專利名稱：有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥工程領(lǐng)域，特別是一種有利于重組人組織型纖溶酶原激酶衍 生物(rPA)大規(guī)模復(fù)性時(shí)提高復(fù)性率的高效混合裝置。
背景技術(shù)：
急性心肌梗塞是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，死亡率極高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有超過100 萬人被急性心肌梗塞奪去生命。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在中國急性心肌梗塞的發(fā)病率約為萬 分之五，心臟病高居我國居民疾病死因的第 二位。溶栓治療因具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、易操作 的特點(diǎn)，已經(jīng)成為急性心肌梗塞治療公認(rèn)的有效方法，在我國更是成為治療急性心肌梗塞 的主要手段。因此，研制和發(fā)展高效、安全、不良反應(yīng)小的溶血栓藥物，一直也是世界范圍的 研究熱點(diǎn)。溶栓藥物的經(jīng)過幾十年的發(fā)展，新型溶栓藥物的研發(fā)大大改進(jìn)了溶栓的開通率和 安全性。目前rPA因其具有溶栓作用強(qiáng)、起效迅速、維持時(shí)間長、再通率高、不良反應(yīng)小、 使用方便等特點(diǎn)已經(jīng)成為第三代溶栓藥物的代表之一。rPA是天然組織型纖溶酶原激酶 (tPA)的缺失突變體，只保留了 tPA絲氨酸蛋白酶區(qū)(與酶的活性有關(guān))和Kringle2區(qū)(與 纖維蛋白定向性質(zhì)有關(guān))。因不含糖基化位點(diǎn)，可以利用基因重組技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)生 產(chǎn)。rPA含有18個(gè)半胱氨酸，有9對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)基本全部以包涵體 形式存在。外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)形成的包涵體不可溶、無生物活性。要將無 生物活性的包涵體蛋白質(zhì)恢復(fù)成為有活性的目的蛋白，必須對(duì)其進(jìn)行體外復(fù)性。但常規(guī)復(fù) 性的活性回收率不高，一般僅為5% _10%，尤其是大規(guī)模工業(yè)化復(fù)性，復(fù)性率更低，這直接 制約了許多藥物蛋白成本的降低。稀釋復(fù)性法因操作簡單，對(duì)設(shè)備要求不高，目前仍是工業(yè)生產(chǎn)中最常用和有效的 蛋白質(zhì)折疊復(fù)性的方法。蛋白質(zhì)復(fù)性過程最大的副反應(yīng)就是聚集反應(yīng)，它是發(fā)生在兩個(gè)分 子或多個(gè)分子之間的一種反應(yīng)，因此變性蛋白質(zhì)在復(fù)性液中的最終濃度對(duì)聚集反應(yīng)的影響 非常明顯。所以在常規(guī)的稀釋復(fù)性中，為了減少聚集提高復(fù)性率，通常需要在很低的蛋白質(zhì) 濃度(10-50yg/ml)下進(jìn)行復(fù)性。由于蛋白質(zhì)濃度很低，復(fù)性過程處理的料液量極大，一般 復(fù)性緩沖液體積為變性蛋白溶液的20-100倍，不利于復(fù)性操作和工業(yè)化放大。因此，在復(fù) 性過程中，特別是在大規(guī)模工業(yè)化復(fù)性中，抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提高 復(fù)性收率的關(guān)鍵。抑制變性蛋白聚集的方法除了在復(fù)性液中添加適宜濃度的變性劑(如尿素和鹽 酸胍等)、穩(wěn)定劑(L-精氨酸或Tris)和表面活性劑外，還可以通過改進(jìn)稀釋復(fù)性時(shí)溶液的 高效、快速、溫和混勻的方式，使復(fù)性時(shí)的變性蛋白溶液快速、均勻、溫和地混合到大量的復(fù) 性緩沖液中。通過這種溶液分配方式的改善來減少變性蛋白的聚集，以提高目的蛋白的復(fù) 性率。目前已報(bào)道的大規(guī)模復(fù)性方法中，在復(fù)性罐中一般采用平葉漿，平葉漿產(chǎn)生的剪切力大，容易導(dǎo)致變性蛋白的聚集和復(fù)性蛋白的變性失活。另外，常規(guī)復(fù)性時(shí)變性蛋白溶液一般 只通過液面上一個(gè)點(diǎn)加入到大量的復(fù)性緩沖液中，導(dǎo)致局部未復(fù)性蛋白濃度瞬間過高，且又 脫離變性劑的防聚集保護(hù)，局部變化劇烈，變性蛋白大量聚集，導(dǎo)致最終復(fù)性率不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，以解決上述背景技 術(shù)中存在的技術(shù)問題，即采用平葉漿產(chǎn)生的剪切力大，容易導(dǎo)致變性蛋白的聚集和復(fù)性蛋 白的變性失活。