專利名稱：一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因及其dsRNA和dsRNA致死害蟲中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)害蟲為害是我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的重要制約因素，長期施用化學(xué)殺蟲劑導(dǎo)致一系列 問題1)昆蟲出現(xiàn)抗藥性，用藥劑量加大，防治成本提高；2)農(nóng)藥殘留導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重； 3)對非靶標(biāo)生物有較大影響?，F(xiàn)有生物殺蟲劑在害蟲防治中應(yīng)用較廣，但殺蟲時間較長且 效果緩慢。RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，2006 年獲諾貝爾獎。RNAi的發(fā)現(xiàn)不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時也為人類疾 病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。2007年，“Nature Biotechnology”雜志先后兩篇 論文報道了施用表達(dá)靶向害蟲重要致死基因V-ATPase A，CYP6AE14 and GSTl的dsRNA轉(zhuǎn) 基因植物作為一種控制病蟲害的新方法(Baum et al,2007 ；Mao et al，2007)。2008年， Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害蟲防治策略?；赗NA干擾技術(shù)的害蟲防治具有 如下優(yōu)勢1)選擇對害蟲專一的基因進(jìn)行干擾，對高等動物和人類是安全的；2)抗蟲具有 專一性，對非靶標(biāo)生物無殺傷作用；3)對環(huán)境無毒無害。研究表明，RNA干擾技術(shù)能夠有效控制特殊的植物害蟲，在害蟲防治領(lǐng)域具有重要 的發(fā)展前景。而實(shí)現(xiàn)基于RNAi進(jìn)行害蟲有效控制的關(guān)鍵是篩選對昆蟲高效致死的dsRNA。幾丁質(zhì)合成和代謝是昆蟲等節(jié)肢動物特有的生物學(xué)現(xiàn)象，由于人類和其它高等動 物沒有幾丁質(zhì)，因此昆蟲幾丁質(zhì)合成系統(tǒng)已被公認(rèn)為新型殺蟲劑作用的靶標(biāo)。幾丁質(zhì)合 成酶在昆蟲幾丁質(zhì)合成的最后一步起著關(guān)鍵作用，采用RNA干擾技術(shù)，開展幾丁質(zhì)合成酶 dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因和基因片段，由基因片段合成 的dsRNA和dsRNA致死害蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因，其核苷酸序列是SEQ ID N0:1，氨基 酸序列是SEQ ID NO :2。是通過對東亞飛蝗EST數(shù)據(jù)庫的搜索，獲得1條幾丁質(zhì)合成酶2 基因的片段，通過RACE-PCR擴(kuò)增獲得全長，命名為LmCHS2。其全長為5018bp，其中可讀框 4569bp，編碼1523個氨基酸，5，-UTR和3，-UTR的長度分別為76bp和373bp。本發(fā)明提供的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO :3， 是根據(jù)SEQ ID NO 1設(shè)計上游引物SEQ ID NO 4和下游引物SEQ ID NO :5，通過PCR擴(kuò)增 獲得。進(jìn)一步利用相關(guān)試劑盒合成dsRNA。dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用注射dsRNA到昆蟲體腔，結(jié)果表明dsRNA可以特異 性地沉默幾丁質(zhì)合成酶2基因的mRNA表達(dá)，昆蟲取食量明顯下降，不能滿足其生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)及能量而死亡。


圖1 :2齡東亞飛蝗若蟲注射dsRNA后對幾丁質(zhì)合成酶2基因(LmCHS2)轉(zhuǎn)錄的影響，β -actin為內(nèi)參基因(1為注射dsGFP的對照組，2為注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因全長的獲得1)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶基因在東亞飛蝗表達(dá)序列標(biāo)簽EST數(shù)據(jù)庫的搜索基于東亞飛蝗的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法對東亞飛蝗幾 丁質(zhì)合成酶基因進(jìn)行搜索，經(jīng)過序列分析及比對后，共獲得1條幾丁質(zhì)合成酶2基因片段。2)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因RACE引物的設(shè)計基于上述搜索得到的幾丁質(zhì)合成酶基因片段的堿基序列，采用primer premier5. 0軟件設(shè)計，引物序列如下5' RACE 上游引物5，-AGCCTGTACCTTTGGAGATTCCCTTG-3，5 ‘ RACE 下游引物5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，3 ‘ RACE 上游引物5，-CCTGGCTCTGGGAGGCTAAGAATGCG-3，3 ‘ RACE 下游引物5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。3)東亞飛蝗總RNA獲得選取大小一致雌雄各半東亞飛蝗5齡若蟲的中腸，四頭一組，冷凍于液氮中，待提 取RNA，具體操作步驟參照TaKaRa Trizol試劑盒。4) RACE cDNA 合成RACE cDNA 合成步驟參照 SMART RACE cDNAAmplification 試劑盒。5)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶基因3’和5’末端序列的獲得根據(jù)Advantage 2Polymerase說明書進(jìn)行3’和5’ RACE末端快速擴(kuò)增，進(jìn)一步克 隆獲得東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶基因序列。