專利名稱：可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷檢測核心試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因診斷檢測試劑，尤其是一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷檢測核心試劑，屬于基因診斷檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是由美國 PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對較簡單。PCR由變性一退火一延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至94°C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C 左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸DNA模板一引物結(jié)合物在耐熱DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2 4分鐘，2 3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍?；镜腜CR須具備以下條件1.要被復(fù)制的DNA模板(Template)2.界定復(fù)制范圍兩端的引物(Primers).3.耐熱 DNA 聚合酶(Taq. Polymearse, pfu DNA Polymearse, taq plus DNApolymerase, fast taq DNA polymerase,^ )4.合成的原料及水。PCR的反應(yīng)包括三個(gè)主要步驟，分別是1). Denaturation2). Annealing of primers, and3). Extension of primers。
所謂Denaturing乃是將DNA加熱變性，將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板.而Annealing則是令!timers于一定的溫度下附著于模板DNA兩端。最后在 DNA聚合酶(e. g. Taq-polymerase)的作用下進(jìn)行引物的延長(Extension of primers)及另一股的合成。熒光定量PCR實(shí)時(shí)焚光定量 PCR 技術(shù)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 簡稱RealTime PCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)于1996年由美國Applied biosystems公司推出，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法。如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR即(Real-time RT-PCR)是實(shí)時(shí)PCR法，它是指對DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)入 (RT-PCR)的RNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并實(shí)時(shí)監(jiān)測DNA的放大過程，在擴(kuò)增的指數(shù)增長期就測量擴(kuò)增產(chǎn)物，因?yàn)閿U(kuò)增指數(shù)增長期測量值與特異DNA(RNA)起始量存在相關(guān)性，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。RealTime PCR的基本目標(biāo)是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監(jiān)測CT值而實(shí)現(xiàn)對原始目標(biāo)基因的含量定量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法最大的優(yōu)點(diǎn)是克服了終點(diǎn)PCR法進(jìn)入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實(shí)現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)及臨床醫(yī)學(xué)研究方面有著重要的意義?；蛟\斷人類的絕大多數(shù)疾病都與基因有關(guān)，基因變異引起疾病兩種類型1)內(nèi)源基因變異由于先天遺傳和后天內(nèi)外環(huán)境因素的影響，人類的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)的各個(gè)環(huán)節(jié)都可發(fā)生異常，從而導(dǎo)致疾病。分基因結(jié)構(gòu)突變和表達(dá)異常。2)外源基因的入侵各種病原體感染人體后，其特異的基因被帶入人體并在體內(nèi)增殖引起各種疾病?；蚋淖円鸶鞣N表型改變，從而引起疾病，從基因水平探測分析病因和疾病的發(fā)病機(jī)制，并采用針對性的手段矯正疾病是近年基礎(chǔ)和臨床的方向。2.基因診斷利用現(xiàn)代生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。二、基因診斷的特點(diǎn)1.以基因做檢查材料和檢查目標(biāo)針對性強(qiáng)；2.分子雜交選用特定基因序列作探針，故特異性強(qiáng)；3.分子雜交和PCR具有放大效應(yīng)，故有較大的靈敏度；4.適用性強(qiáng)，診斷范圍廣。技術(shù)問題在基因診斷試劑盒中，主要采用Real time PCR和PCR方法，在這兩種方法中，由于其核心試劑(耐熱DNA聚合酶，dNTP，反應(yīng)buffer，引物，STOR染料，Taqman Probe等) 的局限性，導(dǎo)致一系列的問題。1、由于生物試劑的不穩(wěn)定性，需低溫運(yùn)輸，增加產(chǎn)品成本和能源浪費(fèi)。在現(xiàn)有的基因診斷試劑盒中，由于其核心所使用的耐熱DNA聚合酶，dNTP，引物等試劑在常溫下容易失活容易失活而失去擴(kuò)增能力，導(dǎo)致產(chǎn)品失去檢測能力。而且，所有產(chǎn)品必須進(jìn)行低溫運(yùn)輸和低溫儲存，造成了產(chǎn)品成本上升和能源浪費(fèi)。2、由于在診斷試劑中，大部分樣品來源于血液、體液、表皮、腹水等。所要檢測的基因含量并不是很豐富，其它離子和干擾物質(zhì)比較多；對于這樣的樣品，耐熱DNA聚合酶對樣品的純度耐受有限，使PCR實(shí)驗(yàn)不能夠被有效的擴(kuò)增。導(dǎo)致一些樣本的基因不能夠被檢測到，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，使基因診斷造成一定的誤判。