(dǎo)入細(xì)胞中。某些載體能在其被導(dǎo)入的宿主中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起源的載體 可以在細(xì)菌中復(fù)制)。其它載體可以在導(dǎo)入宿主時(shí)整合進(jìn)宿主基因組中，從而與宿主基因組 一起復(fù)制?？刹倏v地連接術(shù)語“可操縱地連接”是指兩或多個(gè)核酸序列元件通常經(jīng)物理方式連接并且彼此 存在功能關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子能起始或調(diào)節(jié)編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)則該啟動(dòng)子與所述 編碼序列是可操縱地連接的，在這種情況中編碼序列應(yīng)理解為是在所述啟動(dòng)子的“控制” 下。宿主如本文所用，術(shù)語“宿主”是指其中已經(jīng)導(dǎo)入載體如克隆載體或表達(dá)載體的生物體 或細(xì)胞。所述生物體或細(xì)胞可以是原核或真核生物體或細(xì)胞。應(yīng)理解這個(gè)術(shù)語不僅是指特 定對(duì)象生物體或細(xì)胞，也是指這種生物體或細(xì)胞的后代。由于突變或環(huán)境影響導(dǎo)致在后續(xù) 的世代中可以發(fā)生某些修飾，因此這種后代實(shí)際上與親代生物體或細(xì)胞不相同，但仍包括 在本文所用術(shù)語“宿主”范圍內(nèi)。藥物學(xué)可接受的賦形劑“藥物學(xué)可接受的賦形劑”是指與活性分子如藥物、活性物質(zhì)(agent)或結(jié)合分子 組合的用以制備合適或方便的劑量形式的任何惰性物質(zhì)?！八幬飳W(xué)可接受的賦形劑”是在應(yīng) 用劑量和濃度對(duì)于受體無毒性并且與包含藥物、藥劑或結(jié)合分子的配制品的其它成分相容 的賦形劑。治療有效量術(shù)語“治療有效量”是指本發(fā)明所述抗體有效預(yù)防、改善和/或治療癌癥的量。i^X術(shù)語“治療”是指用以治愈疾病或阻止或者至少延遲疾病進(jìn)展的治療性處理和預(yù) 防措施。需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)患有癌癥以及需要防止癌癥的對(duì)象。從癌癥部分或全部
9痊愈的對(duì)象也需要治療。預(yù)防包括抑制或減慢癌癥進(jìn)展或者抑制或降低與癌癥相關(guān)的一或 多種癥狀的發(fā)生、發(fā)展或進(jìn)展。在本說明書中，術(shù)語“包含”是指包含所述的要素、整數(shù)或步驟，或者要素、整數(shù)或 步驟組，但不排除任何其它要素、整數(shù)或步驟，或者其它要素、整數(shù)或步驟組。一方面，本發(fā)明提供一種抗癌胚抗原的人源化嵌合單克隆抗體或其功能變體，其 中所述單克隆抗體的重鏈包含SEQ ID N0:7-9所示的CDR區(qū)，所述單克隆抗體的輕鏈包含 SEQ ID NO 10-12 所示的 CDR 區(qū)。一方面，本發(fā)明提供一種抗CEA抗體或其功能變體，其中該抗抗體的輕鏈蛋白質(zhì) 氨基酸序列包含或由SEQ ID N0:1組成，重鏈蛋白質(zhì)氨基酸序列包含或由SEQ ID NO 2組 成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗CEA抗體是一種重組或單克隆抗體。在另一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述抗體是嵌合的或人源化抗體。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“本發(fā)明的抗體”指的是本發(fā)明所述的抗CEA人源化嵌合單克隆 抗體或其功能變體，其中所述單克隆抗體的重鏈包含SEQ IDN0 7-9所示的⑶R區(qū)，所述單 克隆抗體的輕鏈包含SEQ ID NO 10-12所示的⑶R區(qū)，具體地所述抗CEA人源化嵌合抗體 的輕鏈蛋白質(zhì)氨基酸序列包含或由SEQ ID NO :1組成，重鏈蛋白質(zhì)氨基酸序列包含或由 SEQ ID NO 2 組成。本發(fā)明還涉及與所述人源化嵌合抗體具有相同的CDR序列的多肽，其具有與本發(fā) 明所述的人源化嵌合抗體相同或更高的生物活性。本發(fā)明術(shù)語“本發(fā)明的多肽”指與所述 人源化嵌合抗體具有相同的CDR序列的多肽，所述的多肽具有與本發(fā)明所述的人源化嵌合 抗體相同或更高的生物活性。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸，其包含編碼本發(fā)明的抗體 或多肽的多核苷酸或其互補(bǔ)序列。所述的核酸可為DNA或RNA。本領(lǐng)域公知，即使改變核苷 酸的序列，只要最后按照三聯(lián)密碼子遺傳法則可翻譯出含氨基酸序列SEQ ID N0:1和氨基 酸序列SEQ ID NO 2的抗體蛋白質(zhì)，均為編碼該抗CEA人源化嵌合抗體的多核苷酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了可用于制備該抗CEA人源化嵌合抗體的重組表達(dá)載 體，所述載體包含編碼本發(fā)明的抗體的核酸。載體可衍生自質(zhì)粒如F、Rl、RPl、Col、pBR322、 T0L、Ti 等；粘粒；噬菌體如 \、lambdoid、M13、Mu、PI、P22、Q0、T-even、T-odd、T2、T4、T7 等；植物病毒；或者動(dòng)物病毒。載體可用于克隆和/或表達(dá)目的及基因治療目的。包含與 一或多種調(diào)節(jié)表達(dá)的核酸分子可操縱地連接的編碼本發(fā)明的抗體的一或多種核酸分子的 載體也包括在本發(fā)明內(nèi)。載體的選擇依賴于重組程序及使用的宿主。在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入載 體可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、lipofectamin轉(zhuǎn)染或電穿孔實(shí) 現(xiàn)。載體可以自主復(fù)制或者可以與其已經(jīng)整合進(jìn)其中的染色體一起復(fù)制。優(yōu)選地，所述載 體含有一或多種選擇標(biāo)記。所述標(biāo)記的選擇可依賴于選擇的宿主細(xì)胞，其對(duì)于本發(fā)明不是 關(guān)鍵的并且已經(jīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。所述標(biāo)記包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤 霉素、潮霉素、zeocin、單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠二氫葉酸還原酶基因 (dhfr)。