專利名稱：香蕉枯萎病菌1號(hào)和4號(hào)生理小種檢測(cè)引物和快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病害防治及植物病原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及香蕉枯萎病菌1號(hào) 和4號(hào)生理小種的檢測(cè)引物及快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病屬土傳性的維管束病害，發(fā)展迅速，防治困難，死亡率極高，由于該病 發(fā)病多在抽蕾期至掛果期，極容易造成大面積失收，被稱為“香蕉癌癥”。早在1890年香蕉 枯萎病已在巴拿馬發(fā)生，故后人稱其為巴拿馬病。之后，1904年美國(guó)夏威夷發(fā)生該病害， 1916年亞洲印度尼西亞發(fā)生該病害，1935年至1939年間，南美洲香蕉枯萎病大面積爆發(fā)， 致使4萬(wàn)公頃香蕉被毀，并隨著當(dāng)?shù)叵憬兜某隹趥鞑サ绞澜绺鞯?孫守恭，1996 ；Ploetz and Pegg, 1999) 0到1987年，全世界的香蕉產(chǎn)區(qū)除了巴布亞新幾內(nèi)亞、南太平洋島嶼和地 中海沿岸的國(guó)家外，幾乎都有香蕉枯萎病的發(fā)生(Stover and Simmonds，1987)。在我國(guó)大陸，1960年該病僅在我國(guó)廣西、廣東的部分地區(qū)發(fā)生(王璧生等，1997)， 以后的30多年來(lái)也只是為害粉蕉，未見(jiàn)為害香蕉。但是，1996年廣州番禺萬(wàn)頃沙鎮(zhèn)的香蕉 品種巴西蕉和廣東2號(hào)發(fā)生了枯萎病，之后鄰近的香蕉產(chǎn)區(qū)中山、珠海、東莞等地也相繼發(fā) 生了香蕉枯萎病，病園發(fā)病率為10% 40%，嚴(yán)重的達(dá)90%以上(戚佩坤，2000 ；林蘭穩(wěn) 等，2003)；通過(guò)種苗，該病現(xiàn)已傳播至海南、福建的香蕉產(chǎn)區(qū)(林時(shí)遲等，2000;蒲金基等，
2003)。目前，香蕉枯萎病的發(fā)生和不斷蔓延已對(duì)我國(guó)香蕉生產(chǎn)構(gòu)成了極大的威脅，已成為 香蕉生產(chǎn)中急需解決的問(wèn)題。香蕉枯萎病的病原菌[Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Ε. F. Smith) Snyder et Hansen]隸屬鐮孢菌屬、尖鐮孢古巴?；停且环N土壤習(xí)居真菌，至今還未發(fā)現(xiàn)有 性態(tài)(Snyder and Hansen，1940 ；布斯，1988)。根據(jù)該菌為害寄主的差異，可劃分為3 個(gè)生理小種，1號(hào)生理小種(FOCl)感染香蕉的栽培種“大蜜啥” [Grosmichel (AAA)]、龍 牙蕉(MusaAAB)和矮香蕉[Dwarf cavendish (AAA)]，該生理小種呈世界性分布，我國(guó)大 陸1996年之前所報(bào)道的香蕉枯萎病均是由該生理小種造成的；2號(hào)生理小種在中美洲、 洪都拉斯、薩爾瓦多、波多黎哥、多米尼加共和國(guó)和維爾京群島，感染三倍體雜種棱香蕉 [Bluggoe (AAB)]，不侵染“大蜜啥”(Stover and ffaite, 1960) ；4 號(hào)生理小種(F0C4)是 1967 年首先在我國(guó)臺(tái)灣報(bào)道的一個(gè)新生理小種，能感染“大蜜啥”、矮香蕉、野蕉(BB)和棱指蕉， 尤其能侵染較抗1號(hào)生理小種的所有Cavendish (AAA)品系，毀滅性最大(Persley and De Langhe, 1987)，在約10年的時(shí)間內(nèi)幾乎摧毀了臺(tái)灣的香蕉產(chǎn)業(yè)(Su et al.，1986 ；Hwang,
2004)。之后，4號(hào)生理小種又在澳大利亞、南非、加那利群島和菲律賓發(fā)現(xiàn)和報(bào)道(Ploetz etal.，1990)。鑒于香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種的危害性，2005年國(guó)家農(nóng)業(yè)部將其列為全國(guó) 植物檢疫對(duì)象。目前4號(hào)生理小種在我國(guó)大陸只是在局部香蕉產(chǎn)區(qū)發(fā)生為害，實(shí)施檢疫控制將是 防止其擴(kuò)散的關(guān)鍵。但香蕉枯萎病發(fā)病潛伏期長(zhǎng)且外表癥狀不明顯，導(dǎo)致了檢疫上的困難。
3
