專利名稱：一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物芯片基片的制備領(lǐng)域，特別是涉及一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片 的制備方法。
背景技術(shù)：
生物芯片技術(shù)作為一種可以進(jìn)行高通量多樣品平行分析的重要工具，已經(jīng)開始廣 泛應(yīng)用于基因組學(xué)研究、單核苷酸多態(tài)性分析、臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等方面。它將大量的生物大分 子探針、基因片段、寡聚核苷酸或蛋白質(zhì)等按特定方式排列在特殊載體的固定位置上，在特 定條件下與待檢樣品進(jìn)行作用，通過精密的掃描儀器進(jìn)行記錄、檢測(cè)、分析，具有自動(dòng)化程 度高、檢測(cè)目的分子數(shù)量較多、高通量等優(yōu)點(diǎn)。生物芯片一般來說選擇經(jīng)過相應(yīng)處理的硅片、玻璃片、金屬片、塑料片或聚丙烯 膜、硝酸纖維素膜等作為載體。玻璃片由于具有廉價(jià)、表面光滑、低熒光背景及性能穩(wěn)定等 優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于DNA和蛋白芯片微陣列的制作。要使探針固定在玻璃片表面，必須 先對(duì)玻璃片表面進(jìn)行物理化學(xué)修飾。目前玻璃片表面化學(xué)修飾的方法很多，大致可分為二 維表面修飾和三維表面修飾兩類。以玻璃片為載體的二維表面修飾有氨基修飾、醛基修飾、巰基修飾及聚賴氨酸修 飾等，這類載體大部分通過一些分子間親和力或共價(jià)鍵把基因或蛋白探針固定在其表面， 這種方法成本較低、便于制備、重復(fù)性好、熒光背景相對(duì)較低。但是仍存在一定缺陷，如探針 固定量較小、表面均一性差、點(diǎn)樣點(diǎn)不夠規(guī)整以及表面官能團(tuán)與探針之間發(fā)生非特異性交 互作用使玻璃片背景增高等問題。三維表面修飾是在玻璃片表面包一層凝膠或樹突狀多聚 物，然后再引入活性基團(tuán)，從而在玻璃片表面形成三維立體結(jié)構(gòu)。由于三維多孔結(jié)構(gòu)，載體 表面與探針接觸面積大大增加，從而固定量也增加，提高了固定效率；另外，凝膠內(nèi)濕潤(rùn)微 環(huán)境使固定在上面的蛋白質(zhì)溶液不易蒸發(fā)，從而保持了蛋白的活性。但是由于這些納米級(jí) 的多孔材料結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，使得微陣列上的各種生物大分子探針間的距離控制較為困難， 探針及多孔材料之間的交互作用因此增強(qiáng)，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)的背景增高；此外，這些大分子多孔 材料的使用給微陣列的后續(xù)洗脫也帶來了問題。因此有良好的生物分子結(jié)合能力和表面質(zhì) 量高、背景低、信號(hào)強(qiáng)度高的生物芯片基片的發(fā)明勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法， 該制備方法簡(jiǎn)單，成本低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)；所得基片背景低、表面均一、點(diǎn)樣點(diǎn)比較規(guī) 整、結(jié)合力強(qiáng)，大大提高了固定效率，它具有較高荷載和結(jié)合蛋白質(zhì)分子的能力，是一類較 新的蛋白質(zhì)微陣列載體。本發(fā)明的一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，包括(1)高硼硅玻璃片表面處理將超聲處理過的高硼硅玻璃片浸泡在濃硫酸、過氧 化氫和超純水(體積比為4 1 20)的混合液中，80 130°C下放置15 30分鐘，冷卻、超純水洗沖洗后浸泡于濃鹽酸和乙醇(體積比為1 1)混合溶液中3 24小時(shí)，超純水 清洗3 5次，110 140°C烘干15 30分鐘；(2)環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制配制含1 3vol % GPTMS, 1 3vol %冰醋酸 的無水乙醇或異丙醇溶液，磁力攪拌，升溫至60 80°C，回流1 2小時(shí)，降至室溫，整個(gè)過 程在避光條件下進(jìn)行；(3)環(huán)氧基修飾調(diào)節(jié)上述硅烷偶聯(lián)劑溶液的PH = 7，磁力攪拌3 5分鐘；迅速 加入經(jīng)表面過處理后的高硼硅玻璃片，在25 30°C，相對(duì)濕度為30 50%恒溫恒濕箱中 放置2 24小時(shí)，取出后先用無水乙醇清洗，然后再用超純水沖洗，110 140°C烘干15 30分鐘，即得環(huán)氧基修飾的生物芯片基片。