專利名稱：強(qiáng)耐鹽抗旱植物的培育方法及其雙價(jià)表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及培育強(qiáng)耐鹽抗旱植物的方法及其轉(zhuǎn) 基因載體。
背景技術(shù)：
干旱和土壤鹽漬化是制約全球農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的兩個(gè)最主要不利因素。目前，世界上干旱區(qū)總面積約為61億公頃，約占全球陸地面積的40% (《環(huán)球時(shí)報(bào)》2009)。而且，由于 溫室氣體排放，氣溫升高，水分蒸發(fā)加劇，致使某些半濕潤地區(qū)也變成了干旱地區(qū)。此外， 由于干旱和半干旱地區(qū)的強(qiáng)烈蒸發(fā)，使這些地區(qū)的土壤中富集了大量鹽分而使土壤鹽漬 化、荒漠化。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有各種鹽漬土地約9. 5億公頃(Kovda&Szabolcs，Modelling of SoilSalinization and Alkalization. 1979)；而且，由于耕地的次生鹽漬化，鹽漬土地面 積還在不斷增加。隨著社會(huì)不斷進(jìn)步，人口急速膨脹，世界糧食出現(xiàn)嚴(yán)重危機(jī)；因此，在耕地 資源愈趨匱乏和全球生態(tài)日益惡化的形勢(shì)下，對(duì)大面積存在的干旱鹽漬土地資源進(jìn)行開發(fā) 利用變得愈加迫切。然而，令人遺憾的是，全球植物物種的99%，尤其是農(nóng)作物對(duì)干旱和鹽漬環(huán)境的耐 受性都不強(qiáng)(Flowers T J and Colmer T D. 2008. New Phytol. 179(4) :945_63 ；Xiong L M and Zhu J K. Salt Tolerance. The ArabidopsisBook. 2002)；因此，提高農(nóng)作物以及其它植 物的耐鹽抗旱性是開發(fā)利用大面積存在的干旱鹽漬土地資源的重要途徑之一，也是解決糧 食危機(jī)和應(yīng)對(duì)全球氣候變暖的重要手段。然而目前作物性狀的改良主要依賴于傳統(tǒng)育種。 由于遺傳物質(zhì)的雜合性和優(yōu)良品種數(shù)量以及其有限的抗逆性的限制，傳統(tǒng)育種不但費(fèi)時(shí)長(zhǎng) 而且成功幾率小。慶幸的是一方面，植物基因工程可以克服傳統(tǒng)育種的缺陷，突破物種間 優(yōu)良抗逆基因資源轉(zhuǎn)移的障礙，培育出傳統(tǒng)育種方法所不能培育的新品種(系)；另一方 面，干旱鹽漬環(huán)境中的植物在漫長(zhǎng)的生命史中演化出適應(yīng)不良環(huán)境的獨(dú)特機(jī)制，進(jìn)化出大 量對(duì)干旱鹽漬環(huán)境具有強(qiáng)抗性的獨(dú)特抗逆基因資源，為農(nóng)作物抗旱耐鹽性的遺傳改良奠定 了物質(zhì)基礎(chǔ)。為了在干旱鹽漬環(huán)境中生存，植物細(xì)胞必須維持很低的滲透勢(shì)以保證在干旱 條件下根系能從土壤中吸收水分以及減少葉片細(xì)胞的水分散失。盡管植物可以合成大 量“兼性”有機(jī)溶質(zhì)，如糖類(蔗糖)、糖醇類(山梨醇)、氨基酸類(脯氨酸)、甲基化脯 氨酸類化合物(甲基脯氨酸)、甜菜堿類(甘氨酸甜菜堿)和甲基磺酸化合物(β_ 二甲 基巰基丙酸鹽，DMSP) (Hasegawa PM, Bressan R A, Zhu J K, Bohnert H J. 2000. Annual Review of PlantPhysiology and Plant Molecular Biology. 51 463-499 ；Rhodes D, HansonA D. 1993. Annual Review of Plant Physiology and Plant MolecularBiology 44 357-384)等進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)；但其不僅消耗了大量的C源和N源，而且在合成過程中還需要 耗費(fèi)相當(dāng)?shù)哪芰?。因此，合成有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)并不是一種理想的滲透調(diào)節(jié)方式。然而，已 有的研究多集中于“兼性”有機(jī)溶質(zhì)合成基因的遺傳轉(zhuǎn)化。因此，本發(fā)明的動(dòng)因之一是規(guī)避 采用合成有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以提高作物耐鹽抗旱性的不足之處，通過增強(qiáng)無機(jī)離子的吸收與積累以有效提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力。研究表明，干旱鹽漬環(huán)境中的植物可利用大量無機(jī)離子如Na+、K+等進(jìn)行滲透 調(diào)節(jié)。由于Na+會(huì)危害細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各種代謝酶的活性(Blumwald E. 2000. Curr Op in Cell Biol. 12(4) :431-4)，因此，植物細(xì)胞需要將進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的Na+進(jìn)行區(qū)隔以維持正常的生 長(zhǎng)代謝活動(dòng)(Frommer ff B and Rentsch D. 1999. Science. 285 :1222-1223)。