現(xiàn)有的對(duì)枯萎病菌生理小種的鑒定技術(shù)，多采用傳統(tǒng)的病原菌分離培養(yǎng)、致病性 鑒定、菌株在Komada改良培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)觀察等生物試驗(yàn)的方法，其需時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法 適應(yīng)生產(chǎn)實(shí)際需要。同時(shí)，香蕉生產(chǎn)中除了種植香芽蕉(AAA)外還種植粉蕉(ABB)，若是粉蕉感染枯萎 病，其病原或是4號(hào)生理小種、或是1號(hào)生理小種、或是兩個(gè)生理小種的復(fù)合，目前的檢測(cè)技 術(shù)大都是針對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種的檢測(cè)方法，例如申請(qǐng)?zhí)枮?00710032118. 2的專 利申請(qǐng)公開(kāi)的“一種香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種的快速檢測(cè)方法”?，F(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)存在兩 個(gè)顯著的缺陷(1)只能判斷和確定疑似香蕉枯萎病的植株(包括香芽蕉和粉蕉)是否為 4號(hào)生理小種致病，如果通過(guò)檢測(cè)確定并非4號(hào)生理小種，是否是1號(hào)生理小種所為就不得 而知；(2)沒(méi)有檢測(cè)DNA質(zhì)量的技術(shù)手段，不能避免出現(xiàn)假陰性的檢測(cè)結(jié)果。因此研究探索快速、準(zhǔn)確且全面檢測(cè)1號(hào)和4號(hào)生理小種的香蕉枯萎病菌檢測(cè)技 術(shù)，對(duì)于防止病害的傳播蔓延、及早采取防治對(duì)策，確保我國(guó)香蕉安全生產(chǎn)具有重要的理論 意義和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)我國(guó)現(xiàn)有的香蕉枯萎病病原，尖鐮孢古巴?；?號(hào)和 4號(hào)生理小種(F. oxysporum f. sp. cubense race 1，race4)，設(shè)計(jì)新的檢測(cè)引物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是建立一種檢測(cè)方法，利用上述檢測(cè)引物，以求在最短的時(shí) 間內(nèi)，應(yīng)用最簡(jiǎn)便的方法同時(shí)鑒定香蕉枯萎病病原菌是1號(hào)還是4號(hào)生理小種，還是兼而有 之。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)提供三對(duì)檢測(cè)引物，見(jiàn)表1所示表1香蕉枯萎病菌1號(hào)、4號(hào)生理小種及尖鐮孢特異性檢測(cè)引物序列 本發(fā)明同時(shí)提供了利用上述引物快速檢測(cè)香蕉枯萎病菌1號(hào)和/或4號(hào)生理小種 的方法，包括以下步驟1、抽提香蕉病組織總DNA ；2、以香蕉病組織抽提的總DNA為模板，以香蕉枯萎病菌1號(hào)、4號(hào)生理小種和尖鐮 孢內(nèi)參引物進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增；
3、將擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采集香蕉病組織時(shí)優(yōu)選采用香蕉球莖的病組織，采用CTAB法進(jìn)行抽提，具體包括 以下步驟(1)取香蕉球莖病組織2g，用滅菌剪刀將病組織剪碎，置于研缽中加液氮研磨 成細(xì)粉狀；迅速加入5 6mL 65°C預(yù)熱的抽提緩沖液[2% CTAB，0· lmol/L Tris-HCl (pH 8. 0), 1. 4mol/LNaCl,20mmol/L EDTA (pH 8. 0),1% β-巰基乙醇(用時(shí)加)]，溫和混勻；將 研磨液轉(zhuǎn)入15mL離心管中，于65°C下水浴lh，每IOmin搖動(dòng)一次；(2)加入5mL酚氯仿，劇烈振蕩充分混勻后，室溫下12，OOOg,離心15min ；(3)小心移取上清液于新的1.5mL離心管中(每管600 μ L)，加入等體積氯仿，短 暫振蕩充分混勻后，室溫下12，000g，離心IOmin ；(4)小心移取上清液于新的1.5mL離心管中(每管600 μ L)，加入1/10所取上 清液體積的3mol/L NaAc (pH 5.2)以及與所取上清液等體積的異丙醇，溫和混勻，室溫下 12，000g，離心 4min ；(5)盡棄上清液，以體積濃度為70%乙醇清洗兩次，室溫下風(fēng)干沉淀；(6)所有同一樣品的沉淀溶于600 μ L 65°C預(yù)熱的ddH20中，同時(shí)加入4 μ L RNase A (終濃度為20 μ g/mL)，混勻，37°C水浴lh，使RNA充分消解；(7)加入600 μ L氯仿，充分振蕩混勻，然后于室下12000g離心lOmin，吸取上清液 至一新的2mL離心管中，加入1/10所取上清液體積的3mol/LNaAc和2倍所取上清液體積 的預(yù)冷無(wú)水乙醇，輕輕混勻后將此混合液移至DNA結(jié)合柱(市售DNA抽提試劑盒提供)，然 后室溫下IOOOOg離心Imin ；(8)棄濾液，加700 μ L濃度為70 %的乙醇到DNA結(jié)合柱，室溫下IOOOOg離心lmin，