具體地，本發(fā)明將編碼該抗CEA人源化嵌合抗體的輕鏈和重鏈的多核苷酸分別重 組克隆入含有真核啟動(dòng)子的兩種載體中，并將所得的表達(dá)載體導(dǎo)入真核宿主細(xì)胞，通過篩 選獲得高產(chǎn)量表達(dá)本發(fā)明的抗體的真核宿主細(xì)胞，在該宿主細(xì)胞的培養(yǎng)上清中含有大量其 所分泌的該抗CEA人源化嵌合抗體蛋白，根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)方法可以從中方便地提取并制備該抗CEA人源化嵌合抗體蛋白。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體分別是含 有該抗CEA人源化嵌合抗體基因和氨甲喋呤加壓擴(kuò)增表達(dá)選擇標(biāo)志基因(dhfr)并且可在 中國倉鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)的載體pSRNC-CK -CEA和pSRDC-Cy 1-CEA。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述宿主細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞CH0。本發(fā)明還提供了含有一或多個(gè)拷貝的上述載體的宿主。優(yōu)選地，所述宿主是宿主 細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括但不限于哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲、真菌或細(xì)菌來源的細(xì)胞。使用哺乳動(dòng) 物細(xì)胞如中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)是本發(fā)明優(yōu)選的。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了重組宿主細(xì)胞(RCC-24)，其是含有pSRNC-CK -CEA和pSRDC-C Y 1-CEA的中國 倉鼠卵巢細(xì)胞。所述的重組宿主細(xì)胞是經(jīng)過逐步氨甲喋呤加壓擴(kuò)增表達(dá)，并經(jīng)過亞克隆表 達(dá)產(chǎn)量篩選出的高表達(dá)株，最后經(jīng)無血清培養(yǎng)馴化獲得的。該宿主細(xì)胞是于2010年5月4 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No. 3803。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，該抗CEA人源化嵌合抗體蛋白可用于制備診斷或/和治 療人類CEA陽性腫瘤的藥物。通過本發(fā)明的抗CEA人源化嵌合抗體偶聯(lián)示蹤分子可制備用 于診斷人類CEA陽性腫瘤的藥物。所述的示蹤分子可以是放射核素，(例如125I、mIn、99Te 等)或者可采用可用臨床可接受的技術(shù)手段探測的其它類型的分子，如納米熒光材料或遠(yuǎn) 紅外材料等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，示蹤分子是放射核素錸188。將示蹤分子偶 聯(lián)抗CEA人源化嵌合抗體后，通過Y照相機(jī)或成像儀可以準(zhǔn)確地放射免疫顯像診斷CEA陽 性腫瘤，具有較好的信噪比、靶向性和顯像質(zhì)量。本發(fā)明的抗體還可用于制備用于治療腫瘤的藥物組合物。此外，可以將一些治療 性物質(zhì)如放射性核素與該抗CEA人源化嵌合抗體偶聯(lián)，制備用于治療人類CEA陽性腫瘤的 藥物組合物。本文中所述的“抗體偶聯(lián)物”指通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的各種偶聯(lián)方法， 將放射性核素等治療性物質(zhì)與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)所得的偶聯(lián)物。其中，所述的放射性核素 包括mI、9°Y。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療性物質(zhì)是放射核素碘131，將其偶聯(lián) 抗CEA人源化嵌合抗體后，對(duì)CEA陽性腫瘤進(jìn)行放射免疫治療，可以非常顯著地抑制腫瘤生 長，具有很好的治療效果并基本不具有明顯的毒副作用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗 體或抗體偶聯(lián)物可用于診斷、治療表達(dá)CEA的腫瘤，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、其他CEA陽 性腫瘤等。在具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)CEA的腫瘤是結(jié)直腸癌。本領(lǐng)域技術(shù)人員 根據(jù)現(xiàn)有臨床診斷技術(shù)，檢測病人血清中CEA的含量，輔助判斷病人腫瘤是否為CEA陽性腫 瘤，完全能夠選擇適宜的待治療腫瘤類型。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，上述的藥物組合物中 還可包含藥物學(xué)可接受的賦形劑。所述抗CEA人源化嵌合抗體可以作為藥物通過常規(guī)給藥途徑給予患者，所述的 給藥途徑例如但不限于經(jīng)胃腸外給藥，例如經(jīng)靜脈、經(jīng)輸注、局部給藥等。合適的劑量依 賴于若干個(gè)參數(shù)，包括給藥的方法和所治療的對(duì)象及耐受程度?？梢悦鞔_的是mI標(biāo)記的 抗CEA人源化嵌合抗體能明顯抑制人結(jié)直腸癌的生長，并呈劑量依賴關(guān)系。優(yōu)選的劑量是 12. 5mCi/kg,間隔10天進(jìn)行2次治療。本發(fā)明通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明，但任何實(shí)施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā) 明的范圍或?qū)嵤┓绞降南薅?。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定，結(jié)合本說明書和本領(lǐng) 域一般常識(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。微生物材料保藏信息
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產(chǎn)生親本鼠單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞系C24于2010年5月4日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微 生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3802。產(chǎn)生人源化嵌合單克隆抗體的CH0細(xì)胞系RCC-24于2010年5月4日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微 生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3803。
