專利名稱:利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā) 明屬于植物基因工程領(lǐng)域,具體地說涉及利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲的 轉(zhuǎn)基因植物的方法及相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植物。
背景技術(shù):
棉花是我國第一大經(jīng)濟作物,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及整個國民經(jīng)濟中占有極其重要的戰(zhàn)略 地位和經(jīng)濟價值,隨著棉花生產(chǎn)的迅猛發(fā)展,棉花枯黃萎病、棉鈴蟲、蚜蟲、葉螨等病蟲害越 來越重,其中棉鈴蟲(Helicoverpa armigera Hubner)是危害中國棉花生產(chǎn)的最主要害蟲, 對我國棉花生產(chǎn)構(gòu)成巨大威脅,常年損失達10 15% (王仁祥,作物研究2001,棉花專緝 6-9)。全國每年用于棉花害蟲防治的殺蟲劑用量約占殺蟲劑使用總量的2/3,雖然對減輕蟲 害具有明顯的作用,但也帶來了嚴重的社會問題,如棉花的生產(chǎn)成本急劇增加,嚴重危害棉 農(nóng)的健康及生命安全,棉鈴蟲抗藥性增強,環(huán)境污染,生態(tài)失衡等,棉田害蟲的防治越來越 困難。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育成為解決此類問題最經(jīng)濟最有效的途徑之一(汪新業(yè)等.種子 科技 2003,3 156-157)。目前使用最廣泛也是最有效的抗蟲基因是蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白基因(Bt基 因),應(yīng)用于棉花的主要有CryIA(b)、CryIA(c) XryIIA和CryIVA等幾種,以培育抗棉鈴蟲 的轉(zhuǎn)基因棉花。經(jīng)改良的CryIA(c)和CryIA(b)的表達量可達到棉株中可溶性蛋白的0. 1% 和0. 05%,能有效地殺死棉鈴蟲、紅鈴蟲等鱗翅目害蟲。然而,我國所推廣的針對棉鈴蟲的 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉,幾乎都是涉及Bt及其相關(guān)的基因,存在很大的隱患。主要是=(I)Bt抗蟲棉 的殺蟲活性主要在一代和二代,而在棉鈴蟲的第三、第四代時明顯降低;(2)Bt抗蟲棉抗性 比較單一,只對棉鈴蟲、紅鈴蟲等少數(shù)鱗翅目害蟲有效果,而對棉田其它害蟲沒有抗性;(3) 棉鈴蟲對Bt抗蟲棉易產(chǎn)生抗性,存在Bt抗蟲棉失效和Bt生物農(nóng)藥失效的巨大隱患,試驗 研究推測,大田連續(xù)種植8 10年后,轉(zhuǎn)Bt基因棉可能喪失對棉鈴蟲的抗性,從而失去利 用價值(汪若海等.生物技術(shù)通報2000,5 :1-6 ;王仁祥,作物研究2001,棉花專緝6_9)。 因此,應(yīng)積極篩選新的抗蟲基因,培育高效廣譜的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花?;ㄇ嗨厥侵参锕ず头N皮顏色的主要色素物質(zhì),是花瓣從紅色、紫色到藍色的主 要呈色物質(zhì),是類黃酮的重要組成部分?;ㄇ嗨氐纳锖铣赏緩接薪?0步化學(xué)反應(yīng),由兩 組基因調(diào)控,第一組大約涉及15個結(jié)構(gòu)基因,編碼催化花青素生化反應(yīng)的多種酶類,第二 組是調(diào)節(jié)基因,其編碼的轉(zhuǎn)錄因子或?qū)儆贛YB-型Cl家族,或是堿性bHLH MYC-型R家族 (HK. Dooner 等· Annual Review of Geneticsl991,25 173-199),調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的時空表 達。玉米Cl基因在胚乳的糊粉層中調(diào)節(jié)花青素著色與否(KC. Cone等.Proc Natl Acad Sci U S A. 1986,83 :9631-9635),而R基因調(diào)控花青素著色的時空分布(SR. Ludwig等.Proc NatlAcad Sci U S A. 1989,86 (18) :7092_7096)。