專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于hek293細(xì)胞高效表達(dá)外源基因的表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于HEK293細(xì)胞高效表達(dá)外源基因的表達(dá)載體。具體地說(shuō)是利 用HEK293細(xì)胞的看家基因肽延伸因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列促進(jìn)外源基因在HEK293細(xì)胞中的高 效表達(dá)。
背景技術(shù)：
HEK293細(xì)胞是Graham等在1977年構(gòu)建的永生化人胚腎上皮細(xì)胞系。因其具有 良好的翻譯后修飾能力而被廣泛的用于諸多人源蛋白質(zhì)的功能研究，同時(shí)它也被廣泛的 用作病毒的包裝宿主。在細(xì)胞工程領(lǐng)域，HEK293細(xì)胞也得到了應(yīng)用，例如生產(chǎn)人蛋白C。 人源宿主細(xì)胞中所特有的一些酶類(lèi)有利于幫助重組蛋白折疊成正確的構(gòu)象從而改善其生 物學(xué)活性。例如，人源宿主細(xì)胞中存在a-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，它對(duì)蛋白進(jìn)行a-2，6位的 唾液酸修飾，能提高蛋白的生物學(xué)活性，具有0-2，6唾液酸連接的低聚糖的〖 々(^%116 plasminogen activator，組織型纖溶酶原激活劑)產(chǎn)品質(zhì)量提高。在人源宿主細(xì)胞中含有 3 1，4-N-羥乙酰神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)移酶IlKGnTIII)，對(duì)目的蛋白進(jìn)行修飾，可延長(zhǎng)糖蛋白的半 衰期。用具有此酶的宿主細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體，對(duì)于誘導(dǎo)ADCC(antib0dy-d印endentcel 1-mediated cytotoxicity，抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用)更為有效，可減少抗體用量。 因此有必要開(kāi)發(fā)以人源細(xì)胞為宿主的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。啟動(dòng)子的強(qiáng)弱直接關(guān)系到外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平，為提高外源基因的 轉(zhuǎn)錄效率，必須盡可能的選用高活性的啟動(dòng)子。目前在真核細(xì)胞中最常用的啟動(dòng)子為人的 CMV啟動(dòng)子，它有比較廣泛的宿主細(xì)胞，也是比較強(qiáng)的啟動(dòng)子。但是研究發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子內(nèi)存 在CpG島容易導(dǎo)致沉默效應(yīng)；僅在細(xì)胞周期的S期起作用，因此尋找比CMV更好的啟動(dòng)子是 必要的。人們一直在尋找，高強(qiáng)度適應(yīng)性廣的啟動(dòng)子，Kalwy S用鼠的mCMV啟動(dòng)子在CH0-K1 細(xì)胞中表達(dá)GFP，是人的CMV啟動(dòng)子的3倍，但在表達(dá)抗體這樣的蛋白時(shí)，表達(dá)能力卻比較弱 不如人的CMV啟動(dòng)子。Gershon TJ等通過(guò)人工設(shè)計(jì)合成了一個(gè)能夠增加基因表達(dá)的核心啟 動(dòng)子，體內(nèi)外研究表明它比CMV核心啟動(dòng)子顯著性提高報(bào)告基因熒光素酶的表達(dá)水平，這 就為尋找高活性啟動(dòng)子提供了另一種思路，有可能創(chuàng)造出自然界不存在的高強(qiáng)度的人工啟 動(dòng)子。ProBioGen公司，克隆了細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的啟動(dòng)子，強(qiáng)度比CMV強(qiáng)，非細(xì)胞周期依賴(lài)， 能夠?qū)够虺聊诩?xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)50代以上，很可能細(xì)胞內(nèi)源性啟動(dòng)子更有利于重組 蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。肽延伸因子在細(xì)胞整個(gè)周期中都處于高表達(dá)，不受細(xì)胞周期影響的看家基因，其 基因座序列可能含有一些有利于基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，與細(xì)胞的反式作用因子共同作 用，促進(jìn)基因的高表達(dá)。