專利名稱：一種人腸病毒71型特異性多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學免疫領域，涉及一種人腸病毒71型特異性多肽及其應用。
背景技術：
手足口病的主要病原體有腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)、柯沙奇病毒 A16 (Coxsackieviruses A16, CAV16)等，但是引起神經性癥狀和死亡的主要是EV71。EV71 是1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標本中分離出來的。自 1974年首次報道以來，在1975，1978，1997和1998年分別在保加利亞，匈牙利，馬來西亞和 臺灣等國家和地區(qū)引起了不同程度的爆發(fā)，涉及數(shù)十人死亡。值得一提的是，發(fā)達國家包括 日本、美國等國家盡管偶爾也有零星的病例，但幾十年來卻沒有大規(guī)模流行和爆發(fā)的報道。 2008年3月，我國安徽省阜陽地區(qū)開始爆發(fā)手足口病疫情，導致23人死亡，3000多人感染。 之后，在北京、上海、浙江、廣東等地區(qū)也相繼有EV71感染的報道。到2008年底，中國手足 口病感染人數(shù)累計達48. 9萬多，死亡人數(shù)達126人。2009年繼河南省明泉縣報道手足口病 感染并有近十例病人死亡后，相繼在山東、北京、四川、廣西、云南、甘肅、貴州等多個省市流 行，患病人數(shù)和死亡人數(shù)超過了 2008年(將近兩倍)。從近幾年的情況看，我國每隔幾年就 有局部爆發(fā)，患者人數(shù)多，分布廣，大部分還在不發(fā)達地區(qū)，給國家和人民帶來了巨大損失， 同時也影響著國家的經濟和社會安全。手足口病等流行性疾病成了民眾關注的焦點，有效 的控制疫情對國家和社會都有著重要的意義。正因如此，衛(wèi)生部從去年開始已經將其列入 法定丙級傳染病，以更好的監(jiān)控疫情，為防控和治療提供必要的資料和信息。EV71是屬于微小病毒科(picornaviridae)中的腸病毒群(enterovirus)。微小 病毒科的病毒包括很多引起人和動物疾病的病毒如口蹄疫病毒、腸道病毒以及引起肝炎的 甲型肝炎病毒(HAV)。其中腸病毒屬的病毒包括脊髓灰質炎病毒(Polioviruses ；具有3種 型別)、柯沙奇病毒(A型23種型別、B型6種型別)、?？刹《?Echoviruses ；具有31種型 別)及腸病毒(Enteroviruses 68 72型)。脊髓灰質炎病毒同EV71病毒是同一病毒屬； 據(jù)發(fā)明人的分析，二者的全序列蛋白組的相似性可達70%左右，它們之間極有可能存在交 叉免疫反應。而目前全世界很多國家包括我國都實行全民接種脊髓灰質炎病毒疫苗，這樣 用傳統(tǒng)全病毒檢測抗體的方法檢測人腸病毒71型的檢測可能會出假陽性。因此篩選一種 可以有效區(qū)分人腸病毒71型感染的多肽可以方便快速準確的檢測人腸病毒71型的感染。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種可以有效區(qū)分人腸病毒71 型感染的多肽；本發(fā)明的另一目的是提供該多肽在制備預防或者治療EV71感染的藥物組 合物中的應用。本發(fā)明的又一目的是提供編碼該多肽的核苷酸序列。本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)一種人腸病毒71型特異性多肽，選自下述(a) ⑴中的任一種(a)氨基酸序列為SEQ ID NO. 1的多肽1 ；
(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加1-10個氨基酸殘基而形成的 具有引發(fā)EV71免疫應答功能的由多肽1衍生的多肽；(c)多肽1中至少15個連續(xù)氨基酸殘基構成的具有引發(fā)EV71免疫應答功能的多 肽片段；(d)在(C)中的多肽片段經過取代、缺失或者添加1-3個氨基酸殘基而形成的具有 引發(fā)EV71免疫應答功能的多肽；(e) 一種以上(C)及(d)所述多肽片段以任意先后次序和重復次數(shù)組合而成的具 有引發(fā)EV71免疫應答功能的多肽；(f)氨基酸序列為SEQ ID NO. 7的多肽7與(e)所述多肽或(a)所述的多肽1組 合得到的具有引發(fā)EV71免疫應答功能的多肽；其中多肽7的序列可以在(e)中任一多肽片 段或多肽1之前或者之后，并且中間間隔0-3個任意氨基酸殘基。