Lc (lear color,簡稱 Lc)基因?qū)?R 基 因家族,是玉米花青素生物合成途徑中的一個調(diào)節(jié)基因,編碼大約610個氨基酸的蛋白, 典型的 bHLH MYC 型轉(zhuǎn)錄因子(SR. Ludwig 等.Proc Natl Acad SciU S A. 1989,86 (18) 7092-7096)。在玉米中,Lc基因參與調(diào)節(jié)花青素生物合成途徑中多個結(jié)構(gòu)基因如C2基因的表達,調(diào)控花青素著色的數(shù)量、分布和時間。組成型表達單個Lc基因足以激活花青素生 物合成途徑,而且還與類黃酮化合物生物合成相關(guān)聯(lián),對植物育性和抵抗病蟲害起到重要 作用(HK. Dooner 等· AnnualReview of Genetics 1991,25 173-199),比如,轉(zhuǎn) Lc 基因蘋 果植株中,PAL、CHS、FHT、DFR、LAR、ANS和ANR的mRNA水平得以提高,葉片中花青素越橘花 青苷(anthocyanin idaein)上升 12 倍,黃燒-3-表兒茶酸(flavan 3_ol印icatechin)上 升 14 倍,同分異構(gòu)兒茶酸(isomeric catechin)上升 41 倍等(H. Li 等.Planta 2007,226 1243-1254);表達玉米C2基因的轉(zhuǎn)基因水稻,稻瘟病抗性增強(M. Gandikota等.Molecular Breeding 2001,7 :73_83)。經(jīng)檢索,沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)玉米Lc基因在抗棉鈴蟲植物上應(yīng)用的報道.
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供玉米Lc基因在培育抗棉鈴蟲植物上的用途。本發(fā)明另一目的在于提供含有玉米Lc基因的轉(zhuǎn)基因植物、組織或細胞。本發(fā)明第三目的在于提供含有玉米Lc基因的轉(zhuǎn)基因棉花、棉花組織或棉花細胞。本發(fā)明第四目的在于提供利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲植物的方法。為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案如下玉米Lc基因在培育抗棉鈴蟲植物上的應(yīng)用,其中所述的玉米Lc基因編碼由SEQ ID No :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。上述應(yīng)用中所述的玉米Lc基因由SEQ ID No :1所示的核苷酸序列組成;或者由與 SEQ ID No :1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性并編碼相同功能蛋白的核苷酸序列組 成。所述的玉米Lc基因為玉米葉色基因(leaf color gene),在Genbank中的編號為 ID M26227。上述應(yīng)用中所述的植物是指棉花。含有所述的外源玉米Lc基因的植物、組織或細胞。含有所述的外源玉米Lc基因的棉花、棉花組織或棉花細胞。利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲植物的方法,將玉米Lc基因克隆到質(zhì)粒載體上并 導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株,再經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入植物,可得抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因植物。上述方法中所述的質(zhì)粒載體可以是pBI 121。上述方法中所述的農(nóng)桿菌菌株可以是LBA4404。利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲植物的方法,包括如下步驟(1)將外源的玉米Lc基因轉(zhuǎn)入植物細胞或組織,獲得含有外源玉米Lc基因的植物 細胞或組織;(2)將含有外源玉米Lc基因的植物細胞或組織,再生成植物植株,即得抗棉鈴蟲 的植物。上述方法中所述的植物優(yōu)選棉花。在一優(yōu)選例中,在步驟(1)中 ,將外源的玉米Lc基因轉(zhuǎn)入棉花細胞或組織。在另一優(yōu)選例中,在步驟(1)中,用攜帶玉米Lc基因表達載體的農(nóng)桿菌感染棉花 下胚軸。