我們根據(jù)Genbank的報(bào)告的序列，克隆了 HEK293細(xì)胞的肽延伸因 子1的5'端和3'端4Kb的調(diào)控序列，用來(lái)構(gòu)建不同的表達(dá)載體，以EGFP為報(bào)告基因，確 定了同時(shí)存在肽延伸因子1的5’端和3’端的調(diào)控序列時(shí)EGFP的表達(dá)水平最高，為對(duì)照載 體的7倍。用這個(gè)載體在HEK293細(xì)胞中表達(dá)外源基因tPA和proUK能夠提高表達(dá)2_5倍。肽延伸因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列與我們構(gòu)建的人工轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，能夠提高EGFP的表達(dá)15倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在HEK293細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因的載體。本發(fā)明的另一目的在于提供上述載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于是提供這種載體的調(diào)控元件的核苷酸序列，其具有序列 表中SEQ No. 1和SEQ No. 2所述的序列。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供調(diào)控元件的組合應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，然后提取基因組DNA，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增人HEK293細(xì)胞的 肽延伸因子1的5’端和3’端4kb的調(diào)控序列，用調(diào)控序列的不同組合，以EGFP為報(bào)告 基因，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定EGFP的熒光強(qiáng)度，確定載體的最佳組合，再用外源基因tPA和 proM(prourokinase，尿激酶原)驗(yàn)證其有效性。一種用于HEK293細(xì)胞高效表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，其具有圖2E所示結(jié)構(gòu)。所述的用于HEK293細(xì)胞高效表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，其是對(duì)p⑶NA3. 1 (+)進(jìn)行 改構(gòu)，引物BGH1(SEQ ID No. 7)含Xbal酶切位點(diǎn)，BGH2 (SEQ ID No. 8)含BspEI酶切位點(diǎn)， FORI (SEQ ID No. 9)含 BspEI 酶切位點(diǎn)，F(xiàn)0R2 (SEQ ID No. 10)含 Xmal 酶切位點(diǎn)；通過(guò) PCR 的方法以P⑶NA3. 1 (+)為模板，分別擴(kuò)增出200bp和800bp的片斷，膠回收后分別用Xbal、 BspEI酶切200bp的片段，BspEI、Xmal酶切800bp的片斷，Xbal、Xmal酶切后膠回收大片 斷，再將載體與200bp和800bp片斷連接，至此在pcDNA3. 1 (+)的BGHPA處引入BspEI酶切 位點(diǎn)；在改構(gòu)的pcDNA3. 1 (+)的EcoRV處連入EGFP報(bào)告基因得出pcDNA3. 1 (+) /EGFP載體， 利用SEQID No. 1所示的肽延伸因子1基因5’端調(diào)控序列和SEQ ID No. 2所示的肽延伸因 子1基因3’端調(diào)控序列替代替換pcDNA3. 1 (+) /EGFP中的CMV啟動(dòng)子和BGHPA。一種構(gòu)建上述載體的方法，具有如下步驟(1)提取 HEK293 基因組 DNA ；(2)利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示引物擴(kuò)增肽延伸因子1的4Kb的5，端 調(diào)控序列，擴(kuò)增產(chǎn)物含Nhel和Mlul酶切位點(diǎn)，所述肽延伸因子1的5’端調(diào)控序列具有SEQ ID No. 1所示序列；(3)再利用SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示引物擴(kuò)增肽延伸因子1的4Kb的3， 端調(diào)控序列，所述肽延伸因子1的3’端調(diào)控序列具有SEQ ID No. 2所示序列，擴(kuò)增產(chǎn)物含 Xbal和BspEI酶切位點(diǎn)；(4)對(duì) pCDNA3. 1 (+)進(jìn)行改構(gòu)，引物 BGH1 (SEQ ID No. 7)含 Xbal 酶切位點(diǎn)， BGH2 (SEQ ID No. 8)含 BspEI 酶切位點(diǎn)，F(xiàn)ORI (SEQ ID No. 9)含 BspEI 酶切位點(diǎn)，F(xiàn)0R2 (SEQ ID No. 10)含Xmal酶切位點(diǎn)；通過(guò)PCR的方法以pCDNA3. 1 (+)為模板，分別擴(kuò)增出200bp 和800bp的片斷，膠回收后分別用Xbal、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、Xmal酶切800bp 的片斷，Xbal、Xmal酶切后膠回收大片斷，再將載體與200bp和800bp片斷連接，至此在 pcDNA3. 1 (+)的BGHPA處引入BspEI酶切位點(diǎn)；(5)在步驟⑷改構(gòu)的pcDNA3. 1⑴的EcoRV處連入EGFP報(bào)告基因得出 pcDNA3. 1 (+) /EGFP 載體；
