專(zhuān)利名稱(chēng)：重組甲型h1n1流感病毒滅活疫苗株(sc/pr8)的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組基因工程疫苗，具體地，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防動(dòng)物和人甲型 Hmi流感的重組基因工程疫苗，更具體地，本發(fā)明所涉及的疫苗是一種用于預(yù)防動(dòng)物和人甲型Hmi流感的重組甲型Hmi流感病毒滅活疫苗。
背景技術(shù)：
A型流感病毒是一種能廣泛感染禽類(lèi)和哺乳動(dòng)物的分節(jié)段的負(fù)鏈RNA構(gòu)成的囊膜病毒。在全世界，流感常以零星暴發(fā)兼雜隨機(jī)的大流行的形式出現(xiàn)，在過(guò)去的幾十年里，各國(guó)家主要選擇利用的仍然是全病毒滅活苗，它主要刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫抵抗相同亞型的血凝素表面糖蛋白。截至2009年12月，開(kāi)始于墨西哥的甲型Hmi流感的大流行，已在全球造成超過(guò) 1萬(wàn)人死亡，并且疫情仍在繼續(xù)擴(kuò)大。為了對(duì)應(yīng)疫情的發(fā)展，我們進(jìn)行了自然重組疫苗株的研制。理想的疫苗株應(yīng)具備與流行株良好的抗原匹配性，對(duì)雞胚無(wú)致病力及雞胚高滴度生長(zhǎng)性等條件。然而，很難從自然界分離具備上述條件的毒株作為疫苗株。在國(guó)內(nèi)，由于現(xiàn)地分離的野毒株雞胚適應(yīng)性較差，致使現(xiàn)行國(guó)內(nèi)的甲型Hmi流感疫苗存在成本高、疫苗免疫期短等缺點(diǎn)。流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)(簡(jiǎn)稱(chēng)PR8)是實(shí)驗(yàn)室雞胚適應(yīng)株，即該病毒可在雞胚內(nèi)生長(zhǎng)至很高滴度，這種雞胚適應(yīng)性由病毒的6個(gè)內(nèi)部基因決定。另外，當(dāng)兩個(gè)流感病毒共同感染一個(gè)細(xì)胞或雞胚時(shí)，可發(fā)生基因互換，從而產(chǎn)生新的基因重組病毒。因此，通過(guò)遺傳重組方法，可將流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)的6個(gè)內(nèi)部基因和流行株的HA、NA基因的進(jìn)行重組而獲得一個(gè)新的重組病毒，該重組病毒具有與HA和NA基因供體毒株一致的抗原性，同時(shí)還具有流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)的雞胚高滴度生長(zhǎng)特性。人工自然重組技術(shù)是一種簡(jiǎn)單有效的構(gòu)建2:6重組病毒疫苗株方法，流感病毒的基因組由8個(gè)分段的負(fù)鏈RNA片段組成，當(dāng)2個(gè)病毒共同感染雞胚或細(xì)胞時(shí)，其基因組片段會(huì)發(fā)生互換，從而產(chǎn)生一些新的重組病毒(reassortant)，通過(guò)血清的處理，則能夠有效的篩選 2:6 重組病毒疫苗株。(Hualan Chen, Vaccine 2003)

發(fā)明內(nèi)容
我們利用人工重組方法，以2009年世界大流行的甲型流感，中國(guó)內(nèi)地首例甲型 Hmi流感分離株A/SC/1/2009 (Hmi)(簡(jiǎn)稱(chēng)SC)為表面抗原血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA) 基因供體，以流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)(簡(jiǎn)稱(chēng)PR8)為6個(gè)內(nèi)部基因(PB2, PBl, PA, NP, M 和NQ供體，自然重組得到了 1株基因重組病毒，命名為SC/PR8 (HlNl)(簡(jiǎn)稱(chēng)為SC/PR8)。 即，本發(fā)明選用流感病毒A/PR/8/34(HlNl)的可在雞胚內(nèi)生長(zhǎng)至很高滴度的實(shí)驗(yàn)室雞胚適應(yīng)株的6個(gè)內(nèi)部基因作為骨架基因，并選用2009年流感大流行國(guó)內(nèi)甲型流感病毒分離株A/SC/1/2009 (HlNl)的HA和NA基因作為表面基因，利用自然重組方法，制備了重組病毒SC/ PR8。將可以作為甲型Hmi流感的疫苗株。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SC/PR8與我國(guó)甲型Hmi流感病毒流行株A/SC/1/2009 (HlNl)抗原性一致，將對(duì)甲型Hmi流感病毒流行株A/SC/1/2009(H1N1)產(chǎn)生良好的特異保護(hù)性。該病毒含有雞胚高滴度適應(yīng)株流感病毒A/PR/8/34(HlNl)的6個(gè)內(nèi)部基因，因此具有良好的雞胚適應(yīng)性，病毒生長(zhǎng)滴度與野毒相比，可提高10倍以上；以此為疫苗株生產(chǎn)疫苗，可大大降低疫苗生產(chǎn)成本，提高疫苗質(zhì)量。因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們制備了一個(gè)優(yōu)良的病毒株，這為甲型Hmi流感疫苗的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究，奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)1. 一種重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株，其特征在于表達(dá)甲型Hmi流感病毒的表面抗原血凝素蛋白和神經(jīng)氨酸酶蛋白。2.