利用上述所得的轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花培育棉花品種的方法,以上述轉(zhuǎn)Lc基因棉花 為親本之一,利用回交或者雜交的方法,可培育出抗棉鈴蟲的棉花品種。 本發(fā)明的優(yōu)點(1)本發(fā)明轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株對棉鈴蟲的抗性強,為抗棉鈴 蟲育種提供了一種新的途徑;(2)和使用殺蟲劑相比,本發(fā)明方法成本低,且不會造成農(nóng)藥 殘留和環(huán)境污染。
圖1.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花Ttl代植株Southern雜交印跡圖。圖2.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花T1代植株Southern雜交印跡圖。圖3.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花表型照片,其中A為轉(zhuǎn)玉米Lc基因愈傷組織,B為轉(zhuǎn)玉 米Lc基因體細胞胚,C為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株葉片,D為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株莖桿,E為轉(zhuǎn)玉 米Lc基因植株花蕾,F(xiàn)為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株花藥,G、H為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株葉片柵欄細 胞,I為黑暗條件下培養(yǎng)一周轉(zhuǎn)玉米Lc基因胚珠,J、K為光照條件下培養(yǎng)一周轉(zhuǎn)玉米Lc基 因胚珠,L為轉(zhuǎn)基因T1代幼苗中Lc基因遺傳分離,陽性苗表現(xiàn)出紅色根。圖4.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株葉片粗提物光譜分析曲線圖。圖5.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株葉片花青素含量柱形圖;其中1為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植 株干葉,2為野生型植株干葉,3為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株鮮葉,4為野生型植株鮮葉。圖6.轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株葉片花青素成分含量柱形圖;其中1為轉(zhuǎn)玉米Lc基 因植株干葉,2為野生型植株干葉,3為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株鮮葉,4為野生型植株鮮葉。圖7.轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片和非轉(zhuǎn)基因葉片同時飼喂棉鈴蟲幼蟲1天后葉片照片, 其中al、Cl 轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片,bl 非轉(zhuǎn)基因葉片。圖8.轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片和非轉(zhuǎn)基因葉片同時飼喂棉鈴蟲幼蟲3天后照片,其中 A2、c2 轉(zhuǎn)Lc基因葉片,b2 非轉(zhuǎn)基因葉片。圖9.轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片和非轉(zhuǎn)基因葉片分別飼喂棉鈴蟲幼蟲5天后照片,其中 d 轉(zhuǎn)玉米Lc基因紅色葉片,e 轉(zhuǎn)玉米Lc基因綠色葉片,f、g 非轉(zhuǎn)基因葉片。圖10.轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片和非轉(zhuǎn)基因葉片分別飼喂棉鈴蟲幼蟲5天后幼蟲體重 柱形圖;其中1為轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株葉片喂養(yǎng),2為野生型植株葉片喂養(yǎng)。