專利名稱：一種ev71病毒抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒抗體的制備方法，特別涉及一種EV71病毒抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
手足口病，英文名為Hand-foot-and-mouth disease，是由腸道病毒引起的傳染 病，多發(fā)生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疫，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺 水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。個別重癥患兒如果病情發(fā)展快，會導(dǎo)致死亡。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種(型)，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B 組的2、5型，以及腸道病毒71型均為手足口病較常見的病原體，其中以柯薩奇病毒A16型 (CoxA16)和腸道病毒71型(EV71)最為常見。手足口病是全球性傳染病，自1957年新西蘭首次發(fā)現(xiàn)此病以來，世界大部分地區(qū) 均有此病流行的報導(dǎo)，且近幾年來每次爆發(fā)的規(guī)模跟持續(xù)的時間都在不斷增長。我國自1981年在上海始見本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、西 寧、廣東等十幾個省市均有報導(dǎo)。此病每隔2-3年便會爆發(fā)一次，每年的4-8月份為該病的 流行期。我國以EV71型病毒感染居多。EV71病毒屬腸道病毒屬(Enterovirus)的成員，EV71病毒株SHZH98基因序列 病毒基因組為7408個核苷酸的正鏈RNA，編碼約2194個氨基酸，其Genebank登記號為 AF302996. 1，其序列如 SEQ ID NO 1 所示。截止2009年4月份，全國已累計報告手足口病115618例，死亡50例，而此時該病 才剛剛開始流行，還未達到高峰。目前針還沒有針對該病的疫苗，治療上主要以預(yù)防為主，配合藥物治療，但是由于 該病存在很多隱性感染，同時傳播速度快，傳播途徑多，所以預(yù)防和控制該病難度很大。加 上感染的大部分是5周歲以下的小孩，病程短發(fā)病急，稍有不慎就有可能危機到小孩的生 命，所以該病已被我國納入丙類傳染疾病進行管理。因此開發(fā)EV71病毒的多克隆卵黃抗體 的研究，具有廣泛的社會需求和應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種EV71病毒抗體的制備方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是一種EV71病毒抗體的制備方法，包括以下步驟1)設(shè)計含有不同酶切位點的上、下游引物，擴增EV71病毒株SHZH98的抗原決定序 列；2)將擴增得到的抗原決定序列克隆到載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒；3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細菌或真菌中進行表達，收集表達得到的抗原蛋白；4)將抗原蛋白溶解，注射至動物體內(nèi)，誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗體，收集、純化得到抗體，所 述抗原決定序列為 EV71 病毒株 SHZH98 的 2439bp_3329bp、1713bp_3329bp、2439bp_3779bp。
優(yōu)選的，上、下游引物中的酶切位點為EcoRI、XhoI的酶切位點。優(yōu)選的，產(chǎn)生EV71病毒抗體的動物為禽類。本發(fā)明方法制得的抗體，可以阻止EV71病毒的感染，具有預(yù)防和治療手足口病的 功能。本發(fā)明方法制得的抗體，可以直接添加在食品、保健品中，也可以阻止EV71病毒 的感染，具有預(yù)防和治療手足口病的功能。采用抗原免疫禽類產(chǎn)生抗體，可以直接收集禽類卵，大大降低了抗體提純的成本， 制備速度快。