(6)利用SEQ ID No. 1所示的肽延伸因子1基因5，端調(diào)控序列和SEQ ID No. 2 所示的肽延伸因子1基因3’端調(diào)控序列替代替換pcDNA3. 1 (+)/EGFP中的CMV啟動(dòng)子和 BGHPA。在上述載體的上游加上人工轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列2UAS。一種用于擴(kuò)增所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控外源基因在HEK293細(xì)胞中高效表達(dá)的5’端核苷酸序 列的引物，所述引物具有SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列。一種用于擴(kuò)增所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控外源基因在HEK293細(xì)胞中高效表達(dá)的3’端核苷酸序 列的引物，所述引物具有SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)本發(fā)明是通過(guò)分子生物學(xué)手段獲得HEK293細(xì)胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄 調(diào)控序列構(gòu)建的表達(dá)載體更適合于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合(2)所獲得的調(diào)控序列在 對(duì)在細(xì)胞周期的所有階段都具有活力，促進(jìn)所調(diào)控的基因在HEK293細(xì)胞中高效表達(dá)。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1人的肽延伸因子1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的PCR產(chǎn)物；圖2含人肽延伸因子1不同序列的載體構(gòu)建(A為pcDNA3. 1 (+)/EGFP載體；B為 HEF/EGFP 載體；C 為 PEF1/EGFP 載體；D 為 cmvHEF3utr/EGFP 載體；E 為 HEF53utr/EGFP 載 體)；圖 3 表達(dá) proUK 和 tPA 的載體圖(A 為 HEF53utr/proUK 載體；B 為 HEF53utr/tPA 載體)；圖4人的肽延伸因子1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列與人工轉(zhuǎn)錄因子序列結(jié)合載體(A為 PcDNA3. l/GVP4/Hygro 載體；B 為 HEF53utr/EGFP 載體)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1人的肽延伸因子1的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的克隆。1.HEK293細(xì)胞基因組DNA序列的提取HEK293細(xì)胞用D/F培養(yǎng)基5%血清培養(yǎng)至細(xì)胞方瓶長(zhǎng)滿(mǎn)，胰酶消化。按 TAKARAGeneBall Genome preparation kit 操作說(shuō)明書(shū)提取 HEK293 細(xì)胞基因組 DNA。2.人的肽延伸因子1的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的克隆根據(jù)Genbank的報(bào)告的序列設(shè)計(jì)如下引物，見(jiàn)SEQ ID No. 3-6所示HuEFl (SEQ ID No. 3) :5-ata acgcgt CCCAAAACAC ATTTACGAGC CTCAACATCGTTACTG-3HuEF2 (SEQ ID No. 4) :5-ata gctagc TCA CGACACCTGA AATGGAAGAA AAAAACTTTGAACC-3HuEF3 (SEQ ID No. 5) 5-ata tctaga ATATTATCC CTAATACCTG CCACCCCACTCTTAATCAGT GG-3HuEF4 (SEQ ID No. 6) :5-ata tccgga CATTAAAAAG TAAGAGATTA CTGATATATACAGGCTCACG-3用引物HuEFl和HuEF2擴(kuò)增肽延伸因子1的4kb的5，端調(diào)控序列，擴(kuò)增產(chǎn)物含Nhel和Mlul酶切位點(diǎn)；包括啟動(dòng)子和內(nèi)含子1的序列，引物HuEF3和HuEF4擴(kuò)增肽延伸因 子1的4kb的3’端調(diào)控序列，擴(kuò)增產(chǎn)物含Xbal和BspEI酶切位點(diǎn)。