由于液泡 占成熟細(xì)胞體積的 80-90% (Schmidt UG, Endler A, Schelbert S, et al. 2007. Plant Physiology. 145 216-229)，因此液泡是大量有害物質(zhì)如Na+等的理想?yún)^(qū)隔場(chǎng)所。離子區(qū) 域化的實(shí)現(xiàn)主要依賴各種離子的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和為膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力的質(zhì)子泵。 因此，提高膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膜質(zhì)子泵的活性或增加其表達(dá)量均可使離子轉(zhuǎn)運(yùn)效率提高。液泡 膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(vacuolar Na+/H+antiporter, NHX)是位于液泡膜上的一種鈉泵，它 利用液泡膜H+-ATPaSe和液泡膜H+-PPaSe建立的跨液泡膜質(zhì)子梯度將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na+ 區(qū)域化到液泡，一方面避免過多Na+對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各種代謝酶的毒害，另一方面又可將Na+作 為一種有益的滲透調(diào)節(jié)劑來降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，從而使植物能更好地適應(yīng)鹽漬和干旱環(huán)境 (Blumwald E. 1987. Physiologia Plantarum, 1987,69 :731_734)。霸王作為一種典型的荒漠多漿旱生植物，可從含鹽量極低的生境中吸收并積累 大量的Na+以降低細(xì)胞滲透勢(shì)來適應(yīng)極端的干旱環(huán)境(Wang S M，WangY R，Chen H，et al. 2004. J. Arid Environ. 56 =525539) 廣泛分布于我國西北荒漠的一霸王(趙一之，朱 宗元.2003.云南植物研究.25(2) 113 121)，在其漫長(zhǎng)的生命進(jìn)化史中孕育出大量而獨(dú)特 的抗逆基因資源，對(duì)極端環(huán)境如強(qiáng)光照、極度干旱、強(qiáng)烈溫差和貧瘠的荒漠土壤等具有很強(qiáng) 的適應(yīng)性(周向睿，周志宇，吳彩霞.2006.草業(yè)科學(xué)，23 (6) :38-41)。因此，本發(fā)明從對(duì)干 旱和鹽漬環(huán)境具有特殊適應(yīng)機(jī)制的荒漠植物霸王中挖掘其特異的抗逆基因一液泡膜Na+/ H+antiporter基因和液泡膜H+-PPaSe基因，用于對(duì)農(nóng)作物和優(yōu)良牧草進(jìn)行抗逆性遺傳改 良，使其更有效地利用土壤中的Na+進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，從而增強(qiáng)其適應(yīng)干旱鹽漬等不良生境的 能力。大量研究表明，超表達(dá)擬南芥液泡膜Na+/H+ antiporter基因和H+-PPaSe基因都 可以顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。1999年，Apse等(Apse M P，Aharon G S，Snedden ff A,et al. 1999. Science. 285 :1256-1258)在擬南芥中鑒定了第一個(gè)高等植物的液泡膜Na+/ H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHXl，并將其在擬南芥中超表達(dá)，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株幼苗在 200mMNaCl處理中仍能正常生長(zhǎng)發(fā)育，而野生植株型則出現(xiàn)黃化枯萎，葉面積變小，生長(zhǎng)受 抑；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株葉片Na+含量比野生型植株的高。Zhang等(Zhang H X， Hodson J N, Williams J P, et al.2001.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 12832-12836)將 AtNHXl轉(zhuǎn)入油菜，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)該蛋白的轉(zhuǎn)基因油菜在200mM NaCl的環(huán)境中能夠正常生長(zhǎng)、 開花和結(jié)實(shí)，但野生型生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻；分析結(jié)果表明，在高鹽條件下，轉(zhuǎn)基因油菜產(chǎn)量和油 的品質(zhì)不受影響。Gaxiola 等(Gaxiola R A, Li J, Undurraga S, et al. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 :11444 11449)首次將帶有35S啟動(dòng)子的AVP1基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，與野 生型相比，發(fā)現(xiàn)AVP1蛋白含量顯著增加的轉(zhuǎn)基因植株幼苗在250mM NaCl中處理10天仍 能正常生長(zhǎng)發(fā)育，而野生植株型則出現(xiàn)黃化枯萎。