其中，(c)中所述的多肽片段優(yōu)選多肽2 =SEQ ID NO. 2，多肽3 =SEQ ID NO. 3，多肽 4 =SEQ ID NO. 4，多肽 5 :SEQ ID N05 ；多肽 6 :SEQ ID NO. 6。(e)所述的多肽優(yōu)選自多肽2、3、4、5或6中的任意2種、3種、4種或者5種多肽按 照任意先后次序組合得到的氨基酸序列。所述的取代是指用性質相似或者相近的氨基酸進行替換，優(yōu)選根據(jù)表1進行。表1.優(yōu)選的氨基酸取代 在已知氨基酸序列或核苷酸序列的情況下，可通過本領域的常規(guī)蛋白質化學合成 方法或通過基因工程方法獲得本發(fā)明多肽。與權利要求1所述的多肽特異性結合的抗體。其中，所述的抗體可以是完整的單克隆抗體、完整的多克隆抗體、抗血清或者具有 免疫活性的抗體片段、抗體重鏈、抗體輕鏈、嵌合抗體或人源化抗體。所述的抗體可以特異 性的與本發(fā)明所述的多肽結合。所述的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的 本發(fā)明多肽，可被施用于動物以誘導多克隆抗體產生；或者通過本領域眾所周知的雜交瘤 技術制備單克隆抗體；或者通過重組方法將所屬抗體的可變區(qū)與人抗體的不可邊區(qū)或恒定 區(qū)結合而制備嵌合抗體。本發(fā)明所述的多肽在制備檢測人腸病毒71型的檢測試劑中的應用。一種檢測人腸病毒71型的檢測試劑，該檢測試劑包括容器以及位于容器內的本 發(fā)明多肽，對應的抗血清以及其它必要化學物質。該檢測試劑可用于檢測標本血清是否被 EV71感染過。本發(fā)明所述的多肽在制備預防或者治療EV71感染的藥物組合物中的應用。所述的藥物組合物優(yōu)選疫苗組合物。所述的疫苗組合物含有免疫有效量的本發(fā)明所述多肽以及藥學上可接受的載體。本發(fā)明的疫苗組合物優(yōu)選包含本發(fā)明所述多肽，如SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 6 中的至少一種多肽和藥學上可接受的載體，進一步優(yōu)選序列為SEQ ID NO. 1的多肽1和藥 學上可接受的載體。這些載體包括本身不誘導產生對該組合物的個體有害的抗體的任何載 體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、 脂質凝集物以及無活性的病毒顆粒以及增強組合物效果的佐劑。這些載體是本領域普通技 術人員所熟知的。另外，抗原或免疫原可以和細菌類毒素偶聯(lián)。其中，所述的增強組合物效果的佐劑包括但并不局限于1鋁鹽，如氫氧化鋁、磷 酸鋁、硫酸鋁等；2水包油性乳劑配方，如MF69 (Novartis Vaccines and Diagnostics)、 Syntex adjuvant formulation (SAF)、Freund 完全佐劑和不完全佐劑等等。所述的藥物組合物通常還包括稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等，以及輔助性物 質，如潤滑劑或者乳化劑、PH緩沖物質等。所述的免疫有效量指以單劑或者連續(xù)劑一部分給予個體的量對治療或者預防是 有效的。該用量根據(jù)所治療的個體健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別、個體免疫系統(tǒng) 合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對治療狀況的評估及其它相關因 素而定。所述的疫苗組合物可制成注射劑，如液體溶液或混懸液；還可制成在注射前適合 配入溶液或者混懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或者包封在脂質體中，與上 述藥學上可接受的載體結合增強佐劑效果。
