專利名稱：大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菌群的培養(yǎng)，特別涉及一種大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液及其制備方法。
背景技術(shù)：
在食品行業(yè)，大腸菌群的含量是一項(xiàng)重要的衛(wèi)生指標(biāo)。由于于各種食品成分復(fù)雜， 存在干擾菌體生理狀態(tài)、影響檢測(cè)結(jié)果的物質(zhì)，因此，在檢測(cè)前需要進(jìn)行菌體分離富集，以 去除干擾物質(zhì)，然后將分離得到的菌體進(jìn)行檢測(cè)，如果將菌體直接進(jìn)行檢測(cè)，常常因菌量小 而無法檢出，造成錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果。目前，通常采用增菌液對(duì)菌體進(jìn)行培養(yǎng)，增加菌體量，從 而保證檢測(cè)結(jié)果正確，該種增菌液多為大腸菌增菌培養(yǎng)基，采用該培養(yǎng)基增菌需要12小時(shí) 才能達(dá)到檢測(cè)所需的菌體量，因此增菌時(shí)間太長(zhǎng)，不能滿足快速檢測(cè)的要求，造成檢測(cè)效率 低下的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液，對(duì)大腸菌進(jìn)行增菌增酶培 育，快速達(dá)到檢測(cè)要求的菌體量。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種增菌增酶培養(yǎng)液，包括組分A、B， 其中組分A 每IOOOml蒸餾水中含有胰蛋白胨0. 5 2g，氯化鈉2 5g，磷酸二氫鉀 6 8g，氫氧化鈉1 2g;組分B 每IOOmL蒸餾水中含有β -半乳糖苷酶誘導(dǎo)物0. 05-0. 2g，亞致死細(xì)菌快 速修復(fù)物3-6g，細(xì)菌快速增長(zhǎng)劑2-5g;其中，組分A與組分B體積比為100 1。其中，組分A中，每IOOml蒸餾水中還含有自由基清除劑Ig 3g、十二烷基磺酸鈉 0. 03g 0. 06g。其中，所述半乳糖苷酶誘導(dǎo)物為乳糖、異丙基硫代半乳糖苷或者半乳糖中的 任一種。其中，所述亞致死細(xì)菌快速修復(fù)物為甘油、葡萄糖、丙酮酸鈉、抗壞血酸、維生素E 中的任一種或多種。其中，所述細(xì)菌快速增長(zhǎng)劑為三磷酸腺苷、肌酐，肌苷或者牛血清提取物中的任一 種或多種。其中，所述自由基清除劑為活性炭、可溶性淀粉、半胱氨酸、二苯胺、巰基乙醇或 α-生育酚中的任一種。本發(fā)明還提供一種增菌增酶培養(yǎng)液的制備方法，將組分A滅菌后與組分B以體積 比100 1混合，其中組分A為每IOOOml蒸餾水中含有胰蛋白胨0. 5 2g，氯化鈉2 5g，磷酸二氫鉀6 8g，氫氧化鈉1 2g，組分B為每IOOmL蒸餾水中含有β -半乳糖苷 酶誘導(dǎo)物0. 05-0. 2g，亞致死細(xì)菌快速修復(fù)物3-6g，細(xì)菌快速增長(zhǎng)劑2-5g。其中，組分A中，每1000ml蒸餾水中還含有自由基清除劑Ig 3g、十二烷基磺酸鈉 0. 03g 0. 06g。其中，組分A先在121°C下滅菌15分鐘后再與組分B混合。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液，能夠?qū)Υ竽c菌進(jìn)行快速增菌， 與此同時(shí)增加β _半乳糖苷酶的量，對(duì)菌體培養(yǎng)6 7小時(shí)即可達(dá)到檢測(cè)所需的菌體量，增 菌增酶速度快、效率高、成本低廉。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明。實(shí)施例一本發(fā)明的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液包括組分Α、組分B，其中組分A 胰蛋白胨0. 5g，氯化鈉2g，活性炭2g，十二烷基磺酸鈉0. 05g,磷酸二氫鉀 7g，氫氧化鈉2g，溶解于IOOOml蒸餾水，取IOml分裝到試管中，121°C滅菌15分鐘，室溫保