所述步驟(1)中的高硼硅玻璃片外形尺寸為25. Omm士0. 2_X 75. 6mm士0. 2_、 厚度為1.0mm士0. 02mm，其優(yōu)勢(shì)在于“零”熒光背景、表面被拋光達(dá)到了原子平整的程度 (士20埃)、玻璃片間差異系數(shù)(CV) < 10%。所述步驟(1)中的超聲是在超純水中超聲5 10分鐘。所述步驟(2)中環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制取99.8%無水乙醇77.6ml， GPTMS2. 4ml，冰醋酸2. 4ml加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到60°C，在磁力攪拌下回流2小 時(shí)，然后降至室溫。所述步驟(2)中環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制取lmlGPTMS，98ml異丙醇，Iml醋 酸加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到80°C，在磁力攪拌下回流1小時(shí)，然后降至室溫。所述步驟(3)中使用濃氨水調(diào)節(jié)硅烷偶聯(lián)劑溶液的pH。有益效果(1)本發(fā)明所提供的生物芯片基片的制備方法簡(jiǎn)單易行，不僅可以用于制備環(huán)氧 基修飾的生物芯片基片，同時(shí)也可以用于氨基修飾的生物芯片基片的制備；(2)本發(fā)明所制備的生物芯片基片，由于表面環(huán)氧基的活性較強(qiáng)，提高了基片結(jié)合 氨基修飾的DNA探針和蛋白探針的能力，從而降低了在制備生物芯片過程中DNA探針和蛋 白探針的點(diǎn)樣濃度，最終降低了生物芯片的成本，推動(dòng)了生物芯片產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展；(3)本發(fā)明所得的生物芯片基片背景低、表面均一、點(diǎn)樣點(diǎn)比較規(guī)整、信號(hào)強(qiáng)度達(dá) 6萬左右遠(yuǎn)高于普通氨基片、醛基片等，不僅解決了普通氨基片和普通醛基片對(duì)氨基修飾的 核酸探針固定弱或固定不上的問題，大大提高了固定效率，而且它具有較高荷載和結(jié)合蛋 白質(zhì)分子的能力，是一類較新的蛋白質(zhì)微陣列載體，其表面的環(huán)氧基活性很強(qiáng)，不但可以和 氨基反應(yīng)，還可以和蛋白質(zhì)表面的其他集團(tuán)如羧基、巰基、羥基等反應(yīng)，如圖1和2所示；本 發(fā)明的環(huán)氧基片其點(diǎn)的變異度較小，沒有拖尾現(xiàn)象，點(diǎn)較圓潤(rùn)，背景較低，是一種理想的制 備生物芯片的基片；(4)本發(fā)明所得的生物芯片基片表面具有牢固的特異性結(jié)合點(diǎn)，能夠廣泛應(yīng)用于 DNA微陣列和蛋白微陣列的載體。


圖1環(huán)氧基與氨基修飾的DNA分子的反應(yīng)機(jī)理2環(huán)氧基與蛋白質(zhì)表面活性基團(tuán)的反應(yīng)機(jī)理3環(huán)氧基片點(diǎn)樣試驗(yàn)中點(diǎn)樣矩陣示意圖
圖4環(huán)氧基片點(diǎn)樣后的熒光掃描圖片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。實(shí)施例1環(huán)氧基生物芯片基片的制備(1)分別量取99. 8%無水乙醇77. 6ml, GPTMS2. 4ml，冰醋酸2. 4ml加入到三口燒 瓶中，用油浴加熱到60°C，在磁力攪拌下回流2小時(shí)，然后降至室溫，整個(gè)過程在避光條件 下進(jìn)行。(2)將硼硅玻璃片放入裝有超純水的染色缸中超聲10分鐘，超純水沖洗兩次，然 后浸泡于濃硫酸、過氧化氫和超純水(體積比為4 1 20)的混合液中，在130°C的鼓風(fēng) 干燥箱中放置15分鐘，冷卻，用超純水沖洗3次；然后在濃鹽酸和乙醇(體積比為1 1) 混合溶液中浸泡3小時(shí)，超純水清洗3次，110°C烘干30分鐘，冷卻至室溫。