圖1是各抗體的免疫效果對比圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實例，進一步說明本發(fā)明。以下實施例中EV71病毒由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院兒科惠贈，病毒分離自患兒咽拭子標本，檢測 鑒定均參考國家手足口病標本采集及檢測技術(shù)方案，熒光定量PCR檢測為陽性后，感染細 胞分離擴增保存。當然，也可以使用其他可公開獲得的EV71病毒，擴增得到本發(fā)明的抗原 決定序列。pGEX-4Tl質(zhì)粒、細菌BL21、大腸桿菌Rosetta，均由西北農(nóng)林科技大學張智英教授惠贈。將EV71病毒擴增，提取其總RNA，使用RT-PCR擴增所需片斷?？乖苽鋵嵤├?1)使用上游引物CCCGAATTCGGAGATAGGGTGGCAGAT(SEQ ID NO:5)，下游引物CCCCTCGAGGAGAGTGGTGATCGCTGC(SEQ ID NO:6)，采用TouchDown-PCR擴增與EV71病毒株SHZH98基因序列的 2439bp-3329bp (SEQ ID NO 2) 一致的片斷，片段大小 891bp，上游引物中，GAATTC 為 EcoRI 的酶切位點，下游引物中，CTCGAG為Xhol酶切位點；2)使用EcoRI、Xhol將PCR產(chǎn)物克隆到pGEX_4Tl載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，測序 確認后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細菌BL21，37°C，250rpm搖菌至0D6(1(10. 6 0. 8后添加IPTG誘導(dǎo) 表達兩小時。3)表達得到的重組蛋白在細菌以包涵體的形式存在，12000rpm離心收集細胞，裂 解液(lOOmM NaH2P04、10mM Tris_HCl、8M尿素、pH8. 0)重懸后經(jīng)超聲波破碎，收集上清過 0. 45um濾膜備用，GST結(jié)合柱經(jīng)平衡液(100mM NaH2P04、10mM Tris_HCl、pH8. 0)平衡后上 樣，洗柱后(lOOmM NaH2P04、10mM Tris_HCl、8M尿素、pH6. 3)用高鹽緩沖液(100mM NaH2P04、 10mM Tris-HC1、8M尿素、pH4. 5)洗脫收集SDS-PAGE膠檢測，目的蛋白用PBS (pH7. 4)透析 24h，每隔6h換水一次。經(jīng)鑒定抗原純度達到85%以上?？乖苽鋵嵤├?
1)使用上游引物:AAAGAATTCGGTTTTCCCACTGAA (SEQ ID NO 7)，下游引物 CCCCTCGAGGAGAGTGGTGATCGCTG(SEQ ID NO :8)，采用 TouchDown-PCR 擴增與 EV71 病毒株 SHZH98基因序列的1713bp-3329bp(SEQ ID NO 3) 一致的片斷，片段大小1617bp，上游引物 中，GAATTC為EcoRI的酶切位點，下游引物中，CTCGAG為Xhol酶切位點；2)使用EcoRI、Xhol將PCR產(chǎn)物克隆到pGEX_4Tl載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，測序 確認后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta中，37°C，250rpm搖菌至0D6(1(10. 6 0. 8后添加 IPTG誘導(dǎo)表達三小時。3)表達得到的重組蛋白在細菌以包涵體的形式存在，12000rpm離心收集細胞，裂 解液(lOOmM NaH2P04、10mM Tris_HCl、8M尿素、pH8. 0)重懸后經(jīng)超聲波破碎，收集上清過 0. 45um濾膜備用，GST結(jié)合柱經(jīng)平衡液(100mM NaH2P04、10mM Tris_HCl、pH8. 0)平衡后上 樣，洗柱后(lOOmM NaH2P04、10mM Tris_HCl、8M尿素、pH6. 3)用高鹽緩沖液(100mM NaH2P04、 10mM Tris-HC1、8M尿素、pH4. 5)洗脫收集SDS-PAGE膠檢測，目的蛋白用PBS (pH7. 4)透析 24h，每隔6h換水一次。經(jīng)鑒定抗原純度達到85%以上。