另外，常規(guī)復(fù)性時(shí)變性蛋白溶液一般只通過液面上一個(gè)點(diǎn)加入到大量的復(fù) 性緩沖液中，導(dǎo)致局部未復(fù)性蛋白濃度瞬間過高，且又脫離變性劑的防聚集保護(hù)，局部變化 劇烈，變性蛋白大量聚集，導(dǎo)致最終復(fù)性率不高。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝 置，用以向復(fù)性緩沖液內(nèi)加入變性蛋白溶液，包括容器，內(nèi)裝所述復(fù)性緩沖液；進(jìn)液管，一端 為出液端，所述出液端設(shè)有多個(gè)噴嘴，另一端為進(jìn)液端，通以所述變性蛋白溶液；螺旋槳，插 入所述復(fù)性緩沖液的液面下方。其中，所述多個(gè)噴嘴均插入到所述復(fù)性緩沖液的液面下方。其中，所述進(jìn)液管的出液端具有一個(gè)出液管，所述出液管上設(shè)有所述多個(gè)噴嘴。其中，所述多個(gè)噴嘴的高度不同。其中，所述進(jìn)液管的出液端具有多個(gè)出液管，每一所述出液管上均設(shè)有所述多個(gè) 噴嘴。其中，每一所述出液管上均設(shè)有多個(gè)不同高度的噴嘴。其中，所述螺旋槳為單層或多層螺旋槳。其中，所述螺旋槳為1-3層。本發(fā)明的rPA包涵體大規(guī)模復(fù)性時(shí)所使用的變性蛋白加入混合裝置，可有效抑制 rPA包涵體在復(fù)性時(shí)的聚集反應(yīng)，顯著提高目的蛋白的復(fù)性率。與常規(guī)報(bào)道的攪拌和變性蛋 白加入方式比較，復(fù)性率極大提高。另外該高效混合方式易于操作，十分利于rPA包涵體的 大規(guī)模工業(yè)化復(fù)性，對(duì)于基因工程重組蛋白藥物的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。


圖1為本發(fā)明第一實(shí)施例的示意圖；圖2為本發(fā)明第二實(shí)施例的示意圖；圖3為本發(fā)明第三實(shí)施例的示意圖。附圖標(biāo)記說明1-容器；2-進(jìn)液管；3-螺旋槳。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的形狀、構(gòu)造以及特點(diǎn)能夠更好地被理解，以下將列舉較佳實(shí)施例 并結(jié)合附圖進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明的有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，于復(fù)性罐等類似的容器1 內(nèi)裝有復(fù)性緩沖液，通過進(jìn)液管2向復(fù)性緩沖液內(nèi)加入變性蛋白溶液。進(jìn)液管2的一端為出液端，其出液端具有一個(gè)出液管，出液管上設(shè)有多個(gè)不同高度的噴嘴，所述多個(gè)噴嘴均插 入到復(fù)性緩沖液的液面以下，進(jìn)液管2的另一端為進(jìn)液端，進(jìn)液端通以變性蛋白溶液，變性 蛋白溶液通過多個(gè)噴嘴直接均勻的加入到復(fù)性緩沖液液面以下。進(jìn)液管2的出液端也可分為多個(gè)出液管，每一出液管上均設(shè)有多個(gè)不同高度的噴 嘴，所述多個(gè)噴嘴均插入到復(fù)性緩沖液的液面以下。從一個(gè)進(jìn)液端進(jìn)入的變性蛋白溶液從 多個(gè)出液管流入復(fù)性緩沖液中，配合多層螺旋槳3，以滿足復(fù)性緩沖液量較多時(shí)的需要，使 得變性蛋白溶液能夠快速均勻的加入。容器1內(nèi)的液面下裝設(shè)有螺旋槳3，該螺旋槳3可以為單層或多層，優(yōu)選的，該螺旋 槳3為1-3層。變性蛋白溶液進(jìn)液時(shí)，通過該螺旋槳3的攪拌作用，避免局部瞬間濃度過高 而產(chǎn)生聚集沉淀。且螺旋槳的剪切力較平葉槳小，可以避免變性蛋白的聚集和復(fù)性蛋白的 變性失活。實(shí)施例1100L規(guī)模的高效混合復(fù)性裝置圖1為本發(fā)明第一實(shí)施例的示意圖，如圖所示，本實(shí)施例中