實(shí)施例實(shí)施例1嵌合抗體基因的克隆、測序采用基因克隆的方法，克隆親本抗CEA鼠單克隆抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因，并進(jìn) 行核苷酸序列分析。親本抗CEA鼠單克隆抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增方法鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞 C24(保藏號(hào)CGMCC No. 3802)總RNA的提取按Trizol試劑(Gibco公司)說明書進(jìn)行，收 集1 X 107鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，lOOOOrpm離心lmin，吸棄上清。加入1ml Trizol充 分溶解細(xì)胞，室溫靜置3-5min后加入0. 2ml氯仿，顛倒混勻，4°C下12000rpm離心lOmin， 轉(zhuǎn)移上清約0. 6ml在新的離心管中。加入0. 5ml異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置5-10min，4°C 下12000rpm離心lOmin，棄上清，75 %乙醇洗滌一次，空氣干燥，加入50iilddH20溶解沉淀 物。鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞cDNA第一條鏈的合成利用MMLV-反轉(zhuǎn)錄酶(Gibco公司) 按照廠商提供的說明書進(jìn)行在20iU的體系中加入5X緩沖液4iU，10mM DDT(Promega 公司)，10 ii g 總 RNA，終濃度 0. 5mM 的 dNTP (Promega 公司)，終濃度 10 ii g/ml 的 Oligo d(T) 15 (Promega 公司)，40u RNasin (Promega 公司)，200u (U) MMLV-反轉(zhuǎn)錄酶(Gibco 公 司)，混勻。37°C水浴lh，沸水浴5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。鼠單克隆抗體輕重鏈可變區(qū)基因的擴(kuò) 增使用高精度DNA聚合酶Taq (Promega公司)+Pfu DNA聚合酶(Promega公司)，在100 ill 的反應(yīng)體系中含有:10X緩沖液10u l,10mM dNTP2u 1, cDNA 20 yl，擴(kuò)增引物各50pmol， 混勻后表面覆蓋石蠟油。95°C水浴5min后，透過石蠟油加入l_2u的Taq+Pfu DNA聚合酶， 開始以下循環(huán)，94°C lmin, 55°C lmin，72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72°C lOmin。 PCR 引物擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)用的引物PVL5 -GACAT TCAGC TGACCCAGTC TCCA-3‘ (SEQ ID NO 3) ；PVL3 5' -GTTAG ATCTC CAGCT TGGTCCC-3‘ (SEQ ID NO 4)。擴(kuò)增重鏈可變區(qū) 用的引物PVH5 5' -AGGTS MARCTGCAGS AGTCff GG-3‘ (S = C/G, M = A/C, R = A/G, W = A/T) (SEQ ID NO 5) ；PVH3 5' -TGAGG AGACG GTGAC CGTGG TCCCT TGGCC CCAG-3‘ (SEQID N0 6)。采用0. 7%非變性瓊脂糖凝膠電泳分析從親本抗CEA鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株 中提取的總RNA，18S RNA和28S RNA大小正確，亮度比約1 2，泳道清晰，說明所提總RNA 比較完整(圖1)。以O(shè)ligo d(T)15為引物合成cDNA第一條鏈，并以此cDNA為模板，采用 輕鏈引物PVL5、PVL3進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出320bp大小左右的輕鏈可變區(qū)基因片段；采用重鏈引 物PVH5、PVH3進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出360bp大小左右的重鏈可變區(qū)基因片段；未加模板的空白對(duì) 照無擴(kuò)增帶(圖2)。擴(kuò)增出的可變區(qū)基因片段大小與一般抗體可變區(qū)基因的大小相符。親本抗CEA鼠單克隆抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆、測序、基因結(jié)構(gòu)分析大 量擴(kuò)增親本抗CEA鼠單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因片段，采用玻璃奶吸附法分離回收后以
12Pvu II和Bgl II雙酶切，并定向克隆入克隆載體pRGWL的相應(yīng)位點(diǎn)，共有153個(gè)轉(zhuǎn)化克隆， 隨機(jī)挑取24個(gè)克隆篩選，獲得6個(gè)重組克隆。選取3個(gè)VL基因重組克隆進(jìn)行核苷酸序列 分析，核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列如圖3所示，3個(gè)克隆的序列完全相同，說明所克 隆的抗體輕鏈可變區(qū)基因確實(shí)為真正的親本抗CEA鼠單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因。從這3 個(gè)克隆中隨機(jī)挑選一個(gè)克隆命名為PRGWH-C502。與Kabat的數(shù)據(jù)比較可知，親本抗CEA鼠 單克隆抗體的VL屬于小鼠K輕鏈VI亞群，輕鏈CDR1-3序列如圖3中所示。大量擴(kuò)增親本 抗CEA鼠單克隆抗體重鏈可變區(qū)基因片段，采用玻璃奶法分離回收后以Pst I和BstE II 雙酶切，并定向克隆入克隆載體PRGWH的相應(yīng)位點(diǎn)，共有364個(gè)轉(zhuǎn)化克隆，隨機(jī)挑取24個(gè)克 隆篩選，獲得18個(gè)重組克隆。選取3個(gè)VH基因重組克隆進(jìn)行核苷酸序列分析，核苷酸序 列及推導(dǎo)出的氨基酸序列如圖3，3個(gè)克隆的序列完全相同，證明所克隆的抗體重鏈可變區(qū) 基因確實(shí)為真正的親本抗CEA鼠單克隆抗體重鏈可變區(qū)基因，從中隨機(jī)挑選一個(gè)克隆命名 為PRGWL-C504。