抗原制備實施例31)使用上游引物AAAGAATTCGGAGATAGGGTGGCAGATGT(SEQ IDN0 :9)，下游引物CC CCTCGAGCTGCTCCATAGCTTCTTCATC (SEQID NO 10)，采用 TouchDown-PCR 擴增與 EV71 病毒株 SHZH98基因序列的2439bp-3779bp(SEQ ID NO 4) 一致的片斷，片段大小1341bp，上游引物 中，GAATTC為EcoRI的酶切位點，下游引物中，CTCGAG為Xhol酶切位點；2)使用EcoRI、Xhol將PCR產(chǎn)物克隆到pGEX_4Tl載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，測序 確認后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta中，37°C，250rpm搖菌至0D6(1(10. 6 0. 8后添加 IPTG誘導(dǎo)表達兩小時。3)表達得到的重組蛋白在細菌以包涵體的形式存在，12000rpm離心收集細胞，裂 解液(lOOmM NaH2P04、10mM Tris_HCl、8M尿素、pH8. 0)重懸后經(jīng)超聲波破碎，收集上清過 0. 45um濾膜備用，GST結(jié)合柱經(jīng)平衡液(100mM NaH2P04、10mM Tris_HCl、pH8. 0)平衡后上 樣，洗柱后(lOOmM NaH2P04、10mM Tris_HCl、8M尿素、pH6. 3)用高鹽緩沖液(100mM NaH2P04、 10mM Tris-HC1、8M尿素、pH4. 5)洗脫收集SDS-PAGE膠檢測，目的蛋白用PBS (pH7. 4)透析 24h，每隔6h換水一次。經(jīng)鑒定抗原純度達到85%以上。蛋白抗體的制備方法如下1)將抗原用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7. 2)溶解，調(diào)節(jié)濃度至lmg/ml，將該抗原液與 等量完全弗氏佐劑混合，充分乳化制備初次免疫抗原；2)將初次免疫抗原通過頸部皮下多點注射免疫母雞，注射量1. 0ml，初次免疫；3)2周后使用不完全弗氏佐劑乳化抗原加強免疫，第3周同前處理再加強免疫一 次；4) 3天后采血，采用ELISA法檢測血清中特異性抗體效價。當效價達到10000以上 時，開始收集雞蛋。母雞隔離飼養(yǎng)，自由攝食。5)將收集的雞蛋進行清洗，打蛋，用分離器將蛋黃和蛋清分離，蛋黃處理方法如 下將蛋黃和9倍體積的去離子水，充分混合后4°C靜置過夜，4000rpm離心lOmin，取上清，加入硫酸銨至終濃度40%，劇烈攪拌lOmin，靜置2h，離心棄上清，沉淀重新溶解于PBS中， 超濾截留100k-300k之間的部分，同時脫鹽，然后應(yīng)用冷凍干燥機將蛋白抗體干燥。
分別使用抗原制備實施例1 3制得的抗原，按上述抗體的制備方法得到抗體，分 別記為抗體1、抗體2、抗體3。使用SDS-PAGE檢測抗體純度。抗體回收率約為70%，抗體純度> 95%。全病毒滅活抗體的制備一、細胞培養(yǎng)用恒河猴腎細胞對EV71病毒進行擴增，用生長液培養(yǎng)細胞，待細胞長至70%左右 的時候接種病毒。細胞培養(yǎng)液如下表 二、接種和觀察1)使用10cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞，傳細胞時，每管加細胞培養(yǎng)液10ml。顯微鏡下 觀察單層細胞，以確保細胞是健康、無污染的；2)待細胞長至70%左右，倒掉生長液(GM)，換上8ml的維持液(MM)；3)接種50ul病毒原液，培養(yǎng)溫度要求36°C ；4)使用顯微鏡每天觀察細胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細胞病變效應(yīng) (CPE)的出現(xiàn)(如細胞變圓，折光增強并脫離管壁等)；5)觀察有75%的細胞出現(xiàn)特征性的腸道病毒CPE變化(3+CPE)時，消化離心收集 細胞，液氮反復(fù)凍融3-4次，12000轉(zhuǎn)離心lOmin，收集上清，重新感染新培養(yǎng)的細胞，反復(fù)操 作，擴增所需病毒；6)將擴增好的病毒的細胞離心破碎后，收集沉淀滅菌PBS重懸制成含有病毒顆粒 的懸液，調(diào)整滴度到lX108/pfu，-70°C凍存?zhèn)溆谩Ｈ?、病毒純化采用蔗糖密度梯度離心法純化病毒，操作如下1)取上步所得病毒懸液，溶解后，先以5000g離心15分鐘后，獲取上清夜，然后再 20000g高速離心30分鐘后取上清夜；2)接著10萬g超速離心2h，將沉淀用少量STE溶解；3)先在超速離心管中加入5_8mL的第3步所獲取的含病毒樣品的溶解液，然后在 離心管中用長針頭從底部往上依次加入30 %，45 %，60 %的蔗糖，11萬g離心2. 5h，在30 % 與45%以及45%與60%之間都有一條明亮的帶，用長針頭將兩條不同部位的帶都吸取出 來，分別收集到不同的瓶內(nèi)；4)用STE緩沖液適量稀釋純化的病毒，然后11萬g離心3h，用少量STE緩沖液把 沉淀懸起，即最后獲得了純化的病毒，分光光度計測定其病毒含量；