3、在現(xiàn)有的診斷試劑中，都已經(jīng)將耐熱DNA聚合酶、Dntp、反應(yīng)緩沖液、引物(探針)進(jìn)行了預(yù)先的混合，以方便檢驗(yàn)人員使用。但在混合好的混合試劑中，由于耐熱DNA聚合酶能夠釋放部分的活性，并且在PCR試驗(yàn)的升溫過程中，耐熱DNA聚合酶也能夠釋放一定的活性；這就導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，也為基因診斷造成一定的誤判。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠在常溫運(yùn)輸?shù)幕驒z測混合型試劑，該試劑能夠節(jié)省檢測時(shí)間，提高檢測靈敏度和特異性，有效的降低檢測過程中出現(xiàn)的假陽性和假陰性。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)這種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑，包括反應(yīng)緩沖液、三磷酸脫氧核糖核酸(DNTP)、耐熱DNA聚合酶、甘油、牛血清蛋白(BSA)、二硫蘇糖醇(DTT)、吐溫-20，其特征在于所述的核心試劑中還摻入了適量的多糖和雙糖；并且所述試劑中的反應(yīng)緩沖液由 5mM-50mM 的 Tris-HCL、20mM-500mM 的 KCL、1. 0mM-5mM 的 MgCl2、20mM-200mM 的 (NH4)2SO4組成；同時(shí)摻入的三磷酸脫氧核糖核酸為50uM-300uM、耐熱DNA聚合酶為0.01U/ ul-0. 2U/ul、多糖為lmM-15mM雙糖為2M-100M、甘油為3% -30%、牛血清蛋白為10_300ug/ ml、二硫蘇糖醇為 0. 5-10mM、吐溫-20 為 0. 005-0. 05v/v。所述的多糖為環(huán)糊精的一種或者是環(huán)糊精的衍生物，其采用的優(yōu)選濃度為 ImM-15mM。所述的雙糖為海藻糖，其采用的優(yōu)選濃度為2M-10M。
所述反應(yīng)緩沖液中使用的Tris-HCL緩沖液的濃度50mM ；KCl 濃度應(yīng)低于 50mmol/L ；MgCL2的游離鎂離子濃度為2. 5_3mM。所述三磷酸脫氧核糖核酸采用的優(yōu)選濃度為200uM。所述耐熱DNA聚合酶采用的優(yōu)選濃度為0. OlU/ul-O. 2U/ul。所述甘油采用的優(yōu)選濃度為6 %。所述牛血清蛋白采用的優(yōu)選濃度為20Ug-60Ug/ml。所述二硫蘇糖醇采用的優(yōu)選濃度為3. 6-7. 2mM。所述吐溫-20采用的優(yōu)選濃度為0. 005-0. 05v/vo核心試劑配方案例
權(quán)利要求
1.一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑，包括反應(yīng)緩沖液、三磷酸脫氧核糖核酸(DNTP)、耐熱DNA聚合酶、甘油、牛血清蛋白(BSA)、二硫蘇糖醇(DTT)Ji 溫-20，其特征在于所述的核心試劑中還摻入了適量的多糖和雙糖；并且所述試劑中的反應(yīng)緩沖液由 5mM-50mM 的 Tris-HCL、20mM-500mM 的 KCL、1. 0mM-5mM 的 MgCl2、20mM-200mM 的 (NH4)2SO4組成；同時(shí)摻入的三磷酸脫氧核糖核酸為50uM-300uM、耐熱DNA聚合酶為0. OlU/ ul-0. 2U/ul、多糖為lmM-15mM雙糖為2M-100M、甘油為3% -30%、牛血清蛋白為10_300ug/ ml、二硫蘇糖醇為 0. 5-10mM、吐溫-20 為 0. 005-0. 05v/v。
2.如權(quán)利要求1所述的一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑， 其特征在于所述的多糖為環(huán)糊精的一種或者是環(huán)糊精的衍生物，其采用的優(yōu)選濃度為 lmM-15mM。
3.如權(quán)利要求1所述的一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑，其特征在于所述的雙糖為海藻糖，其采用的優(yōu)選濃度為2M-10M。
4.如權(quán)利要求1所述的一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑， 其特征在于所述反應(yīng)緩沖液中使用的Tris-HCL緩沖液的濃度為50mM ；KCl濃度應(yīng)低于 50mmol/L ；MgCL2的游離鎂離子濃度為2. 5_3mM。
5.如權(quán)利要求1所述的一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑，其特征在于所述三磷酸脫氧核糖核酸采用的優(yōu)選濃度為200uM。
6.如權(quán)利要求1所述的一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑，其特征在于所述耐熱DNA聚合酶采用的優(yōu)選濃度為2. 5-3mM。
7.如權(quán)利要求1所述的一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑，其特征在于所述甘油采用的優(yōu)選濃度為6%。
8.如權(quán)利要求1所述的一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑，其特征在于所述牛血清蛋白采用的優(yōu)選濃度為20Ug-60Ug/ml。
9.如權(quán)利要求1所述的一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑，其特征在于所述二硫蘇糖醇采用的優(yōu)選濃度為3. 6-7. 2mM。
10.如權(quán)利要求1所述的一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑， 其特征在于所述吐溫-20采用的優(yōu)選濃度為0. 005-0. 025v/v
全文摘要
一種可常溫運(yùn)輸?shù)母哽`敏高特異性的基因診斷側(cè)核心試劑，包括反應(yīng)緩沖液、三磷酸脫氧核糖核酸(DNTP)、耐熱DNA聚合酶、甘油、牛血清蛋白(BSA)、二硫蘇糖醇(DTT)、吐溫-20，其特征在于所述的核心試劑中還摻入了適量的多糖和雙糖；并且所述試劑中的反應(yīng)緩沖液由5mM-50mM的Tris-HCL、20mM-500mM的KCL、1.0mM-5mM的MgCl2、20mM-200mM的(NH4)2SO4組成；同時(shí)摻入的三磷酸脫氧核糖核酸為50uM-300uM、耐熱DNA聚合酶為0.01U/ul-0.2U/ul、多糖為1mM-15mM雙糖為2M-100M、甘油為3％-30％、牛血清蛋白為10-300ug/ml、二硫蘇糖醇為0.5-10mM、吐溫-20為0.005-0.05v/v。
文檔編號C12Q1/68GK102242188SQ20101017417
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者黨希龍, 安小濤 申請人:上海星漢生物科技有限公司