棄濾液并重復(fù)清洗DNA結(jié)合柱，棄濾液后室溫下IOOOOg離心空DNA結(jié)合柱lmin，以保證盡 棄乙醇；(9)將DNA結(jié)合柱裝在一個(gè)新的1.5mL離心管上，加100 μ L 65°C預(yù)熱的IXTE溶 液于柱子中心，室溫下放置2min，充分溶解DNA后，IOOOOg離心lmin，離心所得即為抽提的 DNA ；(10)取1 2 μ L抽提的DNA利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品的純度及濃度，以 OD260/OD280的比值為1. 8 2. 0時(shí)最佳，調(diào)整DNA的濃度為IOng/ μ L 50ng/ μ L為宜；然 后置于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明抽提DNA過(guò)程中用到的酚氯仿均為酚氯仿異戊醇體積比= 25 24 1的混合液，氯仿均為氯仿異戊醇體積比=24 1的混合液。步驟⑵所述三重PCR擴(kuò)增的體系如表2所示表2三重PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系(25 μ L)
5 本發(fā)明快速檢測(cè)方法即可應(yīng)用于香蕉病組織DNA的檢測(cè)，又可應(yīng)用于自病組織上 分離到真菌DNA的檢測(cè)，還可直接用于土壤中所存在的香蕉枯萎病菌生理小種的檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面一、本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物。它們是本發(fā)明人所在研究室(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶亞熱 帶真菌研究室)分離的大量香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種致病相關(guān)基因序列的基礎(chǔ)上分析設(shè) 計(jì)的，經(jīng)過(guò)組合驗(yàn)證從獲得的4號(hào)生理小種特異性引物、1號(hào)生理小種特異性引物、尖鐮孢 通用引物中篩選出的三對(duì)引物，每對(duì)引物的PCR產(chǎn)物其條帶大小和數(shù)量也不盡相同，因此 可直接鑒定病原菌到香蕉枯萎病菌的生理小種級(jí)別。二、本發(fā)明所建立的香蕉枯萎病菌三重PCR檢測(cè)方法，所述方法具有以下優(yōu)越性1.以香蕉病組織的DNA為模板，在一次PCR反應(yīng)中能夠同時(shí)檢測(cè)1號(hào)和4號(hào)生理 小種；2.同時(shí)引物組合中的尖鐮孢通用引物可作為內(nèi)參照同時(shí)檢測(cè)DNA的質(zhì)量，避免了 假陰性的出現(xiàn)；3.本發(fā)明檢測(cè)方法可用于自罹病香蕉組織分離真菌DNA的檢測(cè)，檢測(cè)的靈敏度達(dá) 到0. 2 μ g的新鮮菌絲即可檢出該病原菌的存在；4.本發(fā)明檢測(cè)體系還能夠檢測(cè)到土壤中的香蕉枯萎病菌，這對(duì)檢測(cè)蕉園土壤是否 受到香蕉枯萎病菌或其它尖鐮孢的污染具有重要意義。


圖1香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種特異性引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖2香蕉枯萎病菌1號(hào)生理小種特異性引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖3尖鐮孢通用弓丨物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖4三重PCR檢測(cè)體系對(duì)香蕉枯萎病菌及對(duì)照菌株DNA的擴(kuò)增電泳圖；圖5三重PCR檢測(cè)體系靈敏度檢測(cè)電泳圖；圖6三重PCR檢測(cè)體系對(duì)罹病香蕉組織DNA的擴(kuò)增電泳圖；圖7三重PCR檢測(cè)體系對(duì)分離得到的病原菌DNA的擴(kuò)增電泳圖；圖8三重PCR檢測(cè)體系對(duì)拌菌土壤DNA的擴(kuò)增電泳圖；圖9三重PCR檢測(cè)體系對(duì)拌菌土壤DNA靈敏度檢測(cè)電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施各例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1 