與Kabat的數(shù)據(jù)比較可知，親本抗CEA鼠單克隆抗體的VH屬于小鼠重鏈 11(B)亞群，重鏈CDR1-3序列如圖3中所示(SEQ ID NO :7_9)。具體地，SEQ ID N0S :7_12 的序列為VH CDR1 (SEQ ID NO:7)His Tyr Tyr Met HisVH CDR2(SEQ ID NO :8)Trp lie Asn Pro Glu Asn Val Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gin GlyVH CDR3(SEQ ID NO :9)Tyr Arg Tyr Ala Gly Gly Gly Ala Leu Asp TyrVL CDR1(SEQ ID NO :10)Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr lie HisVL CDR2(SEQ ID NO 11)Asp Thr Ser Lys Leu Ala SerVL CDR3(SEQ ID NO 12)Gin Gin Trp Asn Asn Asn Pro Tyr Ser實(shí)施例2抗CEA人源化嵌合抗體基因及表達(dá)載體的構(gòu)建采用基因克隆、DNA重組的方法，將親本抗CEA鼠單克隆抗體的可變區(qū)基因重組入 含有調(diào)控序列和人抗體恒定區(qū)基因的載體中，構(gòu)建抗CEA人源化嵌合抗體的基因及包含所 述基因的真核表達(dá)載體。通過PCR擴(kuò)增帶調(diào)控序列的可變區(qū)基因片段使用高精度DNA聚合酶Taq+Pfu DNA聚合酶，其中在100 ill的反應(yīng)體系中含有10X緩沖液10 iil，10mM dNTP 2yl，質(zhì) 粒1 P g，擴(kuò)增引物各50pmol，混勻后表面覆蓋石蠟油。95°C水浴5分鐘后，透過石蠟油加入 l-2u的Taq+Pfu DNA聚合酶，開始以下循環(huán)，94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘，共20個(gè) 循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72°C 10分鐘?？笴EA人源化嵌合抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定以經(jīng)測序鑒定過的實(shí)施例1 中所獲得的重組克隆質(zhì)粒PRGWL-C502和pRGWH-C504為模板，使用含兩端克隆位點(diǎn)BamH I 和 Not I 酶切位點(diǎn)的引物 PVLS(SEQ IDN0 :13)(序列為5' -GGGTC CAAGC TTGCG GCCGC AACTG AGGAAGCAAA GTTTA AATTC TACTC ACGTT TGATC ACCA-3‘ )+PVNP(SEQ IDN0 :14)(序 列為5' -GCTCG GGAAT TCGGA TCCAT GGGAT GGAGCTGTAT CATCC-3 ‘)禾口 PVHS(SEQ ID NO: 15)(序列為5' -GGGTC CGAATTCGCG GCCGC TATAA ATCTC TGGCC ATGAA G_3' )+PVNP，采 用PCR技術(shù)，擴(kuò)增帶有引導(dǎo)肽和5'-端剪接位點(diǎn)的親本抗CEA鼠單克隆抗體的VL和VH。 通過PCR反應(yīng)從輕鏈的重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出帶有引導(dǎo)肽和5'-端剪接位點(diǎn)的親本抗CEA鼠 單克隆抗體的VL片段，大小約500bp ；從重鏈的重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出帶有引導(dǎo)肽和5'-端剪接位點(diǎn)的親本抗CEA鼠單克隆抗體的VH片段，大小約700bp。PCR產(chǎn)物采用玻璃奶法分離 回收后以BamH I和Not I酶切。按《分子克隆》所述進(jìn)行常規(guī)DNA重組操作，將VL克隆入 pSRNC-C k，VH克隆入pSRDC-C y 1中的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成完整的抗CEA人源化嵌合抗體基 因的真核表達(dá)載體。在分別將VL和VH連入表達(dá)載體pSRNC-C k和pSRDC-C y 1后，分別挑 取12個(gè)克隆進(jìn)行篩選，經(jīng)酶切鑒定得到9個(gè)輕鏈和7個(gè)重鏈重組克隆。經(jīng)BamH I和Not I酶切后可切出相應(yīng)的VL、VH片段，證明構(gòu)建成功完整的抗癌胚抗原單克隆抗體基因及其 真核表達(dá)載體。經(jīng)2次重復(fù)的核苷酸序列測定證明，抗癌胚抗原單克隆抗體真核表達(dá)載體 pSRNC-C k -CEA 和 pSRDC-C y 1-CEA 中的可變區(qū)基因序列分別與 pRGWL_C502 和 pRGWH_C504 所含的可變區(qū)基因序列完全相同。抗CEA人源化嵌合抗體真核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)抗CEA人源化嵌合抗體真 核表達(dá)載體分別采用了輕鏈真核表達(dá)載體(pSRNC-C k-CEA)和重鏈真核表達(dá)載體 (pSRDC-C y 1-CEA) 2個(gè)獨(dú)立的表達(dá)載體，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖4，5所示。實(shí)施例3抗CEA人源化嵌合抗體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CH0細(xì)胞表達(dá)CHO-dhfr—細(xì)胞(本室保存)采用含10% FBS、0. 03mmol/l次黃嘌呤(H)、 0. 003mmol/l 胸腺嘧啶脫氧核苷(T)、0. lmmol/1 脯氨酸(Pro)、0. lmmol/1 甘氨酸(Gly)、 100u/ml青鏈霉素、2mmol/l谷氨酰胺的DMEM完全培養(yǎng)液在5% C02、37°C的條件下培養(yǎng)，常 規(guī)按1 10傳代，大約3-4天傳一代。上述細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自Gibco公司。采用基因轉(zhuǎn)染 的方法，用Lipofect AMINE試劑(Gibco公司)轉(zhuǎn)染，將抗CEA人源化嵌合抗體的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并采用不含H、T、Gly的培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行篩選，待克隆形成后再采用含200 u g/ml 的G418(Gibco公司)的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行篩選。結(jié)果，各取4 yg輕、重鏈嵌合抗體基因 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞，約10天后可見克隆生長，計(jì)數(shù)共約350個(gè)克隆。