根據(jù)以上1所述的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株，其還表達(dá)雞胚適應(yīng)疫苗株的6個(gè)蛋白聚合酶PB2亞基(PB2)，聚合酶PBl亞基(PBl)，聚合酶PA亞基(PA)JS 蛋白(NP)，基質(zhì)蛋白(M)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)03.根據(jù)以上2的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株，其中所述雞胚適應(yīng)疫苗株是流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)(簡(jiǎn)稱(chēng)PR8)。4.根據(jù)以上1至3中任一項(xiàng)的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株，其中所述 HA蛋白和NA蛋白的氨基酸序列來(lái)源于甲型Hmi流感分離株A/SC/1/2009 (Hmi)。5. 一種生產(chǎn)根據(jù)以上1-4任何一項(xiàng)的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株的方法，該方法包括(1)用甲型Hmi流感病毒株和雞胚適應(yīng)疫苗株共同接種雞胚尿囊腔或細(xì)胞進(jìn)行自然重組；(2)用抗所述雞胚適應(yīng)疫苗株的抗體篩選，除去表面基因來(lái)源于所述雞胚適應(yīng)疫苗株的毒株；和(3)稀釋純化，除去內(nèi)部基因來(lái)源于所述甲型Hmi流感病毒株的毒株。6.根據(jù)以上5所述的方法，其中所述雞胚適應(yīng)疫苗株是流感病毒A/ PR/8/34 (HlNl)(簡(jiǎn)稱(chēng) PR8)。7.根據(jù)以上5所述的方法，其中所述甲型Hmi流感病毒是甲型Hmi流感分離株 A/SC/1/2009(HlNl)。8.根據(jù)以上5-7任一項(xiàng)所述的方法獲得的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株。9.重組甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株SC/PR8(H1N1)，其保藏號(hào)為CCTCC NO: V201006。10.根據(jù)以上1-4、8或9中任何一項(xiàng)的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株在制備預(yù)防甲型Hmi流感病毒所導(dǎo)致疾病的藥物中的應(yīng)用。11.根據(jù)以上10所述的應(yīng)用，其中所述藥物用于預(yù)防動(dòng)物或人的甲型Hmi流感病
毒感染。生物材料保藏甲型Hmi重組流感病毒Gnfluenza virus)滅活疫苗株SC/PR8 (HlNl)于2010年3月1日保藏于位于中國(guó)武漢的武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO :V201006。


圖 1A.以 PR8 毒株 cDNA 為模板，利用 SC 和 PR8 毒株 PB2、PBl、PA、HA、ΝΡ、ΝΑ、M、 NS基因的特異性引物進(jìn)行的擴(kuò)增，其中第一至第八泳道為使用SC毒株的PB2、PB1、PA、HA、 NP、NA、M、NS基因的特異性引物對(duì)PR8毒株cDNA的擴(kuò)增；M為DNA Marker 2000 ；第九至第十六泳道為使用PR8毒株的PB2、PBl、PA、HA、ΝΡ、ΝΑ、M、NS基因的特異性引物對(duì)PR8毒株 cDNA為模板的擴(kuò)增；圖1B.以5(毒株00嫩為模板，利用？1 8和5(毒株？82、？81、？六、擬、肥、嫩、]\1、賂基因的特異性引物進(jìn)行的擴(kuò)增，其中第一至第八泳道為使用PR8毒株的PB2、PBU PA、HA、 NP、NA、M、NS基因的特異性引物對(duì)SC毒株cDNA為模板的擴(kuò)增；M為DNA Marker 2000 ；第九至第十六泳道為使用SC毒株的PB2、PBl、ΡΑ、ΗΑ、ΝΡ、ΝΑ、M、NS基因的特異性引物對(duì)SC毒株cDNA為模板的擴(kuò)增；圖 2 SC/AAca 重組病毒的 PB2、PBU ΡΑ, ΗΑ、ΝΑ、ΝΡ、M 和 NS 基因的 RT-PCR 擴(kuò)增，1 8泳道重組病毒SC/PR8利用PR8的8對(duì)特異性鑒別引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物； M =DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；10 17泳道重組病毒SC/PR8利用SC的8對(duì)特異性鑒別引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；圖3重組SC/PR8病毒和野生型甲型Hmi流感病毒A/SC/1/2009(H1N1)(簡(jiǎn)稱(chēng)SC) 在最佳培養(yǎng)溫度35°C測(cè)定的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。序列說(shuō)明SEQ ID NoSEQ ID NoSEQ ID NoSEQ ID NoSEQ ID NoSEQ ID NoSEQ ID NoSEQ ID No
具體實(shí)施例方式下文將參考實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。實(shí)驗(yàn)材料1.病毒株A/SC/1/2009 (HlNl) (簡(jiǎn)稱(chēng) SC)A/PR/8/34 (HlNl)(簡(jiǎn)稱(chēng) PR8)均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感中心。2. SPF雞胚及細(xì)胞