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明做進一步的說明,但是不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。如 無特別說明,實施例中所涉及的方法等皆為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法,可參見《分子克 隆實驗指南》等。實施例1轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花的培育通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation http //www, ncbi. nlm. nih. gov),檢索獲取玉米 Lc 基因序列 數(shù)據(jù),設(shè)計如下引物L(fēng)cB-F :5,-ccggatccatggcgctttcagcttcccg-3,(SEQ ID No 3),LcH-R :5,-ggaagctttcaccgcttccctatagctttg-3,(SEQ ID No 4),選取玉米授粉后10天的雌穗,用熱酚法(參見XB Li等.Plant Cell 2005,17 859-875)提取總RNA,根據(jù)QIANGEN —步RT-PCR方案做反轉(zhuǎn)錄,即RNA模板加入到反應(yīng)液 中,50°C下反轉(zhuǎn)錄30分鐘,之后滅活反轉(zhuǎn)錄酶(QIANGEN公司產(chǎn)品使用指南),cDNA模板 95°C變性15分鐘,以LcB-F和LcH-R為引物PCR擴增玉米Lc基因編碼區(qū)cDNA片段,反應(yīng)程 序為94°C 45秒、60°C 45秒、72°C 2分鐘,計30循環(huán)。所獲cDNA片段經(jīng)Bam Hi/Hind III 處理后,_20°C保存?zhèn)溆?。質(zhì)粒pBI121用BamHI/SacI切開,連接上一個Hind III-SacI 接頭5,-AGCTTGAGCT-3,(SEQ ID No 5), 與前述玉米Lc基因cDNA連接,經(jīng)測序(北京三博志遠基因技術(shù)有限公司)確認玉 米Lc基因(序列見SEQ ID No 1)正確克隆到35S啟動子下游,得到植物表達載體pBI_Lc。 采用電擊法將表達載體PBI-Lc導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404。將棉花種子(珂字312,Coker312)用70%乙醇處理1分鐘、10%雙氧水處理 1-2小時進行表面消毒,放置在1/2MS固體培養(yǎng)基(組成成份及其比例為1/2MS無機鹽、 1/285維生素、1/2 鐵鹽、0. 5%葡萄糖、0. 5g/L MgCl2 · 6Η20、0· 25% phytagel、ρΗ6· 0)上, 在25 28°C、14小時光照/10小時黑暗的條件下培養(yǎng)發(fā)芽。挑取含有質(zhì)粒pBI_Lc的農(nóng) 桿菌LBA4404單菌落,放入IOml LB液體培養(yǎng)基中,28°C搖床中振蕩培養(yǎng)3天,取2ml菌液 5000rpm離心3分鐘,去除上清液,加入Iml MS共培養(yǎng)基重懸菌體,吸取適量重懸后的菌液, 加入到50ml液體MS共培養(yǎng)基中,使OD值約0. 1。選取發(fā)芽6 9天的棉花幼苗,將其下胚 軸切成5mm的小段,浸入上述處理好的農(nóng)桿菌LBA4404菌液中15min,之后將外植體轉(zhuǎn)至固 體MS共培養(yǎng)基(組成成份及其比例為MS無機鹽、維生素B5、鐵鹽、3.0%葡萄糖、0. lmg/L KT,0. 05mg/L 2,4-D、100umol/L 乙酰丁香酮、0. 5g/L MgCl2 ·6Η20、0· 25% phytagel,ρΗ6. 0) 上,在25 28°C、14小時光照/10小時黑暗的條件下共培養(yǎng)3天。將外植體轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng) 基(組成成份及其比例為MS無機鹽、B5維生素、鐵鹽、3.0%葡萄糖、0. lmg/L KT、0. 05mg/L 2,4-D、0. 5g/L MgCl2 ·6Η20、0· 3% phytagel、pH6. 0,附加頭孢霉素 500mg/L、潮霉素 5mg/L) 上誘導(dǎo)愈傷組織,3 4周繼代培養(yǎng)一次。將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(組 成成份及其比例MS無機鹽、B5維生素、鐵鹽、3. 0%葡萄糖、0. 