Bao等(Bao A K，Wang S M, ffu G Q，et al. 2009. PlantScience. 176 =232240)將擬南芥AVP1轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，與野生型相比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn) 基因紫花苜蓿的葉和根中積累了更多的Na+、K+和Ca2+，葉片具有更低的滲透勢(shì)，其耐鹽性和抗旱性也顯著增強(qiáng)。這些研究結(jié)果表明超表達(dá)液泡膜NaYH+antiporter基因或液泡膜 H+-PPaSe基因，的確可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株吸收大量的無機(jī)離子，尤其是把在細(xì)胞質(zhì)中具有 毒害效應(yīng)的Na+區(qū)域化到液泡中作為有益的滲透調(diào)節(jié)劑，進(jìn)而降低了細(xì)胞水勢(shì)，促進(jìn)了細(xì)胞 的水分吸收，增加了組織保水性，從而使植物在水分虧缺或鹽分脅迫下，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱 性和耐鹽性。此外，超表達(dá)擬南芥液泡膜Na+ATantiporter基因和H+-PPaSe基因還可以增 加轉(zhuǎn)基因植物的生物量。He 等(He C X，Yan J Q, Shen G X，et al. 2005. Plant Cell Physiol. 46 =1848-1854)在棉花中超 表達(dá)AtNHXl，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在200mM NaCl處理下， 不但生物量增加，棉纖維更多；而且轉(zhuǎn)基因棉花的光合速率和氮同化速率也比非轉(zhuǎn)基因植 株強(qiáng)。此外，在大田實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因棉花同樣能夠生產(chǎn)更多、質(zhì)量更好的棉纖維。過量表達(dá) AtNHXl的轉(zhuǎn)基因小麥也具有更高的產(chǎn)量。Li等(Li J，Yang H，Peer ff A, et al. 2005. Science. 310 =121125)發(fā)現(xiàn)，液泡膜H+-PPaSe還可控制生長(zhǎng)素的運(yùn)輸、進(jìn)而影響植物的生 長(zhǎng)發(fā)育，如超表達(dá)AVP1可提高生長(zhǎng)素的運(yùn)輸效率，加快細(xì)胞的分裂和植物器官的形成及 增生，和野生型相比，H+-PPase轉(zhuǎn)基因植物具有更多的葉片和更發(fā)達(dá)的根系，生物量提高 60%;相反，avpl-1缺失突變體由于生長(zhǎng)素運(yùn)輸效率的降低，導(dǎo)致根和地上部發(fā)育受到嚴(yán)重 抑制，其生物量大大減少。值得一提的是，植物根系發(fā)達(dá)意味著可從更多的土體中吸收礦質(zhì) 營養(yǎng)和水分，因此可增加其耐貧瘠性和抗旱性。長(zhǎng)期以來培育高產(chǎn)、抗逆境等優(yōu)良性狀兼具的植物品種是每一個(gè)從事植物遺傳改 良科學(xué)家的共同愿望。然而，目前的植物基因工程多是通過轉(zhuǎn)化單個(gè)外源基因來改良植物 單一性狀。雖然，理論上可以通過反復(fù)多次將多個(gè)基因?qū)胪簧矬w中或先將不同基因 轉(zhuǎn)化兩親本，再把獲得的轉(zhuǎn)基因純系雜交獲得聚合多個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植物；但是，考慮 到轉(zhuǎn)基因的位置效應(yīng)和基因表達(dá)的穩(wěn)定性，不同基因間易發(fā)生分離或誘發(fā)沉默，因而其在 實(shí)踐中耗時(shí)長(zhǎng)，篩選困難，難度較大。因此，本發(fā)明的目的是實(shí)現(xiàn)通過一次轉(zhuǎn)化即可獲得雙 價(jià)基因的轉(zhuǎn)化植物，從而大大加速作物遺傳改良育種的進(jìn)程。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因載體在 獲得抗旱耐鹽增產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用，其為本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種強(qiáng)耐鹽抗旱植物的培育方法， 實(shí)現(xiàn)強(qiáng)旱生荒漠植物霸王的兩個(gè)具有協(xié)同耐鹽抗旱功能的基因--液泡膜H+-PPaSe基因 ZxVPl-1和NaYH+antiporter基因ZxNHX—聚合，通過一次轉(zhuǎn)化即可使它們?cè)谵D(zhuǎn)化植物品 種(系)中連鎖超表達(dá)，從而獲得比轉(zhuǎn)單一基因更強(qiáng)的強(qiáng)耐鹽抗旱植物新品種(系)。本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種強(qiáng)耐鹽抗旱植物的培育方法，其主要特點(diǎn)在于，包 括以下步驟(a)將能把Na+從細(xì)胞質(zhì)中區(qū)域化到液泡中的液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Na+/ H+antiporter基因，以及能為液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力并提高生長(zhǎng)素運(yùn)輸 效率的液泡膜氫焦磷酸酶H+-PPaSe基因轉(zhuǎn)化到目標(biāo)植物的細(xì)胞中，并使所述基因在植物細(xì) 胞中超表達(dá)；(b)從步驟(a)獲得的所述植物細(xì)胞再生出植物，并選育出耐鹽抗旱性較野生型 強(qiáng)的株系以培育新品種/系。