采用寶生物公司的LA Ta 去 DNA 聚合酶。擴(kuò)增條件為 94°C 5min,94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 4min，30 個(gè)循環(huán)， 72°C延伸lOmin，擴(kuò)增產(chǎn)物1 %瓊脂糖膠回收，與T載體連接。酶切和測(cè)序結(jié)果表明所獲得 的序列為正確序列。實(shí)施例2含人肽延伸因子1不同序列的載體構(gòu)建1.對(duì) pCDNA3. 1(+)進(jìn)行改構(gòu)合成以下引物BGH1(SEQ ID No. 7) 5-TCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAAC-3BGH2(SEQ ID No. 8) :5-ATATCCGGACTCAGAAGCCATAGAGCCCACC_3FORI(SEQ ID No. 9) 5-ATATCCGGAGCGGAAAGAA CCAGCTGGGG-3F0R2(SEQ ID No. 10) 5-TATACAAGCTCCCGGGAGCTTTTTGC-5引物BGH1含Xbal酶切位點(diǎn)，BGH2含BspEI酶切位點(diǎn)，F(xiàn)ORI含BspEI酶切位點(diǎn)， F0R2含Xmal酶切位點(diǎn)。通過(guò)PCR的方法以p⑶NA3. 1⑴為模板，分別擴(kuò)增出200bp和 800bp的片斷，膠回收后分別用Xbal、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、Xmal酶切800bp 的片斷，Xbal、Xmal酶切后膠回收大片斷，再將載體與200bp和800bp片斷連接，至此在 pcDNA3. 1 (+)的BGHPA處引入BspEI酶切位點(diǎn)。2.含EGFP報(bào)告基因不同載體的構(gòu)建在pcDNA3. 1 (+)的 EcoRV 處連入 EGFP 報(bào)告基因，命名為 pcDNA3. 1 (+) /EGFP (圖 2A所示結(jié)構(gòu))，作為對(duì)照載體，然后用1. 7kb的PEF1啟動(dòng)子(來(lái)自invitrogen)替換 pcDNA3. 1 (+) /EGFP中的CMV啟動(dòng)子，構(gòu)建的載體命名為PEF1/EGFP (圖2C所示結(jié)構(gòu))， 用4kb的HEF-alpha啟動(dòng)子替換pcDNA3. 1 (+) /EGFP中的CMV啟動(dòng)子，構(gòu)建的載體命名 為HEF/EGFP (圖2B所示結(jié)構(gòu))，用4kb的HEF-alpha基因3，端通過(guò)Xbal和BsPEI替 換pcDNA3. 1 (+) /EGFP中的BGHPA，命名為cmvHEF3utr/EGFP (圖2D所示結(jié)構(gòu))，同時(shí)用 HEF-alpha基因的5，和3，端調(diào)控序列替換pcDNA3. 1 (+)/EGFP中的CMV啟動(dòng)子和BGHPA， 命名為HEF53utr/EGFP (圖2E所示結(jié)構(gòu))。實(shí)施例3載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞和報(bào)告基因EGFP熒光表達(dá)強(qiáng)度的測(cè)定轉(zhuǎn)染前一天，HEK293細(xì)胞以7. 5X105細(xì)胞鋪板6孔板，細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)，將表 達(dá)載體 pcDNA3. 1/EGFP 與 pcDNAPEF/EGFP、pcDNA HEF5UTR/EGFP, pcDNAHEF5UTR/EGFP/ HEF3UTR、pcDNACMV/EGFP/HEF3UTR ；按等摩爾比轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染試劑用 LipOfectamineTM2000，操作方法按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，一孔6孔板接種至一板24孔板，24h后待細(xì)胞貼 壁后，培養(yǎng)基換為含抗生素G418 0.3mg/ml。3_4d換一次液。直到2周后待陽(yáng)性克隆長(zhǎng)出。 胰酶消化，收集陽(yáng)性細(xì)胞，2000r/min離心5min，用PBS懸浮細(xì)胞，用非轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞 作空白對(duì)照，用Clonetech公司流式細(xì)胞儀BDFACS Calibur測(cè)定EGFP熒光強(qiáng)度，細(xì)胞總數(shù) 設(shè)定為100000，結(jié)果見(jiàn)表1。