5g/L MgCl2 · 6H20、1. 9g/L KN03、1. Og/L谷氨酰胺、0. 5g/L天門冬酰胺、0. 3% phytagel、pH6. 0,附加頭孢霉素500mg/ L、潮霉素5-10mg/L),在25 28°C、14小時光照/10小時黑暗的條件下繼代培養(yǎng)直到長出 胚狀體。將成熟體細胞胚轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基(組成成份及其比例無NH4NO3的MS無機鹽、B5 維生素、鐵鹽、3. 0%葡萄糖、0. 5g/L MgCl2 ·6Η20、1· 9g/L KNO3>0. 3% phytagel,pH6. 0,附加 頭孢霉素500mg/L、潮霉素5-10mg/L)培養(yǎng)直到長出幼芽和根。將2-4cm并長出真葉的幼 苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(組成成份及其比例1/2MS無機鹽、1/2B5維生素、1/2鐵鹽、0. 5%葡萄 糖、0. lmg/L IAA,0. lmg/L KT,0. 25% phytagel、ρΗ6· 0)上,25 28°C、14 小時光照 /10 小 時黑暗的條件下培養(yǎng)4周,得到轉(zhuǎn)化再生植株并移栽到溫室中。共獲得陸地棉(Gossypium hirsutum, Coker 312)6個獨立的轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花株系(株系編號分別為L28、L82、 L73、L74、L143、L144)。實施例2轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花中玉米Lc基因的分子檢測CTAB方法提取實施例1中所得的6個轉(zhuǎn)玉米Lc基因的Ttl代植株基因組DNA(L. Wang. Plant Cell 1998,10 1733-46),以下述序列為引物L(fēng)c-F :5,-atggcgctttcagcttcccgagt-3,(SEQ ID No 6),Lc-R 5' -tcaccgcttccctatagctttgc-3' (SEQ ID No 7),
PCR擴增Lc基因片段,制備Southern雜交探針,50ug基因組DNA用限制性內(nèi)切 酶BamHI 37°C酶切過夜,瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至Hybond N+尼龍膜上(具體方法參見 Amersham公司產(chǎn)品使用指南),地高辛-ll_dUTP標記Lc基因探針,42°C下與尼龍膜雜交 過夜(Roche公司產(chǎn)品使用指南),結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因Ttl代植株中,L82含3個Lc基因拷貝, L73、L74、L143、L144含單拷貝Lc基因,L28含6個Lc基因拷貝(見圖1)。將6個轉(zhuǎn)基因Ttl代植株盆栽種植于溫室,單株自交后收獲T1代種子,并種植于相同溫室中,每株系種植20株。CTAB方法提取L143I\代植株基因組DNA,50ug基因組DNA用限 制性內(nèi)切酶BamHI 37°C酶切過夜,瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至Hybond N+尼龍膜上(Amersham 公司產(chǎn)品使用指南),地高辛-11-dUTP標記Lc基因探針,42°C下與尼龍膜雜交過夜(Roche 公司產(chǎn)品使用指南),結(jié)果顯示,外源玉米Lc基因能穩(wěn)定傳遞到T1代,并表現(xiàn)為單基因位點 遺傳(見圖2)。實施例3轉(zhuǎn)基因棉花植株中Lc基因表達鑒定熱酚法(參見XB Li等· Plant Cell 2005,17 =859-875)提取實施例1所得的轉(zhuǎn) 基因植株嫩葉、莖、花器官包括花瓣、子房、花藥和萼片的總RNA,根據(jù)QIANGEN —步RT-PCR 方案做反轉(zhuǎn)錄,即RNA模板加入到反應(yīng)液中,50°C下反轉(zhuǎn)錄30分鐘,之后滅活反轉(zhuǎn)錄酶 (QIANGEN公司產(chǎn)品使用指南),cDNA模板95°C變性15分鐘,前述Lc基因引物L(fēng)c-F (SEQ ID No 6) ^P Lc-R(SEQ ID No 7)做 PCR 擴增,反應(yīng)程序為 94°C 45 秒、56°C 45 秒、72°C 2 分鐘, 計30循環(huán),同時PCR擴增肌動蛋白基因(Actin基因)作為內(nèi)標,所用引物為Actin-F :5,-tttgctggtgatgatgctcc-3,(SEQ ID No 8)Actin-R :5,-ctccaatccagacactgtact-3,(SEQ ID No :9)。