間接ELISA 法測得抗性克隆混合物培養(yǎng)上清0D490 = 1. 622，而陰性對(duì)照CH0_dhfr-上清0D490僅為 0. 063，表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清中有抗CEA人源化嵌合抗體的表達(dá)。表1.通過ELISA檢測轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)細(xì)胞上清中的抗CEA人源化嵌合抗體 a，用山羊抗人IgG多克隆抗體包被b，用山羊抗人k鏈多克隆抗體包被c，用人CEA抗原包被實(shí)施例4加壓擴(kuò)增表達(dá)，篩選抗CEA人源化嵌合抗體高表達(dá)株轉(zhuǎn)染后的CH0細(xì)胞采用含10% FBS、100u/ml青鏈霉素、2mmol/l谷氨酰胺的 DMEM(Gibco公司)完全培養(yǎng)液在5%C02、37°C的條件下培養(yǎng)，常規(guī)按1 10傳代，大約3_4 天傳一代。采用氨甲喋呤(MTX)加壓擴(kuò)增表達(dá)篩選方法，篩選高表達(dá)株。上清中有抗CEA 人源化嵌合抗體的表達(dá)的細(xì)胞克隆依次采用含3X10_8M和10_7M的氨甲喋呤(MTX) (Sigma 公司)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行加壓擴(kuò)增表達(dá)，每輪加壓擴(kuò)增表達(dá)后均采用有限稀釋法進(jìn) 行亞克隆，篩選最高產(chǎn)量的克隆(見圖6)。將抗CEA人源化嵌合抗體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CH0-dhfr_細(xì)胞后初次篩選獲得的高效表 達(dá)抗CEA人源化嵌合抗體的克隆1C5 (嵌合抗體的產(chǎn)量可達(dá)0. 41 u g/ml)采用含3X 10_8M 的氨甲喋呤(MTX) (Sigma公司)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)約30天后，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長 速度恢復(fù)正常，已適應(yīng)3 X 10_8M的MTX，嵌合抗體表達(dá)產(chǎn)量為10. 4 u g/ml，亞克隆后篩選出 嵌合抗體產(chǎn)量最高的克隆2B2，其嵌合抗體的產(chǎn)量可達(dá)16 y g/ml?？寺?B2繼續(xù)在1 5 傳代后換含10_7M MTX的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞適應(yīng)后，嵌合抗體的產(chǎn)量可達(dá)32y g/ml，亞 克隆后篩選出嵌合抗體產(chǎn)量最高的克隆3B2，其嵌合抗體的產(chǎn)量經(jīng)初步檢測就可達(dá)80 yg/ ml (見圖7)。實(shí)施例5可產(chǎn)生抗CEA人源化嵌合抗體的無血清懸浮培養(yǎng)適應(yīng)細(xì)胞株的馴化和制 備采用遞減血清的方法馴化無血清懸浮培養(yǎng)適應(yīng)細(xì)胞株，獲得高水平分泌表達(dá)抗 CEA人源化嵌合抗體的無血清懸浮培養(yǎng)適應(yīng)型細(xì)胞株。在血清培養(yǎng)中貼壁生長的高效表達(dá)分泌抗CEA人源化嵌合抗體的rCHO RCC-24細(xì) 胞(即克隆3B2)首先在培養(yǎng)瓶中采用含5%血清的DMEM完全生長液培養(yǎng)(Gibco公司)， 待其適應(yīng)并顯示出恒定的生長速度后，已相同方法依次更換為含2%、1%、0. 5%,0. 25%血 清的完全生長液培養(yǎng)，待其適應(yīng)并顯示出恒定的生長速度后，最終更換為完全的無血清培 養(yǎng)基CHO-S-SFM II生長液培養(yǎng)(Gibco公司)。此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)大部分喪失貼壁生長的特性， 基本屬于半懸浮培養(yǎng)。然后待其適應(yīng)并顯示出恒定的生長速度后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)， 80-100rpm,強(qiáng)制細(xì)胞懸浮生長，待其適應(yīng)并顯示出恒定的生長速度后，我們將所獲得的無 血清懸浮生長的高效表達(dá)分泌抗CEA人源化嵌合抗體的新細(xì)胞命名為rCHO RCC-24 (SF)細(xì) 胞系(保藏號(hào)CGMCC No. 3803)。實(shí)施例6抗CEA人源化嵌合抗體的特異性、人源性和體內(nèi)靶向性的鑒定一、抗CEA人源化嵌合抗體的特異性鑒定采用RT-PCR方法，細(xì)胞總RNA提取按Trizol試劑說明書進(jìn)行。具體如實(shí)施例1 中所述。cDNA的第一條鏈的合成利用MMLV-反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)根據(jù)廠商說明書進(jìn) 行。具體如實(shí)施例1中所述。PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，從細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增可變區(qū)基因的PCR方 法如實(shí)施例中所述。結(jié)果表明，從rCHO RCC-24 (SF)細(xì)胞系中所擴(kuò)增的輕重鏈可變區(qū)基因 (圖8)經(jīng)測序與原親本抗CEA鼠單克隆抗體的輕重鏈可變區(qū)基因相同，故抗癌胚抗原單克 隆抗體應(yīng)保持親本抗CEA鼠單克隆抗體的特異性，與CEA特異結(jié)合。
采用ELISA方法，以1 y g/ml CEA包被酶標(biāo)板，加樣品反應(yīng)后，再加羊抗人IgG Fc 片段-HRP酶標(biāo)抗體(Sigma公司)(不與鼠Ig交叉反應(yīng))或羊抗鼠gG Fc片段-HRP酶標(biāo) 抗體(Sigma公司)(不與人Ig交叉反應(yīng))孵育，顯色，測0D490值。隨后采用人CEA抗原 包被酶標(biāo)板，羊抗人IgG Fc片段-HRP作二抗進(jìn)行直接ELISA，轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中的抗CEA人 源化嵌合抗體和蛋白A親和層析柱純化的抗CEA人源化嵌合抗體均可與包被的CEA抗原結(jié) 合，并被羊抗人IgG Fc片段多克隆抗體所識(shí)別，呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)，而未轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞 培養(yǎng)上清和親本鼠單克隆抗體則呈陰性反應(yīng)。