香蕉枯萎病菌1號(hào)和4號(hào)生理小種特異性引物及尖鐮孢通用引物序列 的設(shè)計(jì)與篩選依據(jù)本研究室在克隆香蕉枯萎病菌4號(hào)和1號(hào)生理小種致病相關(guān)基因所獲得的特 異序列設(shè)計(jì)引物。其中，香蕉枯萎病菌1號(hào)生理小種特異DNA序列表如SEQ ID NO :1所示，香蕉枯萎 病菌4號(hào)生理小種特異DNA序列表如SEQ ID NO 4所示，尖鐮孢菌特異DNA序列如表SEQ ID N0:7所示。根據(jù)本發(fā)明提供的DNA序列信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以通過(guò)以下方法容 易地獲得等同的DNA序列(1)根據(jù)所述DNA序列信息設(shè)計(jì)引物，用PCR擴(kuò)增的方法從該病 原菌相應(yīng)的生理小種菌株的基因組DNA中獲??；(2)用化學(xué)合成的方法獲得。根據(jù)設(shè)計(jì)引物的規(guī)則設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的引物序列，保證其退火溫度在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定 的范圍內(nèi)(54°C 56°C )，以確保不同的檢測(cè)引物在同一個(gè)退火溫度下能夠發(fā)揮最佳的檢 測(cè)作用，并交由DNA引物合成公司合成。經(jīng)過(guò)常規(guī)的PCR反應(yīng)體系篩選，得到檢測(cè)香蕉枯萎 病菌1號(hào)、4號(hào)生理小種及尖鐮孢的特異性引物，分別如表SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :3、 表SEQ ID NO :5和表SEQ ID NO :6、表SEQ ID NO 8和表SEQ ID NO :9所示；再經(jīng)引物不 同量的篩選實(shí)驗(yàn)后總結(jié)得到適宜的PCR反應(yīng)體系，見(jiàn)表3所示。在該體系下經(jīng)過(guò)一次常規(guī) 的PCR反應(yīng)，即可鑒定香蕉枯萎病菌的生理小種。表3特異性引物PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系(25 μ L) 實(shí)施例2 香蕉枯萎病菌的分離、DNA的抽提及特異性引物篩選及鑒定
從我國(guó)不同的香蕉發(fā)病區(qū)采集香蕉枯萎病標(biāo)本，切取病株球莖病健交界處小塊組 織，采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離(方中達(dá)，1998)，于PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)、 25°C下黑暗培養(yǎng)2 3d，待長(zhǎng)出菌落后，挑菌落邊緣尖端菌絲純培養(yǎng)，產(chǎn)生分生孢子后進(jìn)行 單孢分離，并對(duì)單孢菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，保存有致病性的單孢菌株備用。菌株來(lái)源及編號(hào) 見(jiàn)表4。將保存的菌株在PDA平板上進(jìn)行活化，25°C下黑暗培養(yǎng)3 4d，挑取菌絲塊接種 到Y(jié)PD培養(yǎng)液(酵母粉蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)液，2%葡萄糖，酵母浸出粉，2%蛋白胨)中， 25°C、200rpm下振蕩培養(yǎng)3d。用布氏漏斗濾出菌絲，經(jīng)滅菌的水充分洗滌后真空冷凍干燥 收集菌絲備用。表4供試香蕉枯萎病菌1號(hào)和4號(hào)生理小種菌株編號(hào)、來(lái)源及小種類型 以改進(jìn)的SDS法抽提香蕉枯萎病菌的DNA，具體步驟如下(1)稱取100 200mg凍干菌絲放入預(yù)冷的研缽中，加液氮研磨至粉末狀，然后迅 速將其轉(zhuǎn)至1. 5mL離心管中并加入750 μ L 65°C預(yù)熱的DNA提取緩沖液[配方50mmol/L Tris-HCKpH 7. 