所述藥物組合物的常規(guī)給藥方法是從腸胃外(皮下或肌肉)途徑通過注射給予免 疫原性組合物。適合其它給藥方式的其他配方包括口服等。劑量可以是單劑方案或多劑方 案。疫苗可以結合其它免疫調節(jié)劑一起給予。以本發(fā)明多肽計，其用量為每天約lOOng/Kg 體重-10mg/Kg體重。此外本發(fā)明多肽還可與佐劑或其它治療劑一起使用。本發(fā)明的抗體可用于制備治療或預防人腸病毒71型感染的藥物組合物。所述的 組合物包含有a安全有效劑量的本發(fā)明多肽、偶聯(lián)物或其組合物；以及b藥學上可以接受的 載體或賦形劑。這里載體包括但不限于鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑及其組 合。該組合物通過常規(guī)方法進行制備。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的多肽可以特異的與腸病毒71型患者血清產生反應，同時不會對脊 髓灰質炎病毒產生交叉反應。因此可以用于臨床檢測、診斷人腸病毒71型的感染。由本發(fā) 明多肽所制備的試劑盒能特異性的檢測出人腸病毒71型，而不會檢測到其它類似病毒如 脊髓灰質炎病毒。由于該多肽制備的抗體可以有效與人腸病毒71型作用，本發(fā)明的多肽還 可用于疫苗的制備，所制備的疫苗能只針對人腸病毒71型產生良好的免疫應答。由本發(fā)明 多肽制備的藥物組合物能夠有效刺激機體產生專門針對EV71病毒的免疫應答，很好地保 護細胞不被EV71病毒感染。編碼本發(fā)明所述多肽的核苷酸序列，可應用于制備單抗或核酸 疫苗等，在診斷和治療人腸病毒71型感染中發(fā)揮積極的作用。


圖1本發(fā)明多肽的SDS-聚丙烯酰胺電泳圖。圖2多肽1抗體的ELISA檢測結果。圖3抗多肽1的血清對EV71感染的保護作用；A 細胞對照，加入1 4陰性對照血清，無病毒；B 加入1 4陰性對照血清和1 百萬TCID EV71病毒；C:1 4倍稀釋的抗本發(fā)明多肽1的血清和1百萬TCID EV71病毒； D :1 8倍稀釋的抗本發(fā)明多肽1的血清和1百萬TCID EV71病毒；E :1 16倍稀釋的抗 本發(fā)明多肽1的血清和1百萬TCID EV71病。
具體實施例方式實施例1a多肽的合成合成SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 6的多肽使用的方法為常規(guī)的化學合成方法。b多肽的篩選按照每個孔10 μ g的上述多肽的量溶于100 μ 1包被溶液(每升含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3)中并包被酶標板，包被12小時，棄去包被液，用去離子水洗滌2兩次，每次洗 滌均在吸水紙上拍干；每孔加入250 μ 1封阻液(PBS，0· 05% Tween-20，5%，脫脂奶粉)室 溫放置2小時；棄去封阻液，加入用100 μ 1封阻液1 50稀釋的血清，所用血清分別為免疫 有EV71 VPl蛋白的鼠抗血清、免疫有PV VPl蛋白的鼠抗血清和未免疫的對照血清；室溫放 置1小時；棄去液體；用去離子水洗滌5次；加入100 μ 1封阻液1 5000稀釋的生物素標 記的抗鼠IgG抗體的二抗，室溫放置半個小時；棄去液體，加入100 μ 1封阻液1 5000稀釋的AP-標記的str印tavidin，室溫放置半個小時；洗滌5次，加入50 μ 1顯色液(ρΗ9. 8， 9. 7%二乙醇氨lmg/mL pNPP) ； 15分鐘后用分光光度計測定405nm處的OD值；與對照相比， OD值低于5倍為陰性；高于5倍為陽性；檢測結果如表2所示，結果表明本發(fā)明多肽可以特 異性的和抗EV71VP1抗血清反應而不與抗PVVPl抗血清反應。表2多肽的篩選 實施例2多肽的基因工程表達。SEQ ID NO. 8為編碼本發(fā)明多肽1的核苷酸序列，以該序列合成目的基因，并在兩 端分別引入BamHI和HindIII的酶切位點。該基因被插入到載體pQE_80L(凱杰生物技術 (上海)有限公司)的BamHI和HindIII位點中。載體pQE_80L中含有編碼SEQ ID NO. 7 所述多肽的基因序列。將該能準確表達SEQ ID NOl和SEQ ID N07融合蛋白的重組載體轉 化到大腸桿菌BL21(DE3)中，得到的基因工程菌株可用于表達本發(fā)明多肽。表達的條件如下挑選單克隆接種于IOmL的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過夜。將 該菌液接種于自誘導培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)8-36小時。收獲菌體。