在以羊抗鼠IgG Fc片段-HRP作二抗時(shí)，則 未轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞培養(yǎng)上清和純化的抗CEA人源化嵌合抗體均呈陰性，而親本鼠單克 隆抗體則呈陽性反應(yīng)。無關(guān)抗體人IgGl均為陰性。證明所表達(dá)的抗CEA人源化嵌合抗體 可與CEA抗原特異結(jié)合，與親本鼠單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性相同。表2.直接ELISA分析抗CEA人源化嵌合抗體的抗原結(jié)合特異性 a，利用羊抗人IgG Fc片段-HRP作為第二抗體b，利用羊抗小鼠IgG Fc片段-HRP 作為第二抗體采用競爭抑制試驗(yàn)，以1 ii g/ml的CEA抗原包被酶標(biāo)板(Biodesign公司)。加入 2. 5ng/孔的無關(guān)小鼠單克隆抗體(自行制備)或2. 5ng/孔的親本抗CEA鼠單抗C50(自行 制備)與不同濃度的抗CEA人源化嵌合抗體，37°C孵育后再加入羊抗鼠IgG-HRP酶標(biāo)抗體 (Sigma公司)，反應(yīng)后測0D490值，并計(jì)算其競爭抑制率，競爭抑制率按以下公式計(jì)算同時(shí) 設(shè)無關(guān)抗體人IgGl對(duì)照。 競爭抑制試驗(yàn)結(jié)果如下表，陰性對(duì)照無關(guān)抗體人IgGl與親本抗CEA鼠單克隆抗體 反應(yīng)無競爭抑制作用(競爭抑制率為-12. 80% ) 抗CEA人源化嵌合抗體在與親本抗CEA 鼠單克隆抗體的比例為2 1時(shí)，親本抗CEA鼠單克隆抗體與抗原的結(jié)合即可發(fā)生較明顯 的競爭抑制，隨著嵌合抗體濃度的增加，親本抗CEA鼠單克隆抗體與抗原的結(jié)合反應(yīng)物減 少，其0D490值逐漸降低，競爭抑制率增加，當(dāng)比例為32 1時(shí)抑制率達(dá)40. 85%。這表明 抗CEA人源化嵌合抗體和親本抗CEA鼠單克隆抗體均可與CEA抗原的相同表位結(jié)合，從而證明該抗CEA人源化嵌合抗體與親本抗CEA鼠單克隆抗體有相同的抗原結(jié)合特異性。表3.利用競爭抑制ELI SA檢測抗CEA人源化嵌合抗體的特異性
樣品_OP490_^！率(％)
2.5ng親本抗CEA鼠單克隆抗體 CHO-dhfr—細(xì)胞上清 2.5ng親本抗CEA鼠單克隆抗體 0+80ng 人 IgGl
2.5ng親本抗CEA鼠單克隆抗體 +2.5ng抗CEA人源化嵌合抗體 2.5ng親本抗CEA鼠單克隆抗體
+ 5ng抗CEA人源化嵌合抗體2.5ng親本抗CEA鼠單克隆抗體 +1 Ong抗CEA人源化嵌合抗體0.997 + 0.00828,.522,5ng親本抗CEA鼠單克隆抗體 +20ng抗CEA人源化嵌合抗體0.903 + 0.04135,.222.5ng親本抗CEA鼠單克隆抗體 +40ng抗CEA人源化嵌合抗體0.884 + 0.00936,.592.5ng親本抗CEA鼠單克隆抗體 + 8Ong抗CEA人源化嵌合抗體0.825 + 0.04740.85采用免疫熒光試驗(yàn)，以CEA高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞LS180(購自ATCC)為靶細(xì)胞，加 入抗CEA人源化嵌合抗體，37°C孵育后再加入羊抗人IgG-FITC熒光二抗(Sigma公司)，反 應(yīng)后熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)設(shè)無關(guān)抗體對(duì)照。結(jié)果如圖9顯示，抗CEA人源化嵌合抗體可 以識(shí)別CEA高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞LS180上的CEA抗原。采用免疫熒光試驗(yàn)，以CEA表達(dá)的多種癌細(xì)胞SW1116、L0V0(購自ATCC)為靶細(xì) 胞，加入抗CEA人源化嵌合抗體，37°C孵育后再加入羊抗人IgG-Cy5熒光二抗(Chemicon公 司)，反應(yīng)后熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)設(shè)無關(guān)抗體對(duì)照。結(jié)果(圖10)顯示，抗癌胚抗原單克 隆抗體可以識(shí)別表達(dá)CEA的癌細(xì)胞上的CEA抗原。二、抗CEA人源化嵌合抗體的人源性鑒定在ELISA實(shí)驗(yàn)中，用CEA、羊抗人k鏈(Sigma公司)或羊抗人IgG多克隆抗體 (Sigma公司)包被酶標(biāo)板，以羊抗人IgG Fc片段-HRP (Sigma公司)作酶標(biāo)抗體的ELISA
1.394 + 0.044-
0.000 + 0.0030
1,573 士 0.010-12.8
1.359 + 0.0242.5
1.166 + 0.00616.36
17結(jié)果(表4)顯示，純化抗CEA人源化嵌合抗體呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)，而抗CEA人源化嵌合抗體 的親本鼠單克隆抗體則呈陰性反應(yīng)。證明純化的抗CEA人源化嵌合抗體含有人IgG的輕、 重鏈恒定區(qū)。表4.通過ELISA檢測抗CEA人源化嵌合抗體的人源性
樣品(lOOng/ml)_OD49oaOD490b_OD490C
抗 CEA 人源化嵌合抗體2.361±0.1272.870±0.204 2.570±0.169
親本鼠單克隆抗體_0.074士0.0000.072±0.008 0.074±0.005
A IgGl 0.072±0.007 2.887±0.186 2.565±0.198 PBS_0.072±0.005 0.070±0.007 0.070±0.007a，用CEA包被b，用羊抗人IgG包被.c，用羊抗人k鏈包被.采用Western印跡實(shí)驗(yàn)，對(duì)抗CEA人源化嵌合抗體進(jìn)行還原型SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后， 分別以羊抗人IgG Fc片段-HRP或羊抗人k鏈多克隆抗體進(jìn)行Western印跡，結(jié)果顯示 (圖11)在55kD處的蛋白條帶可被羊抗人IgG Fc片段-HRP識(shí)別，染出單一的特異免疫染 色帶，大小位置對(duì)應(yīng)于抗體的重鏈，鼠單克隆抗體對(duì)照在此處未出現(xiàn)條帶，證明所表達(dá)的抗 CEA人源化嵌合抗體重鏈含有人的恒定區(qū)。在25kD處的蛋白條帶有可被羊抗人k鏈多抗 所識(shí)別，出現(xiàn)單一的特異免疫染色帶，大小位置對(duì)應(yīng)于抗體輕鏈，鼠單克隆抗體對(duì)照在此處 呈陰性反應(yīng)，表明抗CEA人源化嵌合抗體含有人的k鏈恒定區(qū)。采用羊抗人IgG、羊抗人IgM和羊抗人IgA免疫血清，經(jīng)免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)測定，結(jié)果 表明抗CEA人源化嵌合抗體屬于人IgG類免疫球蛋白。