2),50mmol/L EDTA,3% SDS,1% β-巰基乙醇(用時(shí)加)]，充分混勻，然后 置于65°C水浴鍋中水浴lh，每IOmin搖動(dòng)一次；(2)加入等體積(750 μ L)酚氯仿，短暫振蕩充分混勻，室溫下12000g離心15min ；(3)小心移取上清液于一新的1. 5mL離心管中(注意不要吸取分層交界處的細(xì)胞 碎片)，加入等體積氯仿，振蕩混勻后，室溫下12000g離心IOmin ；(4)小心移取上清液于一新的1.5mL離心管中，加入1/10所取上清液體積的 3mol/L NaAc和與上清液等體積的異丙醇，輕輕混勻后于4°C冰箱中放置30min，然后室溫 下 12000g 離心 IOmin ；(5)小心倒掉上清液并用預(yù)冷的70%乙醇洗沉淀兩次(輕輕翻轉(zhuǎn)離心管若干次)， 倒掉乙醇，然后用滅菌濾紙吸干管口液滴，風(fēng)干；
(6)加入300yL ddH20溶解DNA沉淀，同時(shí)加入2 4yL RNase A(終濃度為 20 μ g/mL)，混勻，37°C水浴lh，使RNA充分消解；(7)加入30(^1^酚氯仿，充分振蕩混勻，然后于室溫1200(^離心151^11，吸取上清 液至一新的1. 5mL離心管中，加入1/10所取上清液體積的3mol/L NaAc和與所取上清液等 體積的異丙醇，輕輕混勻后于4°C冰箱中放置30min，然后室溫下12000g離心IOmin ；(8)小心倒去上清液并用預(yù)冷的體積比濃度為70%乙醇洗滌沉淀兩次(輕輕翻轉(zhuǎn) 離心管)，風(fēng)干DNA沉淀；(9)加入100 μ L預(yù)熱至65°C的ddH20或TE溶解DNA，待完全溶解后，取1 2 μ L 利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品的純度及濃度，以O(shè)D26tZOD28tl的比值為1. 8 2. 0時(shí)為最 佳，調(diào)整DNA的濃度為IOng/μ L 50ng/μ L為宜，然后置于_20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｒ越?jīng)鑒定的香蕉枯萎病菌1號(hào)和4號(hào)生理小種及對(duì)照菌株共20個(gè)菌株的基因組 DNA為模板，分別以對(duì)1號(hào)、4號(hào)生理小種及尖鐮孢特異性的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增體系參 照表3，并設(shè)清水對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果如附圖1 3所示， 在附圖1、附圖2和附圖3中M為DL2000 ；1 6為F0C4 ；7 11為FOCl ；12為清水對(duì)照； 13為苦瓜枯萎病菌；14為節(jié)瓜枯萎病菌；15為冬瓜枯萎??；16為棉花枯萎病菌；17為茄子 枯萎病菌；18為番茄枯萎病菌；19為黃瓜枯萎病菌；20為半裸鐮孢；21為立枯絲核菌；22 為陽(yáng)性對(duì)照，其中附圖1為XJZ2、附圖2為FJZ3、附圖3為XJZ2 ；23為清水對(duì)照。4號(hào)生理 小種特異性引物、1號(hào)生理小種特異性引物以及尖鐮孢特異性的引物能分別擴(kuò)增出特異性 的條帶，大小分別為593bp、354bp、729bp，而外圍菌株則沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物。本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明所篩選出的引物具有優(yōu)異的特異性，能分別鑒定出病原菌 的生理小種。實(shí)施例3 三重PCR檢測(cè)體系對(duì)香蕉枯萎病菌DNA及對(duì)照和外圍菌株DNA的檢測(cè)
鑒定以香蕉枯萎病菌1號(hào)和4號(hào)生理小種及對(duì)照菌株共20個(gè)菌株的基因組DNA為模 板，三重PCR檢測(cè)引物(見(jiàn)表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見(jiàn)表2，并設(shè)清水對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果如附圖4所示，附圖4中，M為DL2000 ；1 6為F0C4 ； 7 11為FOCl ； 12 13為F0C4+F0C1 ；14為清水對(duì)照；15為苦瓜枯萎病菌；16為節(jié)瓜枯萎 病菌；17為冬瓜枯萎病菌；18為棉花枯萎病菌；19為茄子枯萎病菌；20為番茄枯萎病菌；21 為黃瓜枯萎病菌；22為半裸鐮孢；23為立枯絲核菌；24為陽(yáng)性對(duì)照(XJZ2) ；25為陽(yáng)性對(