存供使用。組分B 乳糖0. 2g，甘油3g，三磷酸腺苷3g，溶于IOOmL蒸餾水，過濾除菌，取 100 μ 1到IOml培養(yǎng)液組分A中。實(shí)施例二本發(fā)明的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液包括組分Α、組分B，其中組分A 胰蛋白胨0. Sg,氯化鈉3g，可溶性淀粉lg，十二烷基磺酸鈉0. 04g,磷酸二 氫鉀6g，氫氧化鈉lg，溶解于IOOOml蒸餾水，取IOml分裝到試管中，121°C滅菌15分鐘，室 溫保存供使用。組分B 半乳糖0. 07g,葡萄糖4g，肌酐5g，溶于IOOmL蒸餾水，過濾除菌，取100 μ 1 到IOml培養(yǎng)液組分A中。實(shí)施例三本發(fā)明的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液包括組分Α、組分B，其中組分A 胰蛋白胨lg，氯化鈉4g，半胱氨酸3g，十二烷基磺酸鈉0. 06g,磷酸二氫鉀 6g，氫氧化鈉2g，溶解于IOOOml蒸餾水，取IOml分裝到試管中，121°C滅菌15分鐘，室溫保
存供使用。組分B 異丙基硫代半乳糖苷0. 15g，丙酮酸鈉3g，肌苷2g，溶于IOOmL蒸餾水，過 濾除菌，取100 μ 1到IOml培養(yǎng)液組分A中。實(shí)施例四本發(fā)明的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液包括組分Α、組分B，其中 組分A 胰蛋白胨1. 5g，氯化鈉2g，二苯胺g，十二烷基磺酸鈉0. 05g,磷酸二氫鉀 7g，氫氧化鈉17g，溶解于IOOOml蒸餾水，取IOml分裝到試管中，121°C滅菌15分鐘，室溫保
存供使用。組分B 乳糖0. 2g，維生素E3g，牛血清提取物3g，溶于IOOmL蒸餾水，過濾除菌，取 100 μ 1到IOml培養(yǎng)液組分A中。實(shí)施例五本發(fā)明的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液包括組分Α、組分B，其中組分A 胰蛋白胨2g，氯化鈉3g，巰基乙醇lg，十二烷基磺酸鈉0. 06g，磷酸二氫鉀7g，氫氧化鈉lg，溶解于IOOOml蒸餾水，取IOml分裝到試管中，121°C滅菌15分鐘，室溫保
存供使用。 組分B 半乳糖0. 2g，抗壞血酸4g，三磷酸腺苷3g，溶于IOOmL蒸餾水，過濾除菌， 取100 μ 1到IOml培養(yǎng)液組分A中。實(shí)施例六本發(fā)明的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液包括組分Α、組分B，其中組分Α:胰蛋白胨0. 5g，氯化鈉3g，α-生育酚lg，十二烷基磺酸鈉0.04g，磷酸二 氫鉀8g，氫氧化鈉lg，溶解于IOOOml蒸餾水，取IOml分裝到試管中，121°C滅菌15分鐘，室 溫保存供使用。組分B 異丙基硫代半乳糖苷0. 18g，甘油、5g，肌酐2g，溶于IOOmL蒸餾水，過濾除 菌，取100 μ 1到IOml培養(yǎng)液組分A中。以下以兩個(gè)應(yīng)用例對(duì)本發(fā)明大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液的效果進(jìn)行說明。應(yīng)用例一1、樣品利用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8739制備一系列不同菌濃度的大腸桿菌稀釋液。2、培養(yǎng)液組成與制備本發(fā)明的大腸菌群增菌增酶培養(yǎng)液的配方及制備方法參見前述實(shí)施例一 實(shí)施 例六。將以下兩種培養(yǎng)基/培養(yǎng)液作為對(duì)照例，與本發(fā)明的大腸菌群增菌增酶培養(yǎng)液進(jìn) 行實(shí)施效果對(duì)照。對(duì)照例1 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，培養(yǎng)基配 方與制備方法參見GB/T4789. 2-2008)。對(duì)照例2 大腸菌群增菌培養(yǎng)液，其組分及制備方法為將胰蛋白胨0. 5g，氯化鈉 2g，自由基清除劑lg，十二烷基磺酸鈉0. 03g，磷酸二氫鉀6g，氫氧化鈉lg，溶解于IOOOml 蒸餾水，取IOml分裝到試管中，121°C滅菌15分鐘，室溫保存供使用。3、菌體培養(yǎng)取五種不同菌濃度的稀釋液各ImL分別加入到前述大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液、對(duì)照 例1、對(duì)照例2中，每個(gè)稀釋液每種培養(yǎng)液/培養(yǎng)基做2個(gè)重復(fù)，放入39-42°C的恒溫培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)6 7小時(shí)。