采用鼠抗人IgGl、鼠抗人IgG2、鼠 抗人IgG3和鼠抗人IgG4單克隆抗體進(jìn)行ELISA測定，結(jié)果表明抗CEA人源化嵌合抗體為 人的IgGl。三、抗CEA人源化嵌合抗體的體內(nèi)靶向性鑒定我們采用了多種體內(nèi)放射免疫實(shí)驗(yàn)，包括體內(nèi)放射免疫攝取實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)放射免疫 生物分布實(shí)驗(yàn)來檢測抗CEA人源化嵌合抗體的體內(nèi)特異靶向腫瘤性(以CEA陽性腫瘤結(jié)腸 癌細(xì)胞LS174T荷瘤小鼠為模型)，結(jié)果顯示，注射核素1251標(biāo)記的抗CEA人源化嵌合抗體 后，各組織中腫瘤攝取的標(biāo)記抗體最多，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他正常組織，最高達(dá)33%，并且7d后仍 然維持在26%，能非常好地在腫瘤部位聚集并長時(shí)間滯留，正常組織攝取量少，均隨著時(shí)間 迅速下降，無法滯留(圖12) ；T/N比值研究結(jié)果表明標(biāo)記抗體注射24小時(shí)后主要分布于腫 瘤，在血池略有分布，但96小時(shí)后僅主要分布于腫瘤，顯示了核素標(biāo)記的抗CEA人源化嵌合 抗體可非常特異地分布于腫瘤局部，而不分布于正常組織(圖13)。以上的研究結(jié)果表明， 抗CEA人源化嵌合抗體具有優(yōu)異的體內(nèi)腫瘤靶向性，在動(dòng)物體內(nèi)也可與CEA陽性腫瘤細(xì)胞 特異地結(jié)合，從而特異濃聚并滯留在腫瘤局部，而在除血池以外的正常組織中幾乎不分布， 也無滯留。實(shí)施例7抗CEA人源化嵌合抗體制備診斷藥物用于體內(nèi)放射免疫顯像診斷
我們采用了體內(nèi)放射免疫顯像實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了利用本發(fā)明的抗CEA人源化嵌合抗體 制備的診斷藥物用于體內(nèi)放射免疫顯像診斷的能力，結(jié)果(圖14)顯示，注射核素188Re標(biāo) 記的本發(fā)明的抗CEA人源化嵌合抗體后24小時(shí)，即可異常清晰地顯像腫瘤，在5-7d后腫瘤 更加清晰，能顯示出的最小的腫瘤大小為0. 5cm，具有很好的體內(nèi)診斷應(yīng)用價(jià)值。實(shí)施例8抗CEA人源化嵌合抗體制備治療藥物用于體內(nèi)放射免疫治療CEA陽性的 腫瘤用核素碘131標(biāo)記抗CEA人源化嵌合抗體(簡稱rch24，約20mCi/mg蛋白)，在荷 人CEA陽性結(jié)腸癌細(xì)胞LS180(購自美國ATCC)移植瘤的小鼠(所述小鼠右側(cè)背部皮下注 射100萬LS180，待瘤體積適宜后進(jìn)行治療)體內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)放射免疫治療殺傷結(jié)腸癌腫瘤的 有效性研究，結(jié)果顯示，對(duì)于已形成腫瘤(瘤體積超過0. 5cm3后進(jìn)行治療)，250 y Ci/劑量 高免疫活性和放射比活性的標(biāo)記抗體單次治療對(duì)已形成的腫瘤的抑瘤率為81. (表5， 圖15)；而125 u Ci/只、以間隔lw的方式給藥3次的治療組(瘤體積約0. lcm3時(shí)進(jìn)行治 療)的抑瘤率為93% (表6，圖16)，腫瘤幾乎停止生長，均可顯著的抑制人結(jié)腸癌的生長。 血相分析及體重變化的初步毒理學(xué)研究表明，1311標(biāo)記的抗CEA人源化嵌合抗體體內(nèi)放射 免疫治療人結(jié)腸癌時(shí)，其血相各成分及小鼠體重在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間均無顯著差異，證 明其并無明顯的毒性。
表5. 250 uCi/劑量單次治療對(duì)已形成的腫瘤的抑瘤率為81. 1% 分組只數(shù) 平均瘤重抑制率P值
PBS 6
平均瘤重
(X 土 SD,g)
4.048 ±2.428
抑制率
(%)
lilgG 6 rch24 6
3.859±1.928 0。765 ±0.442
81.1
<0.038表6. 125 u Ci/劑量標(biāo)記抗體3次治療的抑瘤率為93%
分組
WgG rch24
劑量
SD^)
150 ixCi/只 x 3 8.18 土 6.13
腫瘤重量 抑制率 P值
土
150 (xCi/只 X 3 0.57 土 0.47 93.04 <0.05 在荷人大腸癌裸鼠模型上，觀察受試品1311標(biāo)記抗CEA嵌合抗體rch24的體內(nèi)抗 腫瘤活性。方法BABL/c nu/nu裸小鼠皮下分別接種人大腸癌細(xì)胞LS180、LS174T和SW1116 后8 10天后，分組給藥。按瘤體積大小均衡原則分成對(duì)照組、“裸”抗CEA人源化嵌合 抗體rch24 156. 2 u g/kg組、625. 0 u g/kg組、相同放射比活性標(biāo)記的無關(guān)人IgG 3. lmCi/ kg 組、12. 5mCi/kg 組、1311 標(biāo)記的抗 CEA 人源化嵌合抗體 rch24 3. lmCi/kg、6. 25mCi/kg、 12. 5mCi/kg組和陽性化療藥物對(duì)照組。受試品和相關(guān)對(duì)照品尾靜脈注射給藥，10天1次，
19共2次。定期觀察動(dòng)物一般狀態(tài)、稱體重、量瘤體積、測血清CEA水平和外周血指標(biāo)、同位素 在瘤組織和非瘤組織的分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處置荷瘤裸鼠稱瘤重量。結(jié)果受試品1311標(biāo) 記抗CEA嵌合抗體rch24高劑量組和相同放射比活性標(biāo)記的無關(guān)人IgG高劑量組各有1只 裸鼠死亡。給藥后受試品各劑量組的腫瘤體積低于模型對(duì)照組，相對(duì)腫瘤增殖率低于模型 對(duì)照組。低劑量組三個(gè)瘤株LS180、LS174、SW1116的抑瘤率在47. 8 71. 4%，中劑量組 在52. 2 75. 0%，高劑量組在65. 2 86. 2%。受試品各劑量組裸鼠血清CEA水平明顯低 于模型對(duì)照組。與同劑量的“裸”抗CEA人源化嵌合抗體組和1311標(biāo)記的無關(guān)人IgG組比 較，受試品低劑量和高劑量組抑瘤效果更顯著。比較三種瘤株抑瘤效果，受試品1311標(biāo)記 抗CEA嵌合抗體rch24對(duì)LS180腫瘤增長抑制作用最強(qiáng)。首次給藥48小時(shí)和96小時(shí)后同 位素在瘤組織分布明顯高于非瘤組織。給藥后30天，用藥組裸鼠的外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)等指 標(biāo)與模型對(duì)照組比較無明顯差別。結(jié)論受試品1311標(biāo)記抗CEA嵌合抗體rch24能明顯抑 制荷人大腸癌的生長，呈劑量依賴關(guān)系，同時(shí)降低荷瘤裸鼠血清中CEA水平，在瘤組織中靶 向性分布顯著。間隔10天給藥2次，30天后用藥組荷瘤裸鼠造血功能無明顯的變化。表71311標(biāo)記抗CEA嵌合抗體對(duì)荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影響(LS180，一批) 注與模型對(duì)照組比較，*p < 0. 05，< 0.01, _p < 0. 001 ；與rch24低劑量 組比較，#p < 0. 05，##p < 0.01 ；與rch24高劑量組比較，$$$p < 0. 001 ’與人IgG低劑量組比較，&&p < 0. 01 ；與人IgG 高劑量組比較，_@p <0. 001 ；與 6. 25mCi/kg 組比較，！! p<0.01。表81311標(biāo)記抗CEA嵌合抗體對(duì)荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影響(LS180，二批) 注與模型對(duì)照組比較，***p < 0. 001 ；與rch24低劑量組比較，###p < 0. 001 ；與rch24高劑量組