所述的強(qiáng)耐鹽抗旱植物的培育方法，步驟(a)所述的液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基 因和液泡膜氫焦磷酸酶基因均來自對(duì)荒漠極端環(huán)境具有很強(qiáng)適應(yīng)性的中國特有種屬植物霸王。所述的強(qiáng)耐鹽抗旱植物的培育方法，步驟(a)所述的液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基 因和液泡膜氫焦磷酸酶基因籍由同一表達(dá)載體導(dǎo)入目標(biāo)植物細(xì)胞。所述的強(qiáng)耐鹽抗旱植物的培育方法，獲得的耐鹽抗旱性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn) 基因植物及其后代和種子。一種培育強(qiáng)耐鹽抗旱植物的雙價(jià)表達(dá)載體，其主要特點(diǎn)在于包括(a).含有強(qiáng)旱生植物霸王液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NaYH+antiporter基因 ZxNHX ；(b).含有強(qiáng)旱生植物霸王液泡膜氫焦磷酸酶H+-PPaSe基因ZxVPl-1 ；(a)和(b)所述基因均可獨(dú)立在植物細(xì)胞中超表達(dá)。所述的培育強(qiáng)耐鹽抗旱植物的雙價(jià)表達(dá)載體，含有所述所述的液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白基因和液泡膜氫焦磷酸酶基因雙價(jià)表達(dá)載體的宿主菌。本發(fā)明的有益效果①轉(zhuǎn)雙基因植物的耐鹽抗旱性強(qiáng)于轉(zhuǎn)單基因的植物 ’②大大 加速了培育強(qiáng)耐鹽抗旱植物的育種進(jìn)程；③植物后代的耐鹽抗旱性狀穩(wěn)定。本發(fā)明主要用 于農(nóng)作物和優(yōu)良牧草的遺傳改良，可以提高其耐鹽、抗旱、抗寒和產(chǎn)量等性狀，具有重要的 社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。雖然通過兩個(gè)基因載體二次轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化也能獲得本發(fā)明所述的兩個(gè)具有協(xié)同 耐鹽抗旱功能基因的的強(qiáng)耐鹽抗旱植物新品種(系)，但此種獲得強(qiáng)耐鹽抗旱植物新品種 (系)方式不但耗時(shí)耗力，而且因兩個(gè)基因獨(dú)立插入植物不同染色體或同一染色體不同位 置而不能連鎖，因此所獲得強(qiáng)耐鹽抗旱植物新品種(系)后代的性狀易于分離和流失。本 發(fā)明加快了育種進(jìn)程，防止了上述現(xiàn)象的發(fā)生。通過本發(fā)明所述的表達(dá)載體可一次轉(zhuǎn)化即獲得轉(zhuǎn)雙基因的植物，且所述兩個(gè)功能 相關(guān)基因?qū)?huì)在轉(zhuǎn)基因植物中連鎖并協(xié)同表達(dá)其一，轉(zhuǎn)雙基因植物的耐鹽抗旱性強(qiáng)于轉(zhuǎn) 單基因的植物；其二 ；大大加速了培育強(qiáng)耐鹽抗旱植物的育種進(jìn)程；其三，植物后代的耐鹽 抗旱性狀穩(wěn)定。


圖 1 霸王液泡膜 H+_PPase 基因 ZxVPl-1 —價(jià)表達(dá)載體 pCAMBIA1302_ZxVPl_l 的
構(gòu)建流程。圖2 表達(dá)載體pCAMBIA1302-ZxVPl_l構(gòu)建過程的電泳檢測(cè)；其中M :DNA Marker III ；1 以霸王 cDNA 為模板的 PCR擴(kuò)增 ZxVPl-1 基因 ORF框；2 :PCR檢測(cè) pMD 19-T-ZxVPl-l 載體；3 :PCR 檢測(cè) pCAMBIA1302-ZxVPl-l。圖3 植物表達(dá)載體pCAMBI A1300RBS的改造由來由植物表達(dá)載體pCAMBIA1300 和克隆載體PUC19-35S-FLAG-RBS構(gòu)建中間載體pCAMBIA1300MV的流程；圖4 由中間載體pCAMBIA1300MV和克隆載體pUC19_35S_FLAG-RBS構(gòu)建植物表達(dá) 載體PCAMBIA1300RBS的流程。圖5 霸王液泡膜Na+/H+antiporter基因ZxNHX —價(jià)表達(dá)載體
6pCAMBIA1300RBS-ZxNHX 的構(gòu)建流程。圖6 表達(dá)載體pCAMBIA1300RBS-ZxNHX構(gòu)建過程的電泳檢測(cè)；其中M :DNA Marker 200Ladder ； 1 以霸王cDNA為模板的PCR擴(kuò)增ZxNHX基因0RF框；2 :PCR檢測(cè) pMD19-T-ZxNHX 載體；3 :PCR 檢測(cè) pCAMBIA1300RBS_ZxNHX。圖 7 霸王液泡膜 H+_PPase 基因 ZxVPl-1 和液泡膜 Na+/H+antiporter 基因 ZxNHX 的雙價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-ZxVPl-l-ZxNHX的構(gòu)建流程。