專(zhuān)利名稱(chēng)：一種大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，涉及偽狂犬病毒疫苗大規(guī)模生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
偽狂犬病毒(PRV)屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，具有在細(xì)胞生長(zhǎng)物上快速生 長(zhǎng)，強(qiáng)烈的嗜神經(jīng)性與潛伏感染等特性。該病毒在自然條件下可感染豬、牛、羊、犬、貓、家 兔、小白鼠、水貂、狐等各種家畜和野生動(dòng)物。豬是該病毒的儲(chǔ)存者和傳播者，主要表現(xiàn)為 妊娠母豬流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎，初生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭甚至死亡，死亡率幾乎 100 %，斷奶仔豬發(fā)病率為20 40 %，死亡率為10 20 %，該病已成為目前種豬繁殖障礙 綜合癥的主要病因并逐年呈上升趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失，因此注射疫苗是預(yù)防本 病的主要措施。目前我國(guó)生物制品生產(chǎn)中培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞如非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、豬腎細(xì) 胞(ΡΚ15)細(xì)胞等多采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，但其生產(chǎn)中細(xì)胞所能增殖的區(qū)域僅限于培養(yǎng)瓶的 有限面積，培養(yǎng)的環(huán)境條件難以監(jiān)測(cè)和控制，因此細(xì)胞密度低，而且勞動(dòng)強(qiáng)度大，操作過(guò)程 易污染，疫苗產(chǎn)量及質(zhì)量受到極大限制。目前偽狂犬疫苗生產(chǎn)存在的問(wèn)題如下一、勞動(dòng)強(qiáng) 度大，占地空間大；二、單位體積提供的細(xì)胞生長(zhǎng)面積有限，細(xì)胞密度低；三、培養(yǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)和 控制環(huán)境條件受到限制，批間差異大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種偽狂犬病毒疫苗大規(guī)模生產(chǎn)方法。本發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(a)在具有潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的生物反應(yīng)器中，添加網(wǎng)狀的聚酯纖維作 為載體，接種制苗用細(xì)胞；(b)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度，接種偽狂犬病毒，使所述偽狂犬病毒感染細(xì)胞；(c)使病毒在適宜的條件下大量增殖；(d)細(xì)胞病變率(CPE)達(dá)70%以上時(shí)收獲病毒；(e)將收獲的病毒液凍融1 2次，使細(xì)胞完全脫落、分散，加入凍干保護(hù)劑，混勻， 定量分裝，凍干。本發(fā)明所述生物反應(yīng)器是潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，主要由載體罐、儲(chǔ)液罐、PH 控制器、DO監(jiān)測(cè)器、輸入和輸出系統(tǒng)。該生物反應(yīng)器工作過(guò)程如下①細(xì)胞貼附生長(zhǎng)在載體 罐的載體上，當(dāng)儲(chǔ)液罐的培養(yǎng)液被泵入載體罐時(shí)，培養(yǎng)液液面上升向細(xì)胞供給養(yǎng)分并促進(jìn) 細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)物的去除。②當(dāng)載體罐的培養(yǎng)液泵入儲(chǔ)液罐時(shí)，培養(yǎng)液隨之下降，使細(xì)胞進(jìn) 行通風(fēng)供氧。這個(gè)重復(fù)的運(yùn)動(dòng)使載體上的細(xì)胞能夠得到足夠的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，同時(shí)產(chǎn)生的代 謝廢物如CO2能夠有效的被排出去。其中培養(yǎng)基的灌流速度隨著所培養(yǎng)細(xì)胞的不同、接種 病毒的不同而不同。在本發(fā)明中，可用于本發(fā)明的制苗用細(xì)胞為可增殖偽狂犬病毒的細(xì)胞系，如非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、豬腎細(xì)胞(PK15)、牛腎細(xì)胞(MDBK)、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)等。在本發(fā) 明的較佳實(shí)施方案中宜采用PK15細(xì)胞，偽狂犬病毒對(duì)PK15細(xì)胞具有較高的敏感性，適宜于