1.螺旋槳采用單層螺旋槳，減小剪切力。2.變性蛋白加入復(fù)性液中的進(jìn)液管其出液端采用單管多噴嘴設(shè)計(jì)，且噴嘴全部 在液面以下，保證變性蛋白快速均勻加入到復(fù)性液中，避免局部瞬間濃度過高而產(chǎn)生聚集 沉淀。實(shí)施效果和常規(guī)復(fù)性裝置相比，本裝置實(shí)現(xiàn)復(fù)性率提高25%以上。實(shí)施例2300L規(guī)模的高效混合復(fù)性裝置圖2為本發(fā)明第二實(shí)施例的示意圖，如圖所示，本實(shí)施例中1.螺旋槳采用雙層螺旋槳，減小剪切力。2.變性蛋白加入復(fù)性液中的進(jìn)液管出液端采用雙管多噴嘴設(shè)計(jì)，且噴嘴全部在 液面以下，保證變性蛋白快速均勻加入到復(fù)性液中，避免局部瞬間濃度過高而產(chǎn)生聚集沉 淀。實(shí)施效果和常規(guī)復(fù)性裝置相比，本裝置實(shí)現(xiàn)復(fù)性率提高22%以上。實(shí)施例3500L規(guī)模的高效混合復(fù)性裝置該高效混合復(fù)性裝置見附圖3，關(guān)鍵結(jié)構(gòu)說明如下1.螺旋槳采用三層螺旋槳，減小剪切力。2.變性蛋白加入復(fù)性液中的進(jìn)液管出液端采用三管多噴嘴設(shè)計(jì)，且噴嘴全部在 液面以下，保證變性蛋白快速均勻加入到復(fù)性液中，避免局部瞬間濃度過高而產(chǎn)生聚集沉 淀。實(shí)施效果和常規(guī)復(fù)性裝置相比，本裝置實(shí)現(xiàn)復(fù)性率提高20%以上。本發(fā)明的rPA包涵體大規(guī)模復(fù)性時(shí)所使用的變性蛋白加入混合裝置，可有效抑制 rPA包涵體在復(fù)性時(shí)的聚集反應(yīng)，顯著提高目的蛋白的復(fù)性率。與常規(guī)報(bào)道的攪拌和變性蛋 白加入方式比較，復(fù)性率極大提高。另外該高效混合方式易于操作，十分利于rPA包涵體的 大規(guī)模工業(yè)化復(fù)性，對(duì)于基因工程重組蛋白藥物的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。以上對(duì)本發(fā)明的描述是說明性的，而非限制性的，本專業(yè)技術(shù)人員理解，在權(quán)利要 求限定的精神與范圍之內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多修改、變化或等效，但是它們都將落入本發(fā)明的 保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，用以向復(fù)性緩沖液內(nèi)加入變性蛋白溶液，其特征在于，包括容器，內(nèi)裝所述復(fù)性緩沖液；進(jìn)液管，一端為出液端，所述出液端設(shè)有多個(gè)噴嘴，另一端為進(jìn)液端，通以所述變性蛋白溶液；螺旋槳，插入所述復(fù)性緩沖液的液面下方。
2.如權(quán)利要求1所述的有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，其特征在于，所述 多個(gè)噴嘴均插入到所述復(fù)性緩沖液的液面下方。
3.如權(quán)利要求2所述的有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，其特征在于，所述 進(jìn)液管的出液端具有一個(gè)出液管，所述出液管上設(shè)有所述多個(gè)噴嘴。
4.如權(quán)利要求3所述的有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，其特征在于，所述 多個(gè)噴嘴的高度不同。
5.如權(quán)利要求2所述的有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，其特征在于，所述 進(jìn)液管的出液端具有多個(gè)出液管，每一所述出液管上均設(shè)有所述多個(gè)噴嘴。
6.如權(quán)利要求5所述的有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，其特征在于，每一 所述出液管上均設(shè)有多個(gè)不同高度的噴嘴。
7.如權(quán)利要求3或5所述的有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，其特征在于， 所述螺旋槳為單層或多層螺旋槳。
8.如權(quán)利要求7所述的有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，其特征在于，所述 螺旋槳為1-3層。
全文摘要
一種有利于rPA大規(guī)模復(fù)性的高效混合復(fù)性裝置，用以向復(fù)性緩沖液內(nèi)加入變性蛋白溶液，包括容器，內(nèi)裝所述復(fù)性緩沖液；進(jìn)液管，一端為出液端，所述出液端設(shè)有多個(gè)噴嘴，另一端為進(jìn)液端，通以所述變性蛋白溶液；螺旋槳，插入所述復(fù)性緩沖液的液面下方。由此，本發(fā)明可有效抑制rPA包涵體在復(fù)性時(shí)的聚集反應(yīng)，顯著提高目的蛋白的復(fù)性率。
文檔編號(hào)C12M1/02GK101831379SQ201010174260
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者周祥山, 尤金花, 張?jiān)d, 秦玉峰 申請(qǐng)人:山東東阿阿膠股份有限公司;華東理工大學(xué)