圖 8 表達(dá)載體 pCAMBIA1302-ZxVPl-l-ZxNHX 的構(gòu)建 PCR 檢測(cè)；其中M :DNA Marker III ；1 以含有 pCAMBIA1302-ZxVPl-l_ZxNHX載體的大腸桿菌DH5a 擴(kuò)增 ZxVPl-1 的 菌體PCR ;2 以含有pCAMBIA1302-ZxVPl-l-ZxNHX載體的大腸桿菌DH5a擴(kuò)增ZxNHX的菌體 PCR。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限 定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 霸王H+-PPaSe基因一價(jià)表達(dá)載體的構(gòu)建，見圖1、圖2。液泡膜H+-PPaSe在植物細(xì)胞代謝中具有重要的功能，如調(diào)節(jié)胞質(zhì)和液泡的pH、 清除各種代謝途徑的副產(chǎn)物PPi、參與Na+、K+等溶質(zhì)向液泡內(nèi)運(yùn)輸，降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，進(jìn) 而提高細(xì)胞的耐鹽抗旱性；此外，植物細(xì)胞中超表達(dá)該核酸分子還可促進(jìn)生長(zhǎng)素的運(yùn)輸效 率，導(dǎo)致細(xì)胞加快分裂和增生，使植物根系更加茁壯和葉片更加繁茂，因而使植株可以耐 貧瘠的土壤和增加生物量。本發(fā)明人根據(jù)已知的霸王H+-PPaSe基因ZxVPl-1 (GeneBank EU103625)的序列設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)引物，以霸王葉總RNA為模板，采用RT-PCR方法，擴(kuò)增出 ZxVPl-1基因0RF框，膠回收后連接到pMD19-TSimple Vector載體。測(cè)序確認(rèn)正確后，將含 有ZxVPl-1基因0RF框的pMD19-T-ZxVPl-l載體酶切回收，并將回收到的產(chǎn)物正確無誤地 插入二元載體PCAMBIA1302以獲得一價(jià)表達(dá)載體，并將其命名為pCAMBIA1302_ZxVPl_l。具體的構(gòu)建方法如下(1)根據(jù)分離得到的霸王礦-PPase基因ZxVPl_l核苷酸序列設(shè)計(jì)引物上游引 物5’ -CCATGGTTGTGAAGATGGGTCAGGTGAAAGATAGCC-3，下游引物5’ -TTACCGTGTATGTGTAGACTGTAGAGCAATGGC-3，。以葉總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增該基因完整的開放閱讀框 (0RF)。(2)取5 ill PCR純化產(chǎn)物與pMD19-T Simple Vector載體連接，操作步驟按大連 寶生物公司“PMD19-T Simple Vector”說明書進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在表面 涂有 40 ill X-gal(20mg/ml)、4iil IPTG (200mg/ml)的含有 Amp (50 ii g/ml)的 LB 平板上 37°C使之過夜培養(yǎng)。用牙簽從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取白斑單菌落，在裝有l(wèi)ml LB+Amp(50ug/ ml)的1. 5ml離心管中37°C培養(yǎng)8_10小時(shí)。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列測(cè)定。(3)用限制性內(nèi)切酶Ncol和PspEI將霸王H+_PPase基因ZxVPl-1 0RF框從 pMD19-T-ZxVPl-l載體上切下，與相同酶切的pCAMBIA1302 二元表達(dá)載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)
7化大腸桿菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)，并對(duì)菌株進(jìn)行PCR鑒定，然后送 上海生工測(cè)序以確保連接正確。實(shí)施例2 植物表達(dá)載體pCAMBIA1300RBS的改造由來(圖 3、圖 4)本發(fā)明需要對(duì)現(xiàn)有存在的載體進(jìn)行改造，以便能夠順利實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述雙價(jià)植物 表達(dá)載體pCAMBIA1302-ZxVPl-l-ZxNHX的構(gòu)建，其具體改造過程如下(1)將含有植物表達(dá)載體pCAMBIA1300和克隆載體pUC19-35S-FLAG-RBS的大腸桿 菌DH5a分別接種到含有Kan (50 u g/ml)和Amp (50 u g/ml)的LB液體培養(yǎng)基的不同蝸牛瓶 中37°C培養(yǎng)8-10小時(shí)。堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA。(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI將CaMV35S序列從克隆載體 PUC19-35S-FLAG-RBS上切下并將其小片段回收，然后與相同酶切的pCAMBIA1300載體 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)，并對(duì)陽性 菌株進(jìn)行PCR鑒定，然后送上海生工測(cè)序以確保連接正確并將得到的中間載體命名為 PCAMBIA1300MV。