RT-PCR分析顯示,Lc基因在轉(zhuǎn)基因棉花Ttl代植株葉片和花器官中均有表達,而野 生型棉花植株中檢測不到Lc基因表達;不同組織器官中Lc基因表達水平稍有差異,花瓣中 未檢測到Lc基因表達,葉片中Lc基因持續(xù)高水平表達,4 16天子房中Lc基因表達水平 最高,7 13天的棉纖維中Lc基因中度表達,而23天及以后的成熟棉纖維細胞中,幾乎檢 測不到Lc基因表達。實施例4轉(zhuǎn)化棉花細胞和轉(zhuǎn)基因棉花植株表型觀測玉米Lc基因轉(zhuǎn)化棉花過程中,觀察到卡那抗性愈傷組織和體細胞胚顯現(xiàn)紅色或 紫色,體細胞成熟胚中,胚根、胚軸和子葉有花青素積累(見圖3.A、B)。轉(zhuǎn)基因幼苗的綠色 真葉同樣積累花青素,根保持紅色。田間生長的轉(zhuǎn)基因Ttl代植株,幼嫩葉片通常表現(xiàn)為紅 色或紫色斑塊,間有綠色區(qū)域,莖、萼片及花藥明顯有著色,而花瓣無著色(見圖3. C、D、E、 F)。轉(zhuǎn)基因Ttl代植株葉片經(jīng)徒手切片觀察到,花青素積累在葉片的柵欄細胞及維管中,表 皮細胞中未發(fā)現(xiàn)有花青素(見圖3.G、H)。非轉(zhuǎn)基因植株衰老葉片保持黃顏色,轉(zhuǎn)基因植株 老葉片則變?yōu)榧t色。上述著色方式可以遺傳到Tl和T2代,并與外源Lc基因共分離(見圖 3. L)。轉(zhuǎn)基因植株及其后代(T1和T2)未發(fā)現(xiàn)形態(tài)變化。實施例5轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花胚珠離體培養(yǎng)觀察實施例1中轉(zhuǎn)Lc基因棉花T1代植株開花后2天的棉鈴,70%乙醇滅菌5-10分 鐘后,取幼嫩胚珠放入液體培養(yǎng)基(CA Beasley等.Am. J. Bot. 61 188-194)中離體培養(yǎng)一 周,光照條件下棉纖維細胞轉(zhuǎn)為深紅色,且在中央液泡中積累紅色或紫色油狀液態(tài)物(見 圖3. J、K),而在黑暗條件下棉纖維細胞保持白色(見圖3. I),表明玉米Lc基因參與花青素合成受光照調(diào)控。實施例6轉(zhuǎn)Lc基因棉花植株中花青素含量測定選取實施例1中轉(zhuǎn)Lc基因棉花植株(L143)的新鮮或風(fēng)干葉片材料提取花青素 (MG Choung 等 J Agric. Food. Chem. 2001,49 5848-5851),pH 差減法處理提取樣品(J Lee 等 J Ass. Off. Ana. Chem. Inter. 2005,88 1269-1278),采用 UV-VIS 分光光度計進行定量 分析(ZZ Gong等Plant Mol. Biol. 1997,35 =915-927),花青素含量計為氰化_3_葡糖苷, 依照Lambert-Beer’ s定律計算(Α = ε CL, A-吸收峰值,C-濃度,L-光路長度以厘米計, ε-摩爾消光系數(shù),為26900L/mol ;摩爾質(zhì)量取449g/mol)。對比非轉(zhuǎn)基因棉花,轉(zhuǎn)Lc基因 棉花植株葉片提取物呈現(xiàn)深紅色,光譜分析顯示,轉(zhuǎn)Lc基因葉片粗提物分別在210-230nm、 280nm、510nm波長處吸收峰有明顯增加(見圖4)。pH差減法(JLee等· J Ass. Off. Ana. Chem. Inter. 2005,88 1269-1278)定量分析花青素含量,結(jié)果轉(zhuǎn)玉米Lc基因植株葉片中氰 化-3-葡糖苷達53. 6mg/100g(干重),為野生型棉花的3. 5倍(見圖5)。轉(zhuǎn)Lc基因植株 干葉中,單體花青素占總花青素的27. 2%、多聚體花青素占43. 8%、其它占29. 0%,非轉(zhuǎn)基 因植株干葉中分別為17. 3%、67. 2、15. 5% (見圖6)。說明轉(zhuǎn)Lc基因棉花植株中Lc基因 的表達顯著促進了棉花葉片中總花青素的產(chǎn)生量。實施例7轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株棉鈴蟲抗性鑒定摘取實施例1中轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花的Tl代植株(L143-5、L143-6、L143-7)與相 應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因棉株的第四片葉,清水沖洗晾干后喂食三齡棉鈴幼蟲。