病毒增殖。細(xì)胞接種于載體時(shí)的，細(xì)胞的密度可在2 4X 107cell/g載體，較 佳為 3X 107cell/g載體，能夠在較短時(shí)間、細(xì)胞損耗較少的情況下吸附于載體，培養(yǎng)達(dá)到接種 病毒的細(xì)胞密度。接種病毒時(shí)細(xì)胞的密度5. OX IO8 8. OX 108cell/g載體，接種病毒的 Μ. 0. I. = 0. 01 0. 1。本發(fā)明中培養(yǎng)細(xì)胞和增殖病毒設(shè)置的液體灌流速度較適宜的參數(shù)為細(xì)胞貼附程序:up2400 2800mL/min、hold 10 20s，Down2400 2800mL/ min、hold 5 15s ；細(xì)胞培養(yǎng)程序up 1800 2200mL/min、hold 5 15s，Down 1800 2200mL/min、hold lmin45s 2minl5s。病毒吸附程序:up 2100 2500mL/min、hold lmin50s 2minl0s，Down 2100 2500mL/min、hold 15 25s ；病毒繁殖程序up 1700 2100mL/min、hold 15 25s，Down 1700 2100mL/min、hold lmin50s 2minl0s。細(xì)胞貼附和(或)病毒吸附程序?yàn)? 4h后置換為細(xì)胞培養(yǎng)程序和(或)病毒
繁殖程序。液體的最大換液量隨著載體罐的體積而有所不同。在本發(fā)明中，最大換液量在 17 19L之間，較佳的為18L，既能保持充足的氣體交換，又能提供做夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在本發(fā)明中，生物反應(yīng)器內(nèi)的最有利于細(xì)胞和病毒增殖的條件為最適宜的溫度 為37°C ；二氧化碳濃度為2. 5% 5%，較佳的為3. 5% ；溶氧90%以下；pH值7. 0 7. 4， 較佳的為7. 2。偽狂犬病毒能夠引起細(xì)胞的病變，所以通過(guò)細(xì)胞病變率(CPE)決定病毒收獲時(shí) 機(jī)，當(dāng)CPE達(dá)70%以上時(shí)可收獲病毒。通過(guò)接種細(xì)胞觀察細(xì)胞病變，按Reed和Muench法計(jì) 算TCID5tl，在本發(fā)明中毒液每1. Oml病毒含量彡IO8 0TCID500本發(fā)明使用過(guò)的微載體，通過(guò)以下方法滅菌后可再次利用將PBS(磷酸鹽緩沖液 0. 01mol/L pH 7. 2)淹沒(méi)載體；121°C消毒30分鐘，消毒后，排空PBS0本發(fā)明大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，特點(diǎn)在于(1)本發(fā)明生產(chǎn)規(guī)模大，產(chǎn)量高；解決了生產(chǎn)生物制品傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶大規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)量 不高，勞動(dòng)強(qiáng)度大，成本高的問(wèn)題。(2)本發(fā)明中以聚酯纖維為載體，細(xì)胞貼壁面積大，Ig載體能夠提供2400cm2的細(xì) 胞貼壁面積，單位體積大大提高了細(xì)胞的生長(zhǎng)面積，解決了轉(zhuǎn)瓶工藝中細(xì)胞密度低的問(wèn)題， 提高了單位體積的病毒含量。(3)本發(fā)明提供的方法可以全封閉生產(chǎn)，自動(dòng)換液，減少了污染的機(jī)率，產(chǎn)品質(zhì)量 均一穩(wěn)定，批間差異小。解決了傳統(tǒng)工藝僅能控制溫度和轉(zhuǎn)速，不同批次質(zhì)量差異大批間差 異大的問(wèn)題。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1偽狂犬病毒疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)本實(shí)施例中采用的生物反應(yīng)器是美國(guó)CESCO公司生產(chǎn)的TideCel 1-020型，載體罐體積為20L，培養(yǎng)基袋體積為500L。