(3)用限制性內(nèi)切酶PstI和Hindlll將rbs-s_3’序列從克隆載體 pUC 19-35S-FLAG-RBS上切下并將其小片段回收，然后與相同酶切的pCAMB IA1300MV載體 連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)，并對(duì)陽 性菌株進(jìn)行PCR鑒定，然后送上海生工測(cè)序以確保連接正確并將得到的中間載體命名為 PCAMBIA1300RBS。實(shí)施例3 霸王NaVH+antiporter基因一價(jià)表達(dá)載體的構(gòu)建，見圖5、圖6。液泡膜Na+ATantiporter在植物細(xì)胞代謝中具有重要的功能，如調(diào)節(jié)胞質(zhì)和液 泡的pH、參與Na+向液泡內(nèi)運(yùn)輸，降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，進(jìn)而提高細(xì)胞的耐鹽抗旱性；此外， 植物細(xì)胞中超表達(dá)該核酸分子還可使作物增產(chǎn)。本發(fā)明人根據(jù)已知的霸王液泡膜Na+/ H+antiporter基因ZxNHX(GeneBank :EU103624)序列設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)引物，以霸王葉總RNA為 模板，采用RT-PCR方法，擴(kuò)增出ZxNHX基因0RF框，膠回收后連接到pMD19-T Simple Vector 載體。測(cè)序確認(rèn)正確后，將含有ZxNHX基因0RF框的pMD19T-ZxNHX載體酶切回收，并將回 收到的產(chǎn)物正確無誤地插入二元載體PCAMBIA1300RBS以獲得一價(jià)表達(dá)載體，并將其命名 為pCAMBIA1300RBS-ZxNHX。其具體的構(gòu)建方法如下(1)根據(jù)分離得到的霸王Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZxNHX核苷酸序列設(shè)計(jì)引物上游引物5，-GGATCCTGAGGATTGACTCGGAAAGG-3，；下游引物5，-CGATTGTCGACCAGGCACGAAGATCTG-3，；以葉總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增該基因完整的開放閱讀框 (0RF)。(2)取5 ill PCR純化產(chǎn)物與pMD19-T Simple Vector載體連接，操作步驟按大連 寶生物公司“PMD19-T Simple Vector”說明書進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在表面 涂有 40 ill X-gal(20mg/ml)、4iil IPTG (200mg/ml)的含有 Amp (50 ii g/ml)的 LB 平板上 37°C使之過夜培養(yǎng)。用牙簽從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取白斑單菌落，在裝有l(wèi)ml LB+Amp(50ug/ ml)的1. 5ml離心管中37°C培養(yǎng)8_10小時(shí)。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列測(cè)定。(3)用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sail將霸王Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZxNHXORF框 從pMD19-T-ZxNHX載體上切下，與相同酶切的pCAMBIA1300RBS 二元表達(dá)載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)，并對(duì)菌株進(jìn)行PCR鑒定，然 后送上海生工測(cè)序以確保連接正確。實(shí)施例4 霸王H+-PPaSe和Na+ATantiporter基因雙 價(jià)表達(dá)載體的構(gòu)建，見圖7、圖8。其具體的構(gòu)建方法如下(1)將含有 pCAMBIA1302-ZxVPl-l 和 pCAMBIA1300RBS_ZxNHX 載體的大腸桿菌 DH5a分別接種到含有Kan (50 u g/ml)LB液體培養(yǎng)基的不同蝸牛瓶中37°C培養(yǎng)8_10小時(shí)。 堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA。(2)用限制性內(nèi)切酶 EcoRI 和 Hindlll 將 CaMV35S-ZxNHX-rbs-s_3，序列從 一價(jià)表達(dá)載體pCAMBIA1300RBS-ZxNHX上切下并將其小片段回收，然后與相同酶切的 pCAMBIA1302-ZxVPl-l表達(dá)載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，然后在卡那霉素的LB 培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)，并對(duì)菌株進(jìn)行PCR鑒定，然后送上海生工測(cè)序以確保連接正確。(3)將構(gòu)建好的載體命名為pCAMBIA1302-ZxVPl-l_ZxNHX，電轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌 GV3101。電轉(zhuǎn)化條件為C = 25ii F ；PC = 200ohm ；V = 2. 