菌體超聲破碎后，用M-NTA樹脂按照常規(guī)方法進行親和層析。洗脫后即可得到本 發(fā)明多肽。本發(fā)明多肽經12%濃度SDS-聚丙烯酰胺電泳分離，并采用考馬斯亮藍-G-250 染色，得本發(fā)明多肽的SDS-聚丙烯酰胺電泳圖譜(如圖1)。實施例3將多肽1按照每個孔10 μ g的量溶于100 μ 1包被溶液(每升含1. 59g Na2CO3, 2. 93gNaHC03)中包被酶標板，包被12小時，棄去包被液，用去離子水洗滌2兩次，每次洗滌 均在吸水紙上拍干；每孔加入250 μ 1封阻液(PBS，0. 05% Tween-20，5%，脫脂奶粉)室溫 放置2小時；棄去封阻液，加入用ΙΟΟμΙ封阻液1 50稀釋的血清，其中所用血清分別為 被檢出EV71感染的病人血清、普通健康人血清、孕婦的血清及對照血清(一已知的健康人 血清)；室溫放置1小時；棄去液體；用去離子水洗滌5次；加入100 μ 1封阻液1 5000稀 釋的生物素標記的抗人IgM抗體的二抗，室溫放置半個小時；棄去液體，加入100 μ 1封阻液 1 5000稀釋的AP-標記的str印tavidin，室溫放置半個小時；洗滌5次，加入50 μ 1顯色 液(ρΗ9. 8,9. 7%二乙醇氨lmg/mL pNPP) ；15分鐘后用分光光度計測定405nm處的OD值； 與對照相比，OD值低于5倍為陰性㈠；不低于5倍且不高于10倍為陽性⑴；高于10倍 為強陽性(++)。結果見表4。結果證明本發(fā)明多肽與病人血清反應時均顯陽性。而孕婦均 顯示為陰性。普通的健康人也均顯示為陰性；說明本發(fā)明多肽能夠特異性的檢測EV71。表3 多肽IELISA檢測結果
實施例4抗體的制備4. 1多肽1 (80 μ g/只小鼠)添加Freud完全佐劑(50 μ 1/只小鼠)，將混合物以 皮下注射的方法免疫小鼠(6-8周的Balb/c小鼠)。每隔兩周免疫一次，共免疫兩次，在最 后一次免疫14天后取血，分離血清，用于ELISA檢測。4. 2多肽1按照每個孔10 μ g的量溶于100 μ 1包被溶液(每升含1. 59g Na2CO3, 2. 93gNaHC03)中包被酶標板，包被12小時；棄去包被液，用去離子水洗滌2兩次，每次洗滌 均在吸水紙上拍干；每孔加入250 μ 1封阻液(PBS，0. 05% Tween-20，5%，脫脂奶粉)室溫 放置2小時；棄去封阻液，加入用100 μ 1封阻液1 50稀釋的血清，其中對照血清為未經 免疫的小鼠血清；室溫放置1小時；棄去液體；用去離子水洗滌5次；加入100 μ 1封阻液 1 5000稀釋的生物素標記的羊抗鼠IgG抗體的二抗，室溫放置半個小時；棄去液體，加入 100 μ 1封阻液1 5000稀釋的AP-標記的Str印tavidin，室溫放置半個小時；洗滌5次， 加入50 μ 1顯色液(ρΗ9. 8,9. 7%二乙醇氨lmg/mL pNPP) ；15分鐘后終止反應，用分光光度 計測定405nm處的OD值；結果見圖2。由圖2可見，該血清具有很好的免疫效價。實施例5基于本發(fā)明多肽1的疫苗組合物。5.1 80μ g 多肽 1 溶于 50μ 1PBS(0. 8 % NaCl，0. 02 % KC1，0. 144 % Na2HP04， 0. 024% KH2P04 ；pH7. 4)，加入50 μ 1氫氧化鋁佐劑，通過常規(guī)的混合法制備成一疫苗組合 物。
5. 2用5. 1中制備的疫苗組合物免疫6-8周的Balb/c小鼠，背部皮下注射，劑量 為100 μ 1，2周后再次注射同樣劑量的疫苗組合物，再過2周后處死小鼠，取小鼠血，分離血 清，用于中和試驗。按不同比例用無血清培養(yǎng)基稀釋5. 2中制備的血清后與1百萬個細胞培養(yǎng)感染劑 量(TCID)的EV71病毒液孵育60分鐘。將中和后的病毒液與RD細胞一起孵育72小時，觀 察其對RD細胞的保護作用，結果如圖3所示，其中圖3C，圖3D，圖3Ε與健康細胞對照圖3Α 相比沒有明顯差異，與病毒對照圖3Β相比病毒的數(shù)量和密度明顯偏低，說明圖3C，圖3D，圖 3Ε沒有明顯病變?？梢钥闯觯迷撘呙缃M合物免疫的小鼠，其抗血清含有的抗體可以較好地 中和1百萬TCID EV71病毒并保護RD細胞不被感染。本發(fā)明實施例中所用抗體購自Abcam公司；其它化學試劑購自國藥集團。本發(fā)明說明書中未詳細描述的實驗操作同現(xiàn)有技術。此外應理解，在閱讀了本范明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā) 明做各種改動或者修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
