專利名稱：環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢測微小原甲藻的方法
技術領域：
本發(fā)明屬微小原甲藻的DNA分子檢測領域，特別是涉及一種環(huán)介導恒溫擴增技術 快速檢測微小原甲藻的方法。
背景技術：
微小原甲藻(prorocentrum minimum)是中國海域多發(fā)赤潮藻，近年來引發(fā)多起赤 潮。赤潮已成為一種世界性的公害，它對海洋生態(tài)平衡、海洋漁業(yè)、水產資源、以及人類健康 的產生很大危害。對赤潮進行預測成為學者們關注的問題，而對赤潮藻類進行檢測是首要 一環(huán)，傳統(tǒng)的藻類鑒定是通過形態(tài)學的觀察來劃分的，從色素，色素體，貯藏物質等的差別 來辨別不同種的藻類細胞，這是一件費時費力的事，而且不同的種屬差別很細微，非長期從 事該工作的專業(yè)人員難以勝任這項工作，并且環(huán)境對藻類形態(tài)有很大影響，鑒定到種存在 的困難較多。目前，利用分子生物學手段檢測微藻的方法日漸成熟，這些方法從分子水平解 決了某些從形態(tài)上難以區(qū)分的藻類分類和鑒定問題。自從聚合酶鏈式反應(Polymerase ChainReaction, PCR)技術發(fā)明以來，這種技術就被應用到諸多領域。許多學者通過微藻 某些基因片段擴增來對藻類進行鑒定，例如通過對核糖體rDNA序列分析，核糖體間隔區(qū) (ITS)的PCR擴增和測序，從而完成對微藻類的種類鑒定。熒光原位雜交也是近年來微藻鑒 定的檢測手段，有些學者利用核糖體大亞基(LSU)和ITS區(qū)分子探針對某些赤潮微藻進行 了鑒定，但是這種技術對探針要求高。實時熒光定量PCR檢測也是近年來微藻檢測一個方 向，這種方法非常靈敏，檢測時間需1 2小時，但是所需實驗儀器(熒光定量PCR儀)和 試劑價格昂貴。上述方法因為實驗條件等因素限制不能應用于現場檢測。2000年，日本學者Notomi等開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴增方法，即環(huán)介導恒溫 擴增反應(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特點是針對靶基因的6個 區(qū)域設計4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65°C 左右)下保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。此反應不需要模板的熱變性、長時間溫度 循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，而且結果判定簡單，既可以利用儀器檢測或肉眼觀察 核酸擴增過程中產生的焦磷酸鎂沉淀判定，也可以采用肉眼觀察反應液的顏色變化來迅速 判定。這種技術已經廣泛應用到病原菌檢測方面，取得理想的檢測效果。但迄今為止，尚 未見將該技術應用于微小原甲藻檢測鑒別的相關文獻報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢測微小原甲 藻的方法，該方法具有操作簡單快速、對儀器要求不高、特異性強、擴增效率高、結果判定簡 單等優(yōu)點，適合對微小原甲藻快速鑒定和現場檢測。本發(fā)明的一種環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢微小原甲藻的方法，包括
(1)赤潮藻類的基因組DNA提取(2) LAMP 擴增引物
權利要求
一種環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢微小原甲藻的方法，包括(1)赤潮藻類的基因組DNA提取(2)LAMP擴增引物兩個外引物Pm F35’ CGCGCTTGATCGTCTCTT 3’Pm B35’ CCAGTGGCAAGCCAAGAC 3’；兩個內引物Pm FIP5’ ACCCGCAGACGAGCTACCATTGTGTCAACGCCTGTTCG 3’Pm BIP5’ TGGCAGAACTCATTTGCGGACTCTTCCAGAATGCCAAGGACA 3’；(3)LAMP擴增反應體系(4)LAMP擴增產物的檢測。
2.根據權利要求1所述的一種環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢微小原甲藻的方法，其特征 在于所述步驟(3)中的LAMP擴增反應體系所用試劑為2. 5uL lOXbuffer，兩個內引物 Pm-FIP和Pm-BIP的終濃度均為1. 6 μ M，兩個外引物Pm_F3和Pm_B3的終濃度均為0. 2 μ M， 另外包括6mM MgS04,0. 6mM dNTP，0. 6M Betaine (Sigma-Aldrich), 8U Bst DNA聚合酶，IuL DNA模板。
3.根據權利要求1所述的一種環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢微小原甲藻的方法，其特征 在于所述步驟(3)中的LAMP擴增反應體系的條件為反應溫度65°C，反應時間60min，最 后于85°C保持3min終止反應。
4.根據權利要求1所述的一種環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢微小原甲藻的方法，其特征 在于所述步驟(4)中的LAMP擴增產物檢測，電泳檢測可見陽性反應出現梯狀條帶，陰性反 應沒有條帶的出現，肉眼觀察可見陽性反應管內有大量白色沉淀產生，或加2μ L100XSYBR Green I于反應管中，反應管呈現綠色為陽性，反應管內顏色不變的為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢測微小原甲藻的方法，包括(1)赤潮藻類的基因組DNA提取；(2)4條LAMP擴增引物Pm-F3CGCGCTTGATCGTCTCTT；Pm-B3CCAGTGGCAAGCCAAGAC；Pm-FIPACCCGCAGACGAGCTACCATTGTGTCAACGCCTGTTCG；Pm-BIPTGGCAGAACTCATTTGCGGACTCTTCCAGAATGCCAAGGACA；(3)LAMP擴增反應體系；(4)LAMP擴增產物的檢測。本發(fā)明的LAMP檢測方法具有操作簡單快速、對儀器要求不高、特異性強、擴增效率高、結果判定簡單等優(yōu)點，適合對微小原甲藻進行快速鑒定和檢測。
文檔編號C12Q1/04GK101942506SQ20101017330
公開日2011年1月12日 申請日期2010年5月12日 優(yōu)先權日2010年5月12日
發(fā)明者張鳳英, 徐兆禮, 馬凌波 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所