4、發(fā)光檢測(cè)分別取培養(yǎng)完畢的菌懸液100 μ 1，置于96孔板中相應(yīng)檢測(cè)孔中，加入50 μ 1發(fā) 光試劑底物、發(fā)光增強(qiáng)劑和大腸菌溫和裂解液混合試劑反應(yīng)30分鐘，在振蕩器上搖勻振蕩 1分鐘后，進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，發(fā)光檢測(cè)的波長(zhǎng)為560nm，檢測(cè)積分時(shí)間為Is。此檢測(cè)步驟中， 以半乳糖苷酶作為標(biāo)記物，半乳糖苷酶分解發(fā)光試劑底物時(shí)，反應(yīng)體系會(huì)發(fā)出生物 光，在一定范圍內(nèi)β -半乳糖苷酶的量與發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)，通過發(fā)光值間接測(cè)定大腸菌 群的數(shù)量。其中，發(fā)光試劑底物選用熒光素_ β “半乳糖苷，發(fā)光增強(qiáng)劑選用季銨鹽高聚物， 大腸菌溫和裂解液選用硫酸粘菌素B。5、數(shù)據(jù)處理下列表1、2、3為經(jīng)本發(fā)明大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液、對(duì)照例1、對(duì)照例2培育后的菌液發(fā)光值檢測(cè)結(jié)果表。各表中，序號(hào)為O的檢樣的菌液濃度為0，將其作為對(duì)照樣，測(cè)得其發(fā) 光值，計(jì)算6h檢樣發(fā)光值與對(duì)照樣發(fā)光值的比值Tl、計(jì)算7h檢樣發(fā)光值與對(duì)照樣發(fā)光值的 比值T2，若T2與Tl的比值K少于或等于1. 1 (閥值)，則結(jié)果為大腸菌群未檢出，若T2與 Tl的比值K大于1. 1，則結(jié)果為大腸菌群檢出。其中閥值的理論值應(yīng)為1，但檢測(cè)過程中發(fā) 光值會(huì)有輕微的波動(dòng)，故將閥值設(shè)為略高于1。閥值是由大量檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出。表1、經(jīng)對(duì)照例1 (乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基)培育的菌液發(fā)光值檢測(cè)結(jié)果 表2、經(jīng)對(duì)照例2 (大腸菌群增菌培養(yǎng)液)培育的菌液發(fā)光值快速檢測(cè)結(jié)果 表3、經(jīng)本發(fā)明大腸菌群增菌增酶培養(yǎng)液培養(yǎng)的菌液發(fā)光值快速檢測(cè)結(jié)果 從表1、表2、表3的檢測(cè)數(shù)據(jù)可以得出，以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC8739作為測(cè)試 對(duì)象，在其他檢測(cè)參數(shù)相同的條件下，經(jīng)乳糖膽鹽發(fā)酵基培育的檢樣6 7小時(shí)內(nèi)只能檢出 170CFU/mL，經(jīng)大腸菌群增菌培養(yǎng)液培育的檢樣6 7小時(shí)內(nèi)檢出18CFU/mL，而經(jīng)本發(fā)明大 腸菌群增菌增酶培養(yǎng)液培養(yǎng)的6 7小時(shí)內(nèi)能檢出2CFU/mL(或更低)，因此，得出結(jié)論本 發(fā)明的大腸菌群增菌增酶培養(yǎng)液對(duì)大腸菌群的增菌增酶效果顯著，用于大腸菌群檢測(cè)時(shí)， 檢測(cè)更靈敏。應(yīng)用例二1、樣品一大腸菌群呈陽(yáng)性(> 30MPN/100g)的黃豆醬試驗(yàn)樣。2.培養(yǎng)液組成與制備本發(fā)明的大腸菌群增菌增酶培養(yǎng)液的配方及制備方法參見前述實(shí)施例一 實(shí)施 例六。將以下兩種培養(yǎng)基/培養(yǎng)液作為對(duì)照例，與本發(fā)明的大腸菌群增菌增酶培養(yǎng)液進(jìn) 行實(shí)施效果對(duì)照。對(duì)照例1 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)培養(yǎng)基配方與制備方法(參考GB/T4789. 2-2008)對(duì)照例2 大腸菌群增菌培養(yǎng)液，其組分及制備方法為胰蛋白胨2g，氯化鈉5g，自 由基清除劑3g，十二烷基磺酸鈉0. 06g,磷酸二氫鉀8g，氫氧化鈉2g，溶解于IOOOml蒸餾 水，取IOml分裝到試管中，121°C滅菌15分鐘，室溫保存供使用。3、樣品處理用電子天平移取IOg黃豆醬樣品到含有滅菌玻璃珠的90ml無菌生理鹽水中，振蕩 搖勻，取該樣品稀釋液IOml過30 μ m聚丙烯濾膜，去除大顆粒醬渣，濾后液過0. 