專利名稱：一種提高α半乳糖甘酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞壁外表面展露表達(dá)α半乳糖苷酶以提高該酶活性的方法。
背景技術(shù)：
飼料中含有水蘇糖等含α半乳糖苷的動物腸道消化酶難以消化的糖類，不僅影響動物對碳水化合物的消化吸收，而且會提高單胃動物消化道粘度，妨礙動物腸道消化酶對飼料中其它營養(yǎng)成分的消化吸收。在飼料中添加α半乳糖苷酶可望有效去除水蘇糖等對動物消化功能的不利影響。但目前已研制成功的α半乳糖苷酶主要存在以下問題酶的重組表達(dá)方式一般是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時由于酶不能與細(xì)胞外底物接觸，從而極大地影響酶的催化效率，而且酶分子集聚在細(xì)胞內(nèi)形成反饋抑制，也影響表達(dá)效率。分泌表達(dá)的主要缺點(diǎn)是表達(dá)效率不高，而且也不能實(shí)現(xiàn)完全分泌表達(dá)，總有相當(dāng)一部分表達(dá)產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，從而也不能實(shí)現(xiàn)酶與細(xì)胞外底物的完全接觸。這兩種表達(dá)方式都導(dǎo)致酶的催化效率不高。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有α半乳糖苷酶催化效率低的問題，本發(fā)明提供一種將α半乳糖苷酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)酶與細(xì)胞外底物的完全接觸，從而顯著提高 α半乳糖苷酶活性。本發(fā)明的一種提高alpha半乳糖苷酶活性的方法，包括以下步驟將α半乳糖苷酶基因(Genbank號30310 連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份α凝集素序列(Genbank號 Μ28164)的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動子(Genbank號ΑΥ428072)下游 MFa 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到C端GAL1 啟動子+MFa 1信號肽序列+ α半乳糖苷酶基因+ α凝集素序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。將包含上述表達(dá)框的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)于添加有7% (重量百分比)半乳糖和 2. 5-5%乳糖(重量百分比)的YPD培養(yǎng)基中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將α半乳糖苷酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面，實(shí)現(xiàn)酶與細(xì)胞外底物的完全接觸，從而顯著提高α半乳糖苷酶活性。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述實(shí)施例1 α半乳糖苷酶展露表達(dá)將α半乳糖苷酶基因(來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae, Genbank
3號30310 連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份α凝集素序列(來自釀酒酵母Mccharomyces cerevisiae, Genbank號iC8164)的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl啟動子(來自釀酒酵母表達(dá)載體PYES263，Genbank號AY428072)下游MFa 1信號肽序列(來自釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae, Genbank 號M17301)的 C 端，構(gòu)建成表達(dá)框(從 N 端到 C 端)GAL1啟動子+MFal信號肽序列+α半乳糖苷酶基因+α凝集素。將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞(Saccharomyces cerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司)，則MFal信號肽將引導(dǎo)α半乳糖苷酶向釀酒酵母細(xì)胞外分泌，而α半乳糖苷酶下游的α凝集素則錨定在釀酒酵母細(xì)胞壁中，從而使α半乳糖苷酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面。實(shí)施例2 α半乳糖苷酶展露表達(dá)的誘導(dǎo)在培養(yǎng)釀酒酵母的YPD培養(yǎng)基中，添加7 %半乳糖(購自上海生工生物工程有 P艮公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & ServicesCo.， Ltd.)和2. 5-5%乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai SangonBiological Engineering Technology & Services Co.，Ltd.)，則表達(dá)框 “GAL1 啟動子+MFa 1 信號肽序列+α半乳糖苷酶基因+α凝集素”中的GALl啟動子就會活化，誘導(dǎo)α半乳糖苷酶在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面展露表達(dá)。實(shí)施例3半乳糖和乳糖對α半乳糖苷酶展露表達(dá)的作用在培養(yǎng)釀酒酵母的YPD培養(yǎng)基中，如果不含半乳糖和乳糖，則未檢測到α半乳糖苷酶活性，這是因?yàn)楸磉_(dá)框“GAL1啟動子+MFa 1信號肽序列+ α半乳糖苷酶基因+FLO序列”中的GALl啟動子無法保持活化狀態(tài)。實(shí)施例4 α半乳糖苷酶展露表達(dá)后活性的提高按照實(shí)施例1和實(shí)施例2所示步驟進(jìn)行展露表達(dá)的α半乳糖苷酶活性為974U/ mL(7%半乳糖和2. 5%乳糖)和892U/mL(7%半乳糖和5%乳糖)，而如果在實(shí)施例1和實(shí)施例2所示的展露表達(dá)表達(dá)框“GAL1啟動子+MFa 1信號肽序列+ α半乳糖苷酶基因+ a 凝集素”中去除α凝集素序列，則α半乳糖苷酶進(jìn)行分泌表達(dá)，活性為273U/mL(7%半乳糖和2. 5%乳糖)和沈卯/11^(7%半乳糖和5%乳糖)。因此，在表達(dá)系統(tǒng)與基本表達(dá)元件一樣的情況下，增加α凝集素這一展露表達(dá)元件可使α半乳糖苷酶活性提高數(shù)倍。α半乳糖苷酶活性單位U定義為在37°C、pH 5. O的條件下，1分鐘內(nèi)從0. 01摩爾 / 升的 pNPG(p-nitrophenyl-alpha-D-galactopyranoside，購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology &Services Co.，Ltd.)溶液中釋放出1微摩爾pNP(p-nitrophenyl p-nitrophenyl，購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological EngineeringTechnology & Services Co.，Ltd. ) ^fff 要的α半乳糖苷酶酶量為IU。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高α半乳糖甘酶活性的方法，其特征在于包括以下步驟將α半乳糖苷酶基因連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份α凝集素序列的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GALl 啟動子下游MF α 1信號肽序列的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到C端GAL1啟動子 +MFa 1信號肽序列+ a半乳糖苷酶基因+ α凝集素序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將包含“權(quán)利要求1”所述表達(dá)框的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)于添加有重量百分比7 %半乳糖和重量百分比2. 5-5 %乳糖的YPD培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明的一種提高alpha半乳糖苷酶活性的方法，包括以下步驟將α半乳糖苷酶基因(Genbank號X03102)連接在釀酒酵母細(xì)胞壁成份α凝集素序列(Genbank號M28164)的N端，然后插入釀酒酵母表達(dá)載體GAL1啟動子(Genbank號AY428072)下游MFα1信號肽序列(Genbank號M17301)的C端，構(gòu)建成表達(dá)框，表達(dá)框從N端到C端GAL1啟動子+MFα1信號肽序列+α半乳糖苷酶基因+α凝集素序列；將包含該表達(dá)框的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將α半乳糖苷酶展露表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞壁外表面，實(shí)現(xiàn)酶與細(xì)胞外底物的完全接觸，從而顯著提高α半乳糖苷酶活性。
文檔編號C12N15/81GK102242095SQ20101017279
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者何國慶, 周陳偉, 廖文艷, 徐娟, 王睿之, 阮暉, 陳美齡, 陳赟, 馬風(fēng)蘭 申請人:浙江大學(xué)