試驗1 將轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉株葉與非轉(zhuǎn)基因棉株葉放入同一個培養(yǎng)皿中,放入3 條棉鈴幼蟲飼喂1-3天,重復(fù)10皿;試驗2 將轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉株葉與非轉(zhuǎn)基因棉株葉分別放在不同的皿中,每皿放 入3條相同大小、相同齡期的棉鈴幼蟲飼喂5天,重復(fù)13對皿。結(jié)果,同時飼喂轉(zhuǎn)玉米Lc基因和非轉(zhuǎn)基因葉片時,棉鈴蟲幼蟲偏向取食非轉(zhuǎn)基因 葉片,飼喂1天后,轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片保持完整,非轉(zhuǎn)基因葉片則被取食(見圖7),3天后 這一結(jié)果更加明顯(見圖8),轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉株葉片被取食通常是葉片的綠色部分而非紅 色區(qū)塊。脅迫飼喂試驗中,棉鈴蟲幼蟲在轉(zhuǎn)玉米Lc基因葉片上幾乎不取食(見圖9),幼蟲 體重明顯低于非轉(zhuǎn)基因葉片飼喂的幼蟲(見圖10)。以上結(jié)果說明表達Lc基因的轉(zhuǎn)基因棉 花具有較好的棉鈴蟲抗性。
權(quán)利要求
玉米Lc基因在培育抗棉鈴蟲植物上的應(yīng)用,其中所述的玉米Lc基因編碼由SEQ ID No2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于所述的玉米Lc基因由SEQIDNo :1所示的 核苷酸序列組成;或者由與SEQ ID No :1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性并編碼相 同功能蛋白的核苷酸序列組成。
3.按照權(quán)利要求1或者2所述的應(yīng)用,其特征在于所述的植物是棉花。
4.含有權(quán)利要求2中所述的外源玉米Lc基因的植物、植物組織或植物細胞。
5.含有權(quán)利要求2中所述的外源玉米Lc基因的棉花、棉花組織或棉花細胞。
6.利用玉米Lc基因培育抗棉鈴蟲植物的方法,其特征在于包括如下步驟(1)將外源的玉米Lc基因轉(zhuǎn)入植物細胞或組織,獲得含有外源玉米Lc基因的植物細胞 或組織;(2)將含有外源玉米Lc基因的植物細胞或組織,再生成植物植株,即得抗棉鈴蟲的植物。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于所述的植物是指棉花。
8.按照權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于其步驟(1)中,將外源的玉米Lc基因轉(zhuǎn)入 棉花細胞或組織。
9.按照權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于其步驟(1)中,用攜帶玉米Lc基因表達載 體的農(nóng)桿菌感染棉花下胚軸。
10.利用轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花培育棉花品種的方法,其特征在于以權(quán)利要求6所得的轉(zhuǎn) 玉米Lc基因棉花為親本之一,利用回交或者雜交的方法,可培育出抗棉鈴蟲的棉花品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了玉米Lc基因在培育抗棉鈴蟲植物上的應(yīng)用以及培育抗棉鈴蟲植物的方法,尤其適于在棉花植物上的應(yīng)用。本發(fā)明轉(zhuǎn)玉米Lc基因棉花植株對棉鈴蟲的抗性強,為抗棉鈴蟲育種提供了一種新的途徑;其次,和使用殺蟲劑相比,本發(fā)明方法成本低,且不會造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染。
文檔編號C12N15/29GK101864429SQ20101017344
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者劉潔, 唐祚舜, 楊維才, 范小平 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所