表1不同載體表達(dá)的熒光強(qiáng)度單位 實(shí)施例4用人的肽延伸因子1的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列表達(dá)proUK和tPA通過(guò)實(shí)施例3表明載體HEF53utr/EGFP表達(dá)EGFP的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，表明用人的肽 延伸因子1的基因5’和3’端調(diào)控序列在293細(xì)胞中表達(dá)外源基因效果更好，進(jìn)一步用外 源基因proUK和tPA來(lái)驗(yàn)證此載體的效果。通過(guò)Nhel和Xhol酶切位點(diǎn)在HEF53utr/EGFP上，用proUK和tPA基因替換EGFP 基因，構(gòu)成載體HEF53utr/proUK(圖3A所示結(jié)構(gòu))、HEF53utr/tPA (圖3B所示結(jié)構(gòu))。載 體用Sail線性化后，用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，0. 3mg/ml G418篩 選陽(yáng)性細(xì)胞，2周后采用體外纖維蛋白瓊脂板溶圈法檢測(cè)proM和tPA體外纖維蛋白溶解活 性。結(jié)果見(jiàn)下表2表2載體表達(dá)proUK和tPA結(jié)果 實(shí)施例5用人的肽延伸因子1的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列與人工轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合促進(jìn)EGFP 的高效表達(dá)在實(shí)施例3的表達(dá)載體HEF53utr/EGFP的上游加上人工轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列2UAS， 與表達(dá)人工轉(zhuǎn)錄因子的載體PcDNA3. l/GVP4/Hygro (圖4A所示結(jié)構(gòu))(見(jiàn)文章李世崇等， 人工轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)外源基因在CH0細(xì)胞中的高效表達(dá)，生物工程學(xué)報(bào)，2007，vol. 23(1) 21-26)共轉(zhuǎn)染，用抗生素新霉素、潮霉素雙篩選，兩個(gè)星期后，克隆細(xì)胞用流式測(cè)定EGFP表 達(dá)強(qiáng)度，與PcDNA3. 1/EGFP和HEF53utr/EGFP (圖4B所示結(jié)構(gòu))比較能夠提高表達(dá)15倍和 2倍，結(jié)果見(jiàn)表3。表3人工轉(zhuǎn)錄因子與載體結(jié)合表達(dá)的熒光強(qiáng)度單位
8
權(quán)利要求
一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控外源基因在HEK293細(xì)胞中高效表達(dá)的5’端核苷酸序列，其具有序列表中SEQ ID No.1所述的序列。
2.一種調(diào)控外源基因在HEK293細(xì)胞中高效表達(dá)的3’端核苷酸序列，其具有序列表中 SEQ ID No. 2所述的序列。
3.人的肽延伸因子1的基因5’端和3’端轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列組合構(gòu)建的高效表達(dá)載體。
4.一種用于HEK293細(xì)胞高效表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，其特征在于，其具有圖2E所示 結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于HEK293細(xì)胞高效表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，其特征在 于，其是對(duì)PCDNA3. 1⑴進(jìn)行改構(gòu)，引物BGH1(SEQ ID No. 7)含Xbal酶切位點(diǎn)，BGH2 (SEQ ID No. 8)含 BspEI 酶切位點(diǎn)，F(xiàn)ORI (SEQ ID No. 9)含 BspEI 酶切位點(diǎn)，F(xiàn)0R2 (SEQ ID No. 10)含 Xmal酶切位點(diǎn)；通過(guò)PCR的方法以pCDNA3. 1 (+)為模板，分別擴(kuò)增出200bp和800bp的片 斷，膠回收后分別用XbaI、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、XmaI酶切800bp的片斷，Xbal、 Xmal酶切后膠回收大片斷，再將載體與200bp和800bp片斷連接，至此在pcDNA3. 1 (+)的 BGHPA處引入BspEI酶切位點(diǎn)；在改構(gòu)的pcDNA3. 1 (+)的EcoRV處連入EGFP報(bào)告基因得出 pcDNA3. 1 (+)/EGFP載體，利用SEQ ID No. 1所示的肽延伸因子1基因5，端調(diào)控序列和SEQ ID No. 2所示的肽延伸因子1基因3’端調(diào)控序列替代替換pcDNA3. 1 (+)/EGFP中的CMV啟 動(dòng)子和BGHPA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于HEK293細(xì)胞高效表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，其特征在 于，在權(quán)利要求5所述載體的上游加上人工轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列2UAS。