采用的載體為該公司生產(chǎn)的BioNoc II聚酯纖維，該纖 維是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有親水性和生物無(wú)害性，Ig載體約提供2400cm2的貼壁面積，能夠提供約 1.0X109細(xì)胞的生長(zhǎng)空間，每升載體罐體積需要數(shù)量為Ilg的BioNoc II聚酯纖維。 (1)制備制苗用豬腎細(xì)胞(PK15)種子液，使細(xì)胞總數(shù)達(dá)到5X109。(2)向含有載體的載體罐中加入步驟(1)所述的PK15細(xì)胞種子液，向培養(yǎng)基袋加 Λ 500L^ 5%ψMMWDMEM(Dulbecco ‘ s modificationof Eagle' s medium Dulbecco) 細(xì)胞生長(zhǎng)液，同時(shí)連接載體罐與培養(yǎng)基袋。(3)在37°C、pH 7. 2、3. 5% CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置培養(yǎng)參數(shù)如下，細(xì)胞貼 附程序up 2600mL/min、hold 15s, Down 2600mL/min、hold IOs ；此過(guò)程持續(xù) 4h ；切換細(xì)胞
:up 2000mL/min>holdl0s, Down 2000mL/min> hold 2min。(4)待細(xì)胞濃度達(dá)到6. O X IO8Cel 1/g載體，將DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液全部抽出，換上2% 牛血清的DMEM細(xì)胞維持液，接種感染復(fù)數(shù)M.0. I. = 0.05的偽狂犬病毒。(5)在37°C、pH 7.2,3.5% CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)病毒；設(shè)置培養(yǎng)參數(shù)如下，病毒吸 附程序up 2300mL/min、hold 2min，Down2300mL/min、hold 20s ；此過(guò)程持續(xù) 3h ；切換病毒 MMfMj^ :upl900mL/min>hold 20s, Down 1900mL/min> hold 2min。(6)細(xì)胞病變率(CPE)達(dá)70%以上時(shí)收獲病毒。偽狂犬病毒抗原液的檢驗(yàn)按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》2005年版第三部附錄 15頁(yè)、19頁(yè)、20頁(yè)進(jìn)行檢驗(yàn)，無(wú)細(xì)菌和霉菌、支原體、外源病毒污染。安全性和免疫原性均符 合《中華人民共和國(guó)獸藥生物制品規(guī)程》198頁(yè)。測(cè)定病毒含量方法如下將PK15細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板中，每孔細(xì)胞含量為 1 X IO4個(gè)，培養(yǎng)16 24h備用；按含毒組織量用DMEM培養(yǎng)液將毒種做10倍系列稀釋?zhuān)?取10_3、10_4、10_5、10_6、10人ΙΟ"8六個(gè)稀釋度各接種上述制備好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔
0. lml，每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)重復(fù)。觀察細(xì)胞病變率(CPE)，計(jì)算TCID5tlt5細(xì)胞制苗毒液每
1. Oml 病毒含量彡 ΙΟ8'0TCID500(7)將收獲的檢驗(yàn)合格的病毒液置-20°C和20°C之間凍融2次，使細(xì)胞完全脫落、 分散，加入脫脂奶，混勻，定量分裝，凍干。實(shí)施例2偽狂犬病毒疫苗的檢驗(yàn)(1)性狀檢驗(yàn)微黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，加PBS (0. 01mol/L pH7. 2)后迅速溶解，呈 均勻的懸液。(2)純粹檢驗(yàn)按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》2005年版第三部附錄15頁(yè)、19頁(yè)、 20頁(yè)進(jìn)行檢驗(yàn)，無(wú)細(xì)菌和霉菌、支原體、外源病毒污染。(3)病毒含量按瓶簽注明頭份用PBS (0. 01mol/LpH7. 2)稀釋?zhuān)磳?shí)施例1步驟 (6)中測(cè)定病毒含量的方法測(cè)定，每頭份的病毒含量> 5000TCID50O(4)安全檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份用PBS(0. 01mol/L pH7. 2)稀釋為每5ml含14頭 份，肌肉注射6 18月無(wú)偽狂犬病病毒中和抗體的綿羊2只，每頭5ml，觀察14日，無(wú)臨床 反應(yīng)。結(jié)果如表1。 表1注射疫苗綿羊的臨床癥狀綿羊編號(hào)觀察天數(shù)_臨床癥狀_