6
5)應(yīng)用甲醛滅活病毒，檢測病毒活性，調(diào)整滴度待用。由上述方法制得的抗體記為抗體4。療效實驗將上述方法制得的蛋白抗體(IgY) +飼料飼喂健康小鼠，用擴增得到的EV71病毒 感染小鼠；同時設(shè)正常飼料飼養(yǎng)的對照小鼠，采用相同劑量病毒進行感染，檢測抗體對小鼠 的保護作用。實驗分組設(shè)計如下 每組10只小鼠，自由飲食，兩周后感染病毒，繼續(xù)飼喂原設(shè)計飼料兩周，觀察記錄 小鼠健康狀況，統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果。病毒感染取純化后病毒，調(diào)整病毒滴度，分別按照104pfu/只、105pfu/只、105pfu/只的劑 量飼喂正常小鼠，觀察小鼠健康狀況，1 3天均出現(xiàn)食欲不振，精神萎靡，排水樣糞便等病 狀，7天左右開始有小鼠死亡。攻毒各實驗組均取中間劑量即105pfu/只添加進飼料中飼喂上述實驗組小鼠，隨 后仍按原設(shè)計繼續(xù)飼喂相應(yīng)飼料，觀察記錄小鼠健康狀況，與正常組對比。結(jié)果實驗結(jié)果顯示，飼料中添加IgY對小鼠有一定的保護作用，經(jīng)過兩周的攻毒實驗 后，添加IgY各組小鼠死亡率較低，尤其是抗體組1按照lOOug/kg及200ug/kg體重添加 IgY組，小鼠的存活率達到100%，且無不良癥狀。詳細結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯?，口服IgY抗體的小鼠對EV71病毒感染有較好的防御作用。實驗顯示， 口服EV71病毒IgY抗體對抵御該病毒感染有較好的作用。本發(fā)明方法制得的IgY可以開 發(fā)為口服疫苗、保健食品，用于手足口病的預(yù)防或治療。
權(quán)利要求
一種EV71病毒抗體的制備方法，包括以下步驟1)設(shè)計含有不同酶切位點的上、下游引物，擴增EV71病毒株SHZH98的抗原決定序列；2)將擴增得到的抗原決定序列克隆到載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒；3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細菌或真菌中進行表達，收集表達得到的抗原蛋白；4)將抗原蛋白溶解，注射至動物體內(nèi)，誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗體，收集、純化得到抗體，所述抗原決定序列為EV71病毒株SHZH98的2439bp-3329bp、1713bp-3329bp、2439bp-3779bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種EV71病毒抗體的制備方法，其特征在于引物中的酶切 位點為EcoRI、XhoI的酶切位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種EV71病毒抗體的制備方法，其特征在于所述動物為禽
全文摘要
本發(fā)明公開了一種EV71病毒抗體的制備方法。包括以下設(shè)計含有不同酶切位點的上、下游引物，擴增EV71病毒株SHZH98的抗原決定序列；將擴增得到的抗原決定序列克隆到載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細菌或真菌中進行表達，收集表達得到的抗原蛋白；將抗原蛋白溶解，注射至動物體內(nèi)，誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗體，收集、純化得到抗體。本發(fā)明方法制得的抗體，可以阻止EV71病毒的感染，具有預(yù)防和治療手足口病的功能?？梢灾苯犹砑釉谑称?、保健品中。
文檔編號C12N15/63GK101863976SQ20101017273
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者劉磊, 支旭勃, 王俊, 郭海榮 申請人:珠海市英平生物科技有限公司