1SC7/PR8HA基因；2SC7/PR8NA基因；3SC//PR8PB2基因；4SC//PR8PBl基因；5SC//PR8PA基因；6SC//PR8NP基因；7SC//PR8M基因；和8SC//PR8NS基因。
5
9-11日齡的SPF雞胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF雞胚孵化室， MDCK細(xì)胞(狗腎細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所，低代次Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所。3.主要試劑DATP、dGTP、dCTP、dTTP和rTaq DNA聚合酶購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；RNA提取試劑TRIzol，鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(MLV)試劑盒、DTT、RNaseOUT, Pfx高保真DNA聚合酶、和無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM購(gòu)自hvitrogen公司；膠回收試劑盒與小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司；測(cè)序反應(yīng)試劑盒(CEQTM DTCS Quick Start Kit)購(gòu)自BECKMAN 公司；抗A/PR/8/34 (HlNl)抗血清購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感中心。4.引物分析比較，設(shè)計(jì)合成能擴(kuò)增出甲型Hmi流感分離株A/SC/1/2009 (Hmi)基因的8 個(gè)特異性片段而不能擴(kuò)增出流感病毒A/PR/8/34(HlNl)的任何片段的甲型Hmi流感分離 ^ A/SC/1/2009 (HlNl)的16條鑒別引物，合成引物序列見(jiàn)表1。表1甲型Hmi流感病毒A/SC/l/2009(Hmi)的8個(gè)特異性片段的鑒別引物序列
權(quán)利要求
1.一種重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株，其特征在于表達(dá)甲型Hmi流感病毒的表面抗原血凝素蛋白和神經(jīng)氨酸酶蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株，其還表達(dá)雞胚適應(yīng)疫苗株的6個(gè)蛋白聚合酶PB2亞基，聚合酶PBl亞基，聚合酶PA亞基，核蛋白，基質(zhì)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株，其中所述雞胚適應(yīng)疫苗株是流感病毒 A/PR/8/34 (HlNl)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株，其中所述表面抗原血凝素蛋白和神經(jīng)氨酸酶蛋白的氨基酸序列來(lái)源于甲型Hmi流感分離株A/ SC/1/2009(HlNl)。
5.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株的方法，該方法包括(1)用甲型Hmi流感病毒株和雞胚適應(yīng)疫苗株共同接種雞胚尿囊腔或細(xì)胞進(jìn)行自然重組；(2)用抗所述雞胚適應(yīng)疫苗株的抗體篩選，除去表面基因來(lái)源于所述雞胚適應(yīng)疫苗株的毒株；和(3)稀釋純化，除去內(nèi)部基因來(lái)源于所述甲型Hmi流感病毒株的毒株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述雞胚適應(yīng)疫苗株是流感病毒A/ PR/8/34 (HlNl)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述甲型Hmi流感病毒是甲型Hmi流感分離株 A/SC/1/2009(HlNl)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的方法獲得的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株。
9.重組甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株SC/PR8(HlNl)，其保藏號(hào)為CCTCC NO :V201006。
10.根據(jù)權(quán)利要求1_4、8或9中任何一項(xiàng)的重組的甲型Hmi流感病毒滅活疫苗株在制備預(yù)防甲型Hmi流感病毒所導(dǎo)致疾病的藥物中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求 ο所述的應(yīng)用，其中所述藥物用于預(yù)防動(dòng)物或人的甲型Hmi流感病毒感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組甲型H1N1流感病毒滅活疫苗株，其特征在于表達(dá)甲型H1N1流感病毒的HA蛋白和NA蛋白。更具體地，重組甲型H1N1流感病毒滅活疫苗株是SC/PR8。本發(fā)明還公開(kāi)了用于制備所述重組甲型H1N1流感病毒滅活疫苗株的方法和該重組甲型H1N1流感病毒滅活疫苗株對(duì)預(yù)防動(dòng)物或人的甲型H1N1流感的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N7/01GK102234637SQ201010166788
公開(kāi)日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者喬傳玲, 姜永萍, 施建忠, 李雁冰, 步志高, 田國(guó)彬, 鄧國(guó)華, 陳化蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所