0900114d精神狀態(tài)良好，體溫正常，皮膚
沒(méi)有瘙癢癥狀
0900214d 精神狀態(tài)良好，體溫正常，皮膚 _沒(méi)有瘙癢癥狀_(5)效力檢驗(yàn)按瓶簽注明頭份用PBS稀釋為每Iml含0. 2個(gè)使用劑量，肌肉接種 6 18月齡綿羊4頭，每頭lml，14日后連同條件相同的無(wú)偽狂犬病病毒中和抗體對(duì)照綿羊 3頭，每頭肌肉注射強(qiáng)毒lml (IOOOLD50)，觀察14天，對(duì)照綿羊2頭發(fā)病死亡，免疫綿羊全部 保護(hù)為合格。如表2。表2實(shí)驗(yàn)綿羊與對(duì)照組的動(dòng)物反應(yīng)
注射疫苗后反應(yīng) 注射強(qiáng)毒后反應(yīng)死亡日期
精神狀態(tài)良好，體溫精神狀態(tài)良好，體溫在 實(shí)驗(yàn)組稩押識(shí)&民燈，件敘P2日略有升高，皮膚 均健康成活
. 正常，沒(méi)有瘙瘁癥狀 沒(méi)有瘙癢癥狀
+皿,口精神沉郁，體溫升高’攻毒后4、5天各死
對(duì)照組------------------------一只，另一只存活，
皮膚有瘙癢癥狀 但精神沉郁，身體削
_____M_(6)剩余水分、真空度測(cè)定按照《中華人民共和國(guó)獸藥生物制品規(guī)程》2000年版 第三部附錄438、437頁(yè)進(jìn)行，符合規(guī)定。實(shí)施例3懸浮培養(yǎng)工藝與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)比較在本發(fā)明中對(duì)TideCell和3000ml轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)做了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3。表3不同培養(yǎng)系統(tǒng)增殖偽狂犬病毒的相關(guān)比較一培養(yǎng)方式 TideCell-020懸浮培養(yǎng)系統(tǒng) 3000ml轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng) 細(xì)胞貼壁面積528000cm21250cm2
產(chǎn)量比值. 1個(gè)微載體培養(yǎng)系統(tǒng)423個(gè)轉(zhuǎn)瓶
占地面積20 m2150m2
人工投入2個(gè)人x4h30個(gè)人x8h
風(fēng)險(xiǎn)暴露點(diǎn)<20個(gè)423個(gè)
耗材成本低高 清洗成本低高
收獲抗原500L423x300ml=126.9L
操作工藝. 全自動(dòng)微電腦控制_程序繁瑣_本發(fā)明中使用的TideCell-020懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)載體罐體積為20L，載體為BioNoc II聚酯纖維，添加載體220g，Ig載體能夠提供2400cm2的細(xì)胞貼壁面積，若要達(dá)到和 TideCel 1-020相同的貼壁面積則需要423個(gè)3000ml的轉(zhuǎn)瓶，然而獲得的抗原量是轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng) 的3倍還多。整個(gè)TideCell采用全自動(dòng)封閉式培養(yǎng)，需要的人力明顯低于轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)，并且 抗原液污染的機(jī)率也明顯降低。再?gòu)暮牟某杀旧媳容^，TideCell僅需要懸浮培養(yǎng)的整個(gè)系 統(tǒng)，而轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)則需要大量的轉(zhuǎn)瓶和轉(zhuǎn)瓶機(jī)。從清洗成本上，TideCell若采用拋棄式的設(shè) 備則清洗成本為0，若采用原地滅菌式則只需要對(duì)系統(tǒng)做整體滅菌，而轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)則需要對(duì)成 百甚至上千的瓶子進(jìn)行清洗滅菌，不僅消耗清洗成本，而且消耗人力。因此，采用TideCell懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，能夠提高細(xì)胞的生長(zhǎng)密度，節(jié)約資源消耗，實(shí) 現(xiàn)對(duì)同批產(chǎn)品的質(zhì)量控制，生產(chǎn)出產(chǎn)品規(guī)模大、成本低、品質(zhì)高的偽狂犬病毒疫苗。
權(quán)利要求