(3)在配制好的硅烷偶聯(lián)劑溶液中加入濃氨水，調(diào)節(jié)溶液pH = 7，在避光條件下磁 力攪拌5分鐘，將經(jīng)過表面處理的硼硅玻璃片放入環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液中，然后放入恒 溫恒濕箱中，相對(duì)濕度控制在50 %，溫度設(shè)定為30°C，分別放置2、5、8、10、15、20、24小時(shí)， 取出后用無水乙醇沖洗3次，超純水沖洗3次，110°C烘干30分鐘即得到環(huán)氧基基片。此實(shí)施例中所得到的表面處理過的高硼硅玻璃片和環(huán)氧基基片分別用原子力顯 微鏡進(jìn)行了表面表征。實(shí)施例2環(huán)氧基生物芯片基片的制備(1)分別量取lmlGPTMS，98ml異丙醇，Iml醋酸加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到 80°C，在磁力攪拌下回流1小時(shí)，然后降至室溫，整個(gè)過程在避光條件下進(jìn)行。(2)首先硼硅玻璃片放入染色缸中在超純水中超聲5分鐘，超純水沖洗3次后浸 泡于濃硫酸、過氧化氫和超純水(體積比為4 1 20)的混合液中，80°C放置30分鐘，冷 卻，超純水清洗3次，然后浸泡于濃鹽酸和乙醇(體積比為1 1)混合溶液中24小時(shí)，超 純水清洗5次后140°C烘干15分鐘。(3)在配制好的硅烷偶聯(lián)劑溶液中加入濃氨水，調(diào)節(jié)溶液pH = 7，在避光條件下磁 力攪拌3分鐘，將經(jīng)過表面處理的硼硅玻璃片放入環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液中，然后放入恒 溫恒濕箱中，相對(duì)濕度控制在30 %，溫度設(shè)定為25 °C，放置2、5、8、15、20、24小時(shí)，取出后用 無水乙醇清洗3次，超純水清洗3次，140°C烘干15分鐘后即得到環(huán)氧基片。實(shí)施例3環(huán)氧基生物芯片基片固定能力的檢測(cè)本實(shí)施例所用到的環(huán)氧基基片是按實(shí)施例1所述的方法制備的，本實(shí)施例是通過 Arrayit SpotBot 2點(diǎn)樣儀對(duì)環(huán)氧基片進(jìn)行點(diǎn)樣試驗(yàn)，點(diǎn)樣矩陣設(shè)計(jì)示意圖如圖3所示， 然后再通過Axon GenePix 4000B :Cy3PMT600，PowerlOO掃描儀檢測(cè)其熒光信號(hào)強(qiáng)度來反映環(huán)氧基片的固定能力，具體操作如下(1)準(zhǔn)備點(diǎn)樣樣本a.室溫下，將DNA探針以0. 05 μ M、0. 1 μ M、0. 5 μ M、1 μ M的濃度分別到50 % DMS0/50%H20 的緩沖液中。將抗體探針以 0. 5μ g/μ 1、1μ g/μ 1、2. 5μ g/μ 1、5μ g/μ 1 的 濃度分別到20%甘油/80% H2O的緩沖液中； b.將樣本根據(jù)矩陣設(shè)計(jì)示意圖轉(zhuǎn)移到96孔板或384孔板中，輕敲微孔板使液體流 至孔底，將玻片整齊擺放在點(diǎn)陣儀底盤上；c.啟動(dòng)點(diǎn)陣儀，自上而下在基片的右邊點(diǎn)陣5個(gè)1號(hào)緩沖液5X4的陣列到抽選 的基片上，在基片的左邊點(diǎn)陣5個(gè)2號(hào)緩沖液5X4的陣列到擺放好的基片上。溫度控制在 25 °C室溫，濕度控制在70%左右。(2)探針與環(huán)氧基的結(jié)合點(diǎn)樣后，將芯片放入芯片盒中，在37°C恒溫恒濕箱中靜 止24小時(shí)。(3)洗片a.制備洗滌液 1 (2xSSC/0. 2 % SDS)，洗滌液 2 (IxSSC)；b.將芯片置于芯片染色缸中，浸泡在洗滌液1中，室溫下輕輕地放下、提起芯片15 下；將芯片轉(zhuǎn)移到盛有洗滌液2的染色皿中，室溫下輕輕地放入、提起芯片15下；c.移出染色缸。用去離子水徹底沖洗，沖洗次數(shù)不少于2次；用離心法(200Xg for 10s)干燥芯片。(4)掃描a.將一片樣本放入掃描儀中，通過專用掃描儀軟件將光電倍增管強(qiáng)度調(diào)整至 Cy3/PMT600, PowerlOO,點(diǎn)擊啟動(dòng)按鈕，開始粗掃樣本，得到掃描圖片如圖4所示；b.細(xì)掃信號(hào)最佳的2個(gè)5X4蛋白陣列、2個(gè)5X4DNA陣列。讀取Cy3背景信號(hào)中 值、點(diǎn)信號(hào)中值及SD值讀數(shù)，并計(jì)算其差異系數(shù)CV值和信噪比S/N值，如表1所示；c.結(jié)束掃描，取出樣本。本實(shí)施例在點(diǎn)樣的過程中同時(shí)放入普通氨基片、醛基片、瓊脂糖片以及 ThemoFisher環(huán)氧基片作為對(duì)比。表1環(huán)氧基片掃描數(shù)據(jù)DNA 探針 蛋白探針
權(quán)利要求
一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，包括(1)高硼硅玻璃片表面處理將超聲處理過的高硼硅玻璃片浸泡在體積比為4∶1∶20的濃硫酸、過氧化氫和超純水的混合液中，80～130℃下放置15～30分鐘，冷卻、超純水洗沖洗后浸泡于體積比為1∶1的濃鹽酸和乙醇混合溶液中3～24小時(shí)，超純水清洗3～5次，110～140℃烘干15～30分鐘；(2)環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制配制含1～3vol％GPTMS、1～3vol％冰醋酸的無水乙醇或異丙醇溶液，磁力攪拌，升溫至60～80℃，回流1～2小時(shí)，降至室溫，整個(gè)過程在避光條件下進(jìn)行；(3)調(diào)節(jié)上述硅烷偶聯(lián)劑溶液的pH＝7，磁力攪拌3～5分鐘；迅速加入經(jīng)表面過處理后的高硼硅玻璃片，在25～30℃，相對(duì)濕度為30～50％恒溫恒濕箱中放置2～24小時(shí)，取出后先用無水乙醇清洗，然后再用超純水沖洗，110～140℃烘干15～30分鐘，即得環(huán)氧基修飾的生物芯片基片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，其特征在于 所述步驟(1)中的高硼硅玻璃片外形尺寸為25. Omm士0.2mmX75. 6mm士0.2mm、厚度為 1. Omm士0. 02mmo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，其特征在于所 述步驟(1)中的超聲是在超純水中超聲5 10分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，其特征在于所 述步驟⑵中環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制取99. 8%無水乙醇77. 6ml, GPTMS2. 4ml，冰 醋酸2. 4ml加入到三口燒瓶中，用油浴加熱到60°C，在磁力攪拌下回流2小時(shí)，然后降至室
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，其特征在于所 述步驟(2)中環(huán)氧基硅烷偶聯(lián)劑溶液的配制取lmlGPTMS，98ml異丙醇，Iml醋酸加入到三 口燒瓶中，用油浴加熱到80°C，在磁力攪拌下回流1小時(shí)，然后降至室溫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，其特征在于所 述步驟(3)中使用濃氨水調(diào)節(jié)硅烷偶聯(lián)劑溶液的pH。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種環(huán)氧基修飾的生物芯片基片的制備方法，包括(1)將超聲處理過的高硼硅玻璃片浸泡在濃硫酸、過氧化氫和超純水的混合液中，80～130℃下放置15～30分鐘，冷卻、沖洗后浸泡于濃鹽酸和乙醇混合溶液中，清洗，烘干；(2)配制含GPTMS、冰醋酸的無水乙醇或異丙醇溶液，磁力攪拌，升溫至60～80℃，回流；(3)調(diào)節(jié)硅烷偶聯(lián)劑溶液的pH＝7，攪拌；迅速加入經(jīng)表面過處理后的高硼硅玻璃片，放置，清洗，烘干。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，成本低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)；所得基片背景低、表面均一、點(diǎn)樣點(diǎn)比較規(guī)整、結(jié)合力強(qiáng)，大大提高了固定效率，它具有較高荷載和結(jié)合蛋白質(zhì)分子的能力，是一類較新的蛋白質(zhì)微陣列載體。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101880712SQ201010167800
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者張青紅, 李耀剛, 王宏志, 馬董云 申請(qǐng)人:東華大學(xué)