比較，$$$p < 0. 001 ；與人IgG低劑量組比較，&&&p < 0. 001 ；與人IgG高劑量組比較，iiip < o. ooi；與 6. 25mCi/kg 組比較，?。?！ p< 0.001。
表91311標(biāo)記抗CEA嵌合抗體對(duì)荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤專的影響(LS174T，一批)
注與模型對(duì)照組比較，***p < 0. 001 ；與rch24低劑量組比較，###p < 0. 001 ；與 rch24高劑量組比較，$$$p < 0. 001 ；與人IgG低劑量組比較，&&&p < 0. 001 ；與3. lmCi/kg 組比較，% p < 0. 05 ；與人IgG高劑量組比較，iiip < 0. 001。表101311標(biāo)記抗CEA嵌合抗體對(duì)荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影響(LS174T，二批) 注與模型對(duì)照組比較，***p < 0. 001 ；與rch24低劑量組比較，###p < 0. 001 ；與 rch24高劑量組比較，$$$p < 0. 001 ；與人IgG低劑量組比較，&&&p < 0. 001 ；與3. lmCi/比 組比較，% p < 0. 05 ’與人IgG高劑量組比較，iiip < 0. 001 ；與6. 25mCi/kg組比較，！ p < 0. 05。表111311標(biāo)記抗CEA嵌合抗體對(duì)荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影響(SW1116，一批) 注與模型對(duì)照組比較，***p < 0. 001 ；與rch24低劑量組比較，###p < 0. 001 ；與rch24高劑量組
比較，$$$p < 0. 001 ；與人IgG低劑量組比較，&&p < 0. 01 ；與人IgG高劑量組比較，iiip < o. 001。
表121311標(biāo)記抗CEA嵌合抗體對(duì)荷瘤裸鼠瘤重和抑揭■率的影響(SW1116，二批)
注與模型對(duì)照組比較，***p < 0. 001 ；與rch24低劑量組比較，###p < 0. 001 ；與 rch24高劑量組比較，$$$p < 0. 001 ；與人IgG低劑量組比較，&&&p < 0. 001 ；與人IgG高劑 量組比較，_@p <0. 001 ；與 6. 25mCi/kg 組比較，！! p<0. 01。
權(quán)利要求
一種人源化嵌合單克隆抗體或其功能變體，其中所述單克隆抗體的重鏈包含SEQ ID NO7 9所示的CDR區(qū)，所述單克隆抗體的輕鏈包含SEQ ID NO10 12所示的CDR區(qū)。
2.權(quán)利要求1的抗體或其功能變體，所述單克隆抗體含有重鏈氨基酸序列SEQID NO 1和輕鏈氨基酸序列SEQ ID NO :2。
3.一種多肽，其具有與權(quán)利要求1或2的人源化嵌合抗體或其功能變體的CDR區(qū)相同 的CDR區(qū)，并且具有與權(quán)利要求1所述的人源化嵌合抗體相同或更高的生物活性。
4.一種核酸，其包含編碼權(quán)利要求1-3之一的人源化嵌合抗體或多肽的多核苷酸或其 互補(bǔ)序列。
5.權(quán)利要求4所述的核酸，其為DNA或RNA。
6.表達(dá)載體，其中含有編碼氨基酸序列SEQID NO :1或SEQ IDNO :2的多核苷酸，優(yōu)選 所述表達(dá)載體在真核細(xì)胞具體是中國倉鼠卵巢細(xì)胞中高效表達(dá)。
7.權(quán)利要求6的載體，其為圖4所示的pSRNC-Cκ -CEA或圖5所示的pSRDC_C y I-CEA0
8.宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求4或5所述的核酸，或含有權(quán)利要求6或7所述的載體。
9.權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其為中國倉鼠卵巢細(xì)胞，具體是保藏號(hào)CGMCCNo. 3803 的細(xì)胞。
10.治療有效量的權(quán)利要求1-3之一所述的抗體或多肽或權(quán)利要求4或5所述的多核 苷酸或其互補(bǔ)序列或權(quán)利要求6或7所述的載體或權(quán)利要求8或9所述的宿主細(xì)胞在制備 抗腫瘤藥物中的用途。
11.權(quán)利要求1-3之一所述的抗體或多肽在制備腫瘤診斷劑中的用途。
12.權(quán)利要求10或11所述的用途，其中所述的腫瘤選自結(jié)直腸癌，胃癌、肺癌、乳腺癌、 胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌、膽囊癌和食管癌組成的組，優(yōu)選為結(jié)直腸癌。
13.權(quán)利要求10所述的用途，其中所述的抗腫瘤的藥物包含與放射免疫治療劑偶聯(lián)的 權(quán)利要求1-3之一所述的抗體或多肽作為活性成分，優(yōu)選地所述放射免疫治療劑是碘131。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述的腫瘤診斷藥物包含與放射免疫顯像劑偶 聯(lián)的權(quán)利要求1-3之一所述的抗體或多肽作為活性成分，優(yōu)選地放射免疫顯像劑是錸188。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗癌胚抗原(CEA)人源化嵌合抗體，編碼該抗體的多核苷酸，包含該多核苷酸的表達(dá)載體以及含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及它們?cè)谥苽溆糜谠\斷和/或治療腫瘤的藥物中的用途。
文檔編號(hào)C12N5/20GK101928347SQ20101016305
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者冉宇靚, 楊治華 申請(qǐng)人:上海海抗中醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司