4kV實(shí)施例5 —種培育強(qiáng)耐鹽抗旱植物的方法，其特征包括如下步驟 (1)構(gòu)建霸王液泡膜H+-PPaSe和Na+ATantiporter基因的雙價(jià)表達(dá)載體 pCAMBIA1302-ZxVPl-l-ZxNHX ；(2)將(1)步驟的雙價(jià)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌，以獲得轉(zhuǎn)基因用工程農(nóng)桿菌；(3)通過(2)步驟的工程農(nóng)桿菌將(1)步驟的雙價(jià)表達(dá)載體中的所含基因轉(zhuǎn)入植 物細(xì)胞或組織或種子；(4)將(3)步驟植物細(xì)胞或組織或者種子進(jìn)行植株再生，其中轉(zhuǎn)基因植株與野生 型植株相比耐鹽抗旱性提高或其它性狀發(fā)生改良。本發(fā)明所述植物表達(dá)載體載體pCAMBIA1302-ZxVPl-l-ZxNHX的基因適合在所有 植物細(xì)胞中表達(dá)。因此，本發(fā)明的載體并不限制植物的類型，它們可以是單子葉植物、雙子 葉植物；可以是種子植物、裸子植物；也可以是苔蘚類、蕨類、藻類和高等植物；也可以是經(jīng) 濟(jì)作物、糧食作物、牧草、花草樹木等。本發(fā)明優(yōu)選比較重要的植物有馬鈴薯、番茄、蕓薹、棉 花、向日葵、草莓、菠菜、萵苣、水稻、大豆、水稻、棉花、玉米、小麥、黑麥草、大麥、濱藜、堿篷、 燕麥、大麥、啤酒花、甘蔗、苜蓿、百脈根、羊茅、高羊茅、早熟禾、三葉草、箭舌豌豆、向日葵、 甜菜、胡椒、煙草、西瓜、西葫蘆、豌豆、可可、大麻、咖啡、葡萄、漆樹、樺樹、松樹、橡樹、楊樹、 康乃馨、玫瑰、花生、油菜、甜菜、柳枝稷、木薯和藻類等。此外，可以根據(jù)不同的植物使用不 同的轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇、磷酸鈣共沉淀等方法 獲得本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)施例6 耐鹽抗旱增產(chǎn)轉(zhuǎn)基因作物的獲得的方法以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的途徑獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因百脈根(1)無菌苗的獲得將籽粒飽滿的百脈根種子洗凈后用70%乙醇振蕩消毒3-5分 鐘，0. 升汞振蕩滅菌l-2min，無菌水沖洗3-5次；在含無菌水的三角瓶中24°C黑暗吸脹 過夜，之后接種于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中24°C暗培養(yǎng)1天，然后再接種至MS培養(yǎng)基上培 養(yǎng)5-7天(光周期為16時(shí)/天，光照強(qiáng)度為200 u mol/m2 *s，溫度為24°C )，即可獲得無菌
田o(2)侵染菌液的制備挑取鑒定好的根癌農(nóng)桿菌GV3101加入含有50mg/LKan的YM液體培養(yǎng)基中，置28 °C恒溫?fù)u床中，ISOrpm暗培養(yǎng)36小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD_值為 0. 6-0. 8) ；4000rpm離心5分鐘收集菌體，然后再加入適量的無菌B5液體培養(yǎng)基重懸浮工 程菌，使達(dá)到最佳侵染濃度(OD_ = 0. 5)。(3)浸染外植體的獲得將萌發(fā)5-7天的百脈根無菌苗的子葉(帶葉柄)切成小 塊并接到分化培養(yǎng)基上(B5+0. 5mg/L 6-BA)，黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3_4天。(4)侵染將預(yù)培養(yǎng)的外植體放入制備好侵染菌液中，輕輕搖動(dòng)，使外植體與農(nóng)桿 菌充分接觸20分鐘。(5)共培養(yǎng)將上述侵染過的外植體放在滅菌濾紙上吸干多余的菌液之后，接到 分化培養(yǎng)基上(B5+0. 5mg/L 6-BA)，在黑暗條件下共培養(yǎng)3天。(6)脫菌將共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移至含300mg/L Carb的分化培養(yǎng)基(B5+0. 5mg/ L 6-BA)上，24°C光照培養(yǎng)20天，中間繼代一次。(7)抗性胚選擇將上述脫菌分化的外植體轉(zhuǎn)移至含有10mg/L潮霉素(Hyp)的分 化培養(yǎng)基中篩選2-3周，獲得抗性芽點(diǎn)。(8)將抗性芽點(diǎn)移至生根培養(yǎng)基中使其生根，獲得抗性轉(zhuǎn)化植株。(9)對(duì)抗性植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，確保獲得轉(zhuǎn)基因苗。(10)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生理生化分析，確保優(yōu)良性狀后，進(jìn)行大田試驗(yàn)和新品種培育。目前已獲得轉(zhuǎn)基因抗性苗。與野生型植株比較，轉(zhuǎn)基因百脈根植株具有根系發(fā)達(dá)、 莖稈粗壯、分裂枝條多、葉面積較大，株形較高等形態(tài)上的優(yōu)良性狀。需要指出的是，本發(fā)明 的載體并不限于對(duì)百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化。由于MS培養(yǎng)基、YM液體培養(yǎng)基、B5液體培養(yǎng)基和B5固體培養(yǎng)基的配方為本領(lǐng)域 的技術(shù)人員所熟知，因此不再贅述。至于分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，其分別是0. 5mg/L 6-BA 的B5固體培養(yǎng)基和0. 05mg/L NAA的1/2MS固體培養(yǎng)基。實(shí)施例7 生態(tài)恢復(fù)與環(huán)境保護(hù)目前全球有大面積植物難以生長(zhǎng)的鹽漬化荒漠地區(qū)。