7.—種構(gòu)建權(quán)利要求5所述載體的方法，其特征在于，具有如下步驟(1)提取HEK293基因組DNA；(2)利用SEQID No. 3和SEQ ID No. 4所示引物擴(kuò)增肽延伸因子1的4Kb的5，端調(diào)控 序列，擴(kuò)增產(chǎn)物含Nhel和Mlul酶切位點(diǎn)，所述肽延伸因子1的5’端調(diào)控序列具有SEQ ID No. 1所示序列；(3)再利用SEQID No. 5和SEQ ID No. 6所示引物擴(kuò)增肽延伸因子1的4Kb的3，端調(diào) 控序列，所述肽延伸因子1的3’端調(diào)控序列具有SEQ ID No. 2所示序列，擴(kuò)增產(chǎn)物含Xbal 和BspEI酶切位點(diǎn)；(4)對(duì)pCDNA3. 1 (+)進(jìn)行改構(gòu)，引物 BGH1 (SEQ ID No. 7)含 Xbal 酶切位點(diǎn)，BGH2 (SEQ ID No. 8)含 BspEI 酶切位點(diǎn)，F(xiàn)ORI (SEQ ID No. 9)含 BspEI 酶切位點(diǎn)，F(xiàn)0R2 (SEQID No. 10) 含Xmal酶切位點(diǎn)；通過(guò)PCR的方法以p⑶NA3. 1⑴為模板，分別擴(kuò)增出200bp和800bp的片 斷，膠回收后分別用XbaI、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、XmaI酶切800bp的片斷，Xbal、 Xmal酶切后膠回收大片斷，再將載體與200bp和800bp片斷連接，至此在pcDNA3. 1 (+)的 BGHPA處引入BspEI酶切位點(diǎn)；(5)在步驟⑷改構(gòu)的pcDNA3.1(+)的EcoRV處連入EGFP報(bào)告基因得出pcDNA3. 1(+)/ EGFP載體；(6)利用SEQID No. 1所示的肽延伸因子1基因5’端調(diào)控序列和SEQ ID No. 2所示的 肽延伸因子1基因3’端調(diào)控序列替代替換pcDNA3. 1 (+)/EGFP中的CMV啟動(dòng)子和BGHPA。
8.—種構(gòu)建權(quán)利要求6所述載體的方法，其特征在于，在權(quán)利要求6所述步驟(6)制備 得到都得載體上游加上人工轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列2UAS。
9.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控外源基因在HEK293細(xì)胞中高效表達(dá)的5’端 核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物具有SEQ ID No.3*SEQ IDNo.4所示序列。
10.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控外源基因在HEK293細(xì)胞中高效表達(dá)的3’ 端核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物具有SEQ ID No. 5和SEQ IDNo.6所示序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種構(gòu)建在HEK293細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因的載體的方法，構(gòu)建這種載體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的核苷酸序列。用構(gòu)建的高效表達(dá)載體表達(dá)外源基因EGFP、proUK、tPA分別是對(duì)照載體的7倍、5倍、和2倍與人工轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能夠促進(jìn)EGFP的表達(dá)與PcDNA/3.1/EGFP比較能夠提高15倍。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101864420SQ201010164368
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月6日
發(fā)明者劉興茂, 劉紅, 葉玲玲, 吳本傳, 李世崇, 王啟偉, 陳昭烈 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所