45 μ m混合 醋酸纖維素濾膜，用無菌生理鹽水對(duì)截留在膜上的菌體反復(fù)沖洗三次，去除干擾菌體生理 狀態(tài)、影響β-半乳糖苷酶活性及檢測(cè)反應(yīng)體系的物質(zhì)。4、菌體培養(yǎng)用滅菌不銹鋼鑷子將截留菌體的濾膜夾起，分別放入盛有IOml乳糖膽鹽培養(yǎng)液、 大腸菌群增菌培養(yǎng)液、大腸菌群增菌增酶培養(yǎng)液的試管內(nèi)，每種培養(yǎng)液做2個(gè)重復(fù)。利用振 蕩試管的方式將濾膜上的菌體洗脫到試管內(nèi)培養(yǎng)液中，放入39-42°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 6 7小時(shí)。
5、發(fā)光值檢測(cè)取孵育完畢的菌懸液100 μ 1，置于96孔板中相應(yīng)檢測(cè)孔中，加入50 μ 1發(fā)光試劑 底物、發(fā)光增強(qiáng)劑和大腸菌溫和裂解液混合試劑反應(yīng)30分鐘，在振蕩器上搖勻振蕩1分鐘 后，進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，發(fā)光檢測(cè)的波長(zhǎng)為560nm，檢測(cè)積分時(shí)間為Is。其中，發(fā)光試劑底物選用 熒光素_ β _半乳糖苷，發(fā)光增強(qiáng)劑選用季銨鹽高聚物，大腸菌溫和裂解液選用曲拉通。6、數(shù)據(jù)處理 下列表4為經(jīng)本發(fā)明大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液、對(duì)照例1、對(duì)照例2培育后的檢樣發(fā) 光值檢測(cè)結(jié)果表。以乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基為例進(jìn)行說明序號(hào)1-1、1_2為經(jīng)乳糖膽鹽發(fā)酵 培養(yǎng)基培育的檢樣，序號(hào)1-0為未添加菌體的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，將其作為對(duì)照樣，測(cè)得 其發(fā)光值，計(jì)算序號(hào)為1-1、1-2的檢樣6h檢樣發(fā)光值與對(duì)照樣發(fā)光值的比值Tl、7h檢樣發(fā) 光值與對(duì)照樣發(fā)光值的比值T2，若T2與Tl的比值K少于或等于1. 1 (閥值)，則結(jié)果為大 腸菌群未檢出，若T2與Tl的比值K大于1. 1，則結(jié)果為大腸菌群檢出。其中閥值的理論 值應(yīng)為1，但檢測(cè)過程中發(fā)光值會(huì)有輕微的波動(dòng)，故將閥值設(shè)為略高于1。閥值是由大量檢 測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出。序號(hào)2-1、2_2為經(jīng)大腸菌群增菌培養(yǎng)液培養(yǎng)得到的檢樣，序號(hào)2-0為未添加菌體 的大腸菌群增菌培養(yǎng)液，將其作為對(duì)照樣。序號(hào)3-1、3-2為培養(yǎng)液3為經(jīng)大腸菌群增菌增 酶培養(yǎng)液培養(yǎng)得到的檢樣，序號(hào)3-0為未添加菌體的大腸菌群增菌增酶培養(yǎng)液，將其作為 對(duì)照樣。表4經(jīng)不同培養(yǎng)基(液)培養(yǎng)的檢樣發(fā)光值檢測(cè)結(jié)果 從表4的檢測(cè)數(shù)據(jù)可以看出，以大腸菌群呈陽(yáng)性的黃豆醬試驗(yàn)樣作為檢測(cè)對(duì)象，在其他檢測(cè)參數(shù)相同的條件下，在6 7小時(shí)內(nèi)經(jīng)乳糖膽鹽發(fā)酵基、大腸菌群增菌培養(yǎng)液分 別培育的檢樣均未能達(dá)到國(guó)標(biāo)的檢測(cè)限，而經(jīng)大腸菌群增菌增酶培養(yǎng)液6 7小時(shí)內(nèi)培育 的檢樣能達(dá)到國(guó)標(biāo)檢測(cè)限(> 30MPN/100g)的要求。