這些地區(qū)生態(tài)環(huán)境惡劣，土 壤貧瘠，氣候干旱或伴有不同程度的干旱?；诖耍梢詫⒈景l(fā)明的基因轉(zhuǎn)化到適宜的地方 植物中，然后將耐鹽抗旱的轉(zhuǎn)基因植物在這些地區(qū)種植，一方面可以在一定程度上恢復(fù)當(dāng) 地的植被蓋度，防止荒漠化繼續(xù)擴(kuò)大；另一方面可以改良土壤，如增加土壤有機(jī)質(zhì)，疏松土 壤結(jié)構(gòu)，增加土壤微生物活性和多樣性等。由于溫室氣體引起的全球氣候變化給人類的發(fā)展帶來了很多不確定的因素，如海 平面的大幅上升，氣候的變遷、極端氣候的頻發(fā)等，因此CO2的減排問題成為各國政府、科學(xué) 界和民眾的關(guān)注焦點(diǎn)。在這一背景下，碳稅產(chǎn)業(yè)也迅猛發(fā)展。因此，有些高排放量的企業(yè)可 在干旱、鹽漬、貧瘠的土地上大量種植具有本發(fā)明的耐受性的轉(zhuǎn)基因植物，以固定空氣中的 CO2，將在防止全球氣候變暖方面具有積極重要的意義。上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原 則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種強(qiáng)耐鹽抗旱植物的培育方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將能把Na+從細(xì)胞質(zhì)中區(qū)域化到液泡中的液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Na+/H+antiporter基因，以及能為液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力并提高生長(zhǎng)素運(yùn)輸效率的液泡膜氫焦磷酸酶H+-PPase基因轉(zhuǎn)化到目標(biāo)植物的細(xì)胞中，并使所述基因在植物細(xì)胞中超表達(dá)；(b)從步驟(a)獲得的所述植物細(xì)胞再生出植物，并選育出耐鹽抗旱性較野生型強(qiáng)的株系以培育新品種/系。
2.如權(quán)利要求1所述的強(qiáng)耐鹽抗旱植物的培育方法，其特征在于步驟(a)所述的液泡 膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和液泡膜氫焦磷酸酶基因均來自強(qiáng)旱生荒漠植物霸王。
3.如權(quán)利要求1所述的強(qiáng)耐鹽抗旱植物的培育方法，其特征在于步驟(a)所述的液泡 膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和液泡膜氫焦磷酸酶基因籍由同一表達(dá)載體導(dǎo)入目標(biāo)植物細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的強(qiáng)耐鹽抗旱植物的培育方法，其特征在于獲得的耐鹽抗旱性較 強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因植物及其后代和種子。
5.一種培育強(qiáng)耐鹽抗旱植物的雙價(jià)表達(dá)載體，其特征在于包括(a).含有強(qiáng)旱生植物霸王液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NaYH+antiporter基因ZxNHX；(b).含有強(qiáng)旱生植物霸王液泡膜氫焦磷酸酶H+-PPaSe基因ZxVPl-1；(a)和(b)所述基因均可獨(dú)立在植物細(xì)胞中超表達(dá)。
6.如權(quán)利要求5所述的培育強(qiáng)耐鹽抗旱植物的雙價(jià)表達(dá)載體，其特征在于含有所述所 述的液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和液泡膜氫焦磷酸酶基因雙價(jià)表達(dá)載體的宿主菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種強(qiáng)耐鹽抗旱植物品種的培育方法通過構(gòu)建雙基因植物表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)中亞荒漠特有種屬--多漿強(qiáng)旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)的液泡膜氫焦磷酸酶(H+-PPase)基因ZxVP1-1和液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/H+ antiporter)基因ZxNHX聚合，然后經(jīng)過一次轉(zhuǎn)化即可實(shí)現(xiàn)耐鹽抗旱功能協(xié)同的兩個(gè)基因在轉(zhuǎn)化植物品種(系)中連鎖超表達(dá)，從而培育出強(qiáng)耐鹽抗旱植物品種。其優(yōu)點(diǎn)是①轉(zhuǎn)雙基因植物的耐鹽抗旱性強(qiáng)于轉(zhuǎn)單基因的植物；②大大加速了培育強(qiáng)耐鹽抗旱植物的育種進(jìn)程；③植物后代的耐鹽抗旱性狀穩(wěn)定。本發(fā)明主要用于農(nóng)作物和優(yōu)良牧草的遺傳改良，可以提高其耐鹽、抗旱、抗寒和產(chǎn)量等性狀，具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101831458SQ20101016697
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者席杰軍, 王燕雯, 王鎖民 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)