一種人腸病毒71型特異性多肽，選自下述(a)～(f)中的任一種(a)氨基酸序列為SEQ ID NO.1的多肽1；(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加1 10個氨基酸殘基而形成的具有引發(fā)EV71免疫應答功能的由多肽1衍生的多肽；(c)多肽1中至少15個連續(xù)氨基酸殘基構成的具有引發(fā)EV71免疫應答功能的多肽片段；(d)在(c)中的多肽片段經過取代、缺失或者添加1 3個氨基酸殘基而形成的具有引發(fā)EV71免疫應答功能的多肽；(e)一種以上(c)及(d)所述多肽片段以任意先后次序和重復次數(shù)組合而成的具有引發(fā)EV71免疫應答功能的多肽；(f)氨基酸序列為SEQ ID NO.7的多肽7與(e)所述多肽或(a)所述的多肽1組合得到的具有引發(fā)EV71免疫應答功能的多肽；其中多肽7的序列可以在(e)中任一多肽片段或多肽1之前或者之后，并且中間間隔0 3個任意氨基酸殘基。
2.根據(jù)權利要求1所述的多肽，其特征在于(c)中所述的多肽片段為多肽2:SEQ IDN0. 2，多肽 3 =SEQ ID NO. 3，多肽 4 :SEQ ID NO. 4，多肽 5 :SEQ ID N05 ；多肽 6 :SEQ IDNO. 6。
3.根據(jù)權利要求1所述的多肽，其特征在于(e)所述的多肽為選自多肽2、3、4、5或6 中的任意2種、3種、4種或者5種多肽按照任意先后次序組合得到的氨基酸序列。
4.與權利要求1所述的多肽特異性結合的抗體。
5.根據(jù)權利要求4所述的抗體，其特征在于所述的抗體是完整的單克隆抗體、完整的 多克隆抗體、抗血清或者具有免疫活性的抗體片段、抗體重鏈、抗體輕鏈、嵌合抗體或人源 化抗體，所述抗體可以特異性的與本發(fā)明所述的多肽結合。
6.權利要求4所述的抗體在制備預防或治療人腸病毒71型感染的藥物組合物中的應用。
7.權利要求1所述的多肽在制備檢測人腸病毒71型的檢測試劑中的應用。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于所述的檢測試劑包含容器以及位于容器內 的本發(fā)明多肽，對應的抗血清以及其它必要化學物質。
9.權利要求1所述的多肽在制備預防或者治療EV71感染的藥物組合物中的應用。
10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于所述的藥物組合物是指疫苗組合物。
11.根據(jù)權利要求9或10所述的應用，其特征在于所述的藥物組合物含有免疫有效量 的權利要求1所述多肽以及藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。
12.根據(jù)權利要求11所述的應用，其特征在于所述的載體包括具有增強組合物效果的 佐劑。
13.編碼權利要求1所述多肽的核苷酸序列。全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學免疫領域，公開了一種人腸病毒71型特異性多肽及其應用。本發(fā)明的人腸病毒71型特異性多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1中的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加1-10個氨基酸殘基而形成的具有引發(fā)針對EV71免疫應答的由多肽1衍生的多肽；或者SEQ ID NO.1中長度至少為15個連續(xù)氨基酸殘基，并具有引發(fā)EV71免疫應答功能的多肽片段。本發(fā)明提供的多肽可以特異性與腸病毒71型患者血清產生反應，同時不會對脊髓灰質炎病毒產生交叉反應。因此可以用于臨床檢測、診斷人腸病毒71型的感染。
文檔編號C12N15/41GK101891805SQ20101017440
公開日2010年11月24日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權日2010年5月18日
發(fā)明者冷啟彬, 吳洪流, 胡廣, 金明飛 申請人:北京凱悅寧科技有限公司