一種大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于包括下列步驟(a)在具有潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的生物反應(yīng)器中，添加網(wǎng)狀的聚酯纖維作為載體，接種制苗用細(xì)胞；(b)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度，接種偽狂犬病毒，使所述偽狂犬病毒感染細(xì)胞；(c)使病毒在適宜的條件下大量增殖；(d)細(xì)胞病變達(dá)70％以上時(shí)收獲病毒；(e)將收獲的病毒液凍融1～2次，使細(xì)胞完全脫落、分散，加入凍干保護(hù)劑，混勻，定量分裝，凍干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于生物反應(yīng)器中每IL載體罐中添加Ilg載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于生物反應(yīng)器中載體罐的最大換液量為17 19L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于制苗用細(xì)胞選自可增殖偽狂犬病毒的非洲綠猴腎細(xì)胞、豬腎細(xì)胞、牛腎細(xì)胞或雞胚成纖維細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于制苗用細(xì)胞為豬腎細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于制苗用細(xì)胞接種于載體時(shí)的密度為2 4X107cell/g載體；接種病毒時(shí)的細(xì)胞密度為5. OXlO8 8. 0X108cell/g載體，接種偽狂犬病毒的M. 0. I. = 0.01 0. 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于接種制苗用細(xì)胞后參數(shù)設(shè)置為，細(xì)胞貼附程序up 2400 2800mL/min、hold 10 20s，Down 2400 2800mL/min、hold 5 15s ；細(xì)胞培養(yǎng)程序up 1800 2200mL/min、hold 5 15s，Down 1800 2200mL/min、hold lmin45s 2minl5s。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于增殖病毒參數(shù) 設(shè)置為，病毒吸附程序up 2100 2500mL/min、hold lmin50s 2minl0s，Down 2100 2500mL/min、hold 15 25s ；病毒繁殖程序up 1700 2100mL/min、hold 15 25s，Down 1700 2100mL/min、hold lmin50s 2minl0s。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于生物反應(yīng)器內(nèi)條件為溫度37°C，二氧化碳濃度2. 5% 5%，溶氧90%以下，pH值7. 0 7. 4。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于細(xì)胞貼附和(或)病毒吸附程序啟動(dòng)3 4h后置換為細(xì)胞培養(yǎng)程序和(或)病毒繁殖程序。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病毒疫苗的方法，包括下列步驟(a)在具有潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的生物反應(yīng)器中，添加網(wǎng)狀的聚酯纖維作為載體，接種制苗用細(xì)胞；(b)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度，接種偽狂犬病毒，使所述偽狂犬病毒感染細(xì)胞；(c)使病毒在適宜的條件下大量增殖；(d)細(xì)胞病變達(dá)70％以上時(shí)收獲病毒；(e)將收獲的病毒液凍融1～2次，使細(xì)胞完全脫落、分散，加入凍干保護(hù)劑，混勻，定量分裝，凍干。該工藝具有穩(wěn)定性好、過(guò)程控制指標(biāo)明確、可控性強(qiáng)、操作容易、生產(chǎn)規(guī)模大等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12M3/02GK101804203SQ20101016655
公開(kāi)日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者喬榮岑, 習(xí)向鋒, 孫進(jìn)忠, 張海洋, 張?jiān)S科, 李三, 陶家權(quán), 駱愛(ài)芳 申請(qǐng)人:洛陽(yáng)普萊柯生物工程有限公司