以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì) 本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改 進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液，其特征在于，包括組分A、B，其中組分A每1000ml蒸餾水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化鈉2～5g，磷酸二氫鉀6～8g，氫氧化鈉1～2g；組分B每100mL蒸餾水中含有β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)物0.05-0.2g，亞致死細(xì)菌快速修復(fù)物3-6g，細(xì)菌快速增長(zhǎng)劑2-5g；其中，組分A與組分B體積比為100∶1。
2.如權(quán)利要求1的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液，其特征在于，組分A中，每IOOOml蒸餾水中 還含有自由基清除劑Ig 3g、十二烷基磺酸鈉0. 03g 0. 06g。
3.如權(quán)利要求1的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液，其特征在于，所述半乳糖苷酶誘導(dǎo)物為 乳糖、異丙基硫代半乳糖苷或者半乳糖中的任一種。
4.如權(quán)利要求1的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液，其特征在于，所述亞致死細(xì)菌快速修復(fù)物 為甘油、葡萄糖、丙酮酸鈉、抗壞血酸或維生素E中的任一種或多種。
5.如權(quán)利要求1的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液，其特征在于，所述細(xì)菌快速增長(zhǎng)劑為三磷 酸腺苷、肌酐、肌苷或者牛血清提取物中的任一種或多種。
6.如權(quán)利要求2的增菌增酶培養(yǎng)液，其特征在于，所述自由基清除劑為活性炭、可溶性 淀粉、半胱氨酸、二苯胺、巰基乙醇或α “生育酚中的任一種。
7.一種大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，將組分A滅菌后與組分B以 體積比100 1混合，其中組分A為每IOOOml蒸餾水中含有胰蛋白胨0. 5 2g，氯化鈉 2 5g，磷酸二氫鉀6 8g，氫氧化鈉1 2g，組分B為每IOOmL蒸餾水中含有β -半乳 糖苷酶誘導(dǎo)物0. 05-0. 2g，亞致死細(xì)菌快速修復(fù)物3-6g，細(xì)菌快速增長(zhǎng)劑2-5g。
8.如權(quán)利要求7的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，組分A中，每 IOOOml蒸餾水中還含有自由基清除劑Ig 3g、十二烷基磺酸鈉0. 03g 0. 06g。
9.如權(quán)利要求7的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，組分A先在121°C 下滅菌15分鐘后再與組分B混合。
全文摘要
本發(fā)明公開一種大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液，包括組分A、B，其中組分A每1000ml蒸餾水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化鈉2～5g，磷酸二氫鉀6～8g，氫氧化鈉1～2g；組分B每100mL蒸餾水中含有β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)物0.05-0.2g，亞致死細(xì)菌快速修復(fù)物3-6g，細(xì)菌快速增長(zhǎng)劑2-5g；其中，組分A與組分B體積比為100∶1。本發(fā)明的大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液，能夠?qū)Υ竽c菌進(jìn)行快速增菌，與此同時(shí)增加β-半乳糖苷酶的量，對(duì)菌體培養(yǎng)6～7小時(shí)即可達(dá)到檢測(cè)所需的菌體量，增菌增酶速度快、效率高。本發(fā)明還公開一種大腸菌增菌增酶培養(yǎng)液的制備方法。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101864383SQ20101017320
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日
發(fā)明者嚴(yán)守雷, 吳俊 , 潘思軼, 繆素娜, 鄧少雅, 黃文彪 申請(qǐng)人:佛山市海天調(diào)味食品有限公司;佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司