6)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶基因片段堿基序列的分析利用Expasy網(wǎng)站中相關(guān)在線軟件和GENED0C、基因探索者等軟件分析所得序列， 進(jìn)行拼接之后，在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進(jìn)行序列同源性比對，確定所獲基因?yàn)闁|亞 飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因。實(shí)施例2 東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因片段的獲得根據(jù)實(shí)施例1獲得的東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因的核苷酸序列，采用primer premier5. 0軟件設(shè)計上游引物序列為SEQ ID NO :3，下游引物序列為SEQ ID N0:4，所有引 物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。選取大小一致雌雄各半東亞飛蝗5齡若蟲，四頭 一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，具體操作步驟參照TaKaRa Trizol試劑盒。M-MLV反轉(zhuǎn) 錄酶將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，以此為模板，PCR擴(kuò)增獲得幾丁質(zhì)合成酶基因片段， Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)試劑盒進(jìn)行純化。實(shí)施例3 東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因片段的dsRNA的獲得
用實(shí)施例2獲得的幾丁質(zhì)合成酶2基因片段，按照T7 RiboMAX Express RNAi System(Promega)試劑盒說明，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。dsRNA濃度采用酶標(biāo)儀(Molecular DevicesSpectraMax 190，Menlo Park, CA, USA)測定，并濃縮至終濃度為 Iyg/μ 1。保存 至_70°C備用。實(shí)施例4 幾丁質(zhì)合成酶2基因片段的dsRNA致死東亞飛蝗實(shí)驗(yàn)1)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因片段的dsRNA注射選取2齡第一天大小均一、健康狀況一致的若蟲用于注射上述合成的dsRNA。 25μ 1規(guī)格微量注射器用于注射，注射時不可用力過大，順著血液流動的方向，側(cè)腹部第2 至3腹節(jié)的連接處作為注射點(diǎn)，要避開氣門。注射dsRNA的量為3 μ g，并設(shè)置dsGFP (3 μ g) 的對照組，每組15頭蟲子，3個生物學(xué)重復(fù)，共計45頭。注射完畢后，將蟲子用IL的燒杯至 于人工氣候箱中進(jìn)行飼養(yǎng)(光照黑暗時間=14h 10h，溫度30士2°C，濕度60%)，給以 新鮮小麥幼苗和適當(dāng)?shù)墓庹?，噴水保持濕度?
2)注入dsRNA后東亞飛蝗表型的觀察若蟲注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，并及時地觀察。注射dsRNA東亞飛蝗實(shí)驗(yàn)組與對照組 在取食量上有顯著差異，有部分若蟲因取食量明顯下降，不能滿足昆蟲生長發(fā)育所需要的 營養(yǎng)及能量而死亡。3)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因沉默效果檢測取上述畸形但未死亡的3齡若蟲，每組收蟲6只，雌雄各半，采用Trizol法提取總 RNA并純化，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶獲得cDNA，以此為模板進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組幾丁 質(zhì)合成酶2mRNA的表達(dá)量減少。見圖1。4)注入dsRNA后東亞飛蝗死亡情況的觀察注射dsRNA的東亞飛蝗實(shí)驗(yàn)組死亡率為98%。這與注射dsGFP的對照組(死亡率 為0%)相比，致死效果明顯。
權(quán)利要求
一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO1。
2.如權(quán)利要求1所述的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列是 SEQ ID NO :2。
3.—種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID N0:3。
4.如權(quán)利要求3所述的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因片段合成的dsRNA。
5.如權(quán)利要求4所述的一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因片段合成的dsRNA在致死害蟲中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種昆蟲幾丁質(zhì)合成酶2基因和應(yīng)用，通過對東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶基因2的克隆和測序，得到序列為SEQ ID NO1的全長幾丁質(zhì)合成酶2基因，從中選出序列為SEQ ID NO2的幾丁質(zhì)合成酶基因片段，用于dsRNA的合成。將上述dsRNA注入昆蟲的體腔后，昆蟲取食量與對照組有顯著差異，98％的實(shí)驗(yàn)組昆蟲取食量明顯下降，不能滿足其生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)及能量而死亡。為安全無公害的害蟲防治方法的研制提供新的途徑。
文檔編號C12N15/52GK101831445SQ201010163618
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者劉曉健, 張建珍, 張建琴, 郭亞平, 馬恩波 申請人:山西大學(xué)