專利名稱：一種提高植酸酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞壁外表面展露表達(dá)植酸酶以提高該酶活性的方法。
背景技術(shù)：
飼料中含有的植酸易與鈣、磷等礦質(zhì)元素形成不溶性沉淀，影響動物對這些礦質(zhì)元素的吸收。植酸酶能夠降解植酸，在飼料中添加植酸酶能夠有效消除植酸對動物吸收鈣、 磷等礦質(zhì)元素的不利影響。但目前在飼料中添加的植酸酶主要存在以下問題酶的重組表達(dá)方式一般是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時由于酶不能與細(xì)胞外底物接觸，從而極大地影響酶的催化效率，而且酶分子集聚在細(xì)胞內(nèi)形成反饋抑制，也影響表達(dá)效率。分泌表達(dá)的主要缺點是表達(dá)效率不高，而且也不能實現(xiàn)完全分泌表達(dá)，總有相當(dāng)一部分表達(dá)產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，從而也不能實現(xiàn)酶與細(xì)胞外底物的完全接觸。這兩種表達(dá)方式都導(dǎo)致酶的催化效率不高。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有的植酸酶催化效率低的問題，本發(fā)明提供一種將植酸酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面的技術(shù)，實現(xiàn)酶與細(xì)胞外底物的完全接觸，從而顯著提高植酸酶活性。本發(fā)明的一種提高植酸酶活性的方法，包括以下步驟將植酸酶基因(Genbank 號AB508806)連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份α凝集素序列(Genbank號164)的N端， 然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動子(Genbank號AY428072)下游MF α 1信號肽序列 (Genbank號Μ17301)的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到C端GAL1啟動子+MF α 1 信號肽序列+植酸酶基因+ α凝集素序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。將包含上述表達(dá)框的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)于添加有6% (重量百分比)半乳糖和 6-9%乳糖(重量百分比)的YPD培養(yǎng)基中。本發(fā)明的優(yōu)點將植酸酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面，實現(xiàn)酶與細(xì)胞外底物的完全接觸，從而顯著提高植酸酶活性。
具體實施例方式以下通過實施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述本發(fā)明開發(fā)一種將植酸酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面的技術(shù)，實現(xiàn)酶與細(xì)胞外底物的完全接觸，從而顯著提高植酸酶活性。三種酶分子表達(dá)方式如下
一酶分子細(xì)胞內(nèi)表達(dá)分泌表達(dá)展露表達(dá)實施例1植酸酶展露表達(dá)將植酸酶基因(來自Lupinus albus，Genbank號AB508806)連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份α凝集素序列(來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank號]\C8164)的 N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動子(來自釀酒酵母表達(dá)載體pYES263，Genbank 號AY^8072)下游MF α 1信號肽序列(來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae, Genbank號M17301)的C端，構(gòu)建成表達(dá)框(從N端到C端):GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+植酸酶基因+α凝集素。將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞 (Saccharomycescerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司)JlJMF α 1信號肽將引導(dǎo)植酸酶向釀酒酵母細(xì)胞外分泌，而植酸酶下游的α凝集素則錨定在釀酒酵母細(xì)胞壁中，從而使植酸酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面。實施例2植酸酶展露表達(dá)的誘導(dǎo)在培養(yǎng)釀酒酵母的YPD培養(yǎng)基中，添加6%半乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo.，Ltd.)禾口 6-9%乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai SangonBiological Engineering Technology&Services Co.，Ltd.)，則表達(dá)框“GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+植酸酶基因+ α凝集素”中的GALl啟動子就會活化，誘導(dǎo)植酸酶在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面展露表達(dá)。實施例3半乳糖和乳糖對植酸酶展露表達(dá)的作用在培養(yǎng)釀酒酵母的YPD培養(yǎng)基中，如果不含半乳糖和乳糖，則未檢測到植酸酶活性，這是因為表達(dá)框“GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+植酸酶基因+FLO序列”中的GALl 啟動子無法保持活化狀態(tài)。實施例4植酸酶展露表達(dá)后活性的提高按照實施例1和實施例2所示步驟進(jìn)行展露表達(dá)的植酸酶活性為1186U/mL(6% 半乳糖和6%乳糖)和1145U/mL(6%半乳糖和9%乳糖)，而如果在實施例1和實施例2所示的展露表達(dá)表達(dá)框“GAL1啟動子+MF α 信號肽序列+植酸酶基因+α凝集素”中去除 α凝集素序列，則植酸酶進(jìn)行分泌表達(dá)，活性為353U/mL(6%半乳糖和6%乳糖)和360U/ mL(6%半乳糖和9%乳糖)。因此，在表達(dá)系統(tǒng)與基本表達(dá)元件一樣的情況下，增加α凝集素這一展露表達(dá)元件可使植酸酶活性提高數(shù)倍。植酸酶活性單位U定義為在37°C、pH 5. 5的條件下，1分鐘內(nèi)從0. 0051摩爾/ 升的植酸鈉(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai SangonBiological Engineering Technology&Services Co.，Ltd.)溶液中釋放出1微摩爾無機磷所需要的植酸酶酶量為 1U。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高植酸酶活性的方法，其特征在于包括以下步驟將植酸酶基因連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份α凝集素序列的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動子下游MFa 1 信號肽序列的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到C端GAL1啟動子+MFa 1信號肽序列+ 植酸酶基因+ α凝集素序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將包含“權(quán)利要求1”所述表達(dá)框的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)于添加有重量百分比6%半乳糖和重量百分比6-9%乳糖的YPD培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明的一種提高植酸酶活性的方法，包括以下步驟將植酸酶基因(Genbank號AB508806)連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份α凝集素序列(Genbank號M28164)的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GAL1啟動子(Genbank號AY428072)下游MFα1信號肽序列(Genbank號M17301)的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到C端GAL1啟動子+MFα1信號肽序列+植酸酶基因+α凝集素序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點將植酸酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面，實現(xiàn)酶與細(xì)胞外底物的完全接觸，從而顯著提高植酸酶活性。
文檔編號C12N9/16GK102242086SQ201010171789
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者何國慶, 周陳偉, 廖文艷, 徐娟, 王睿之, 阮暉, 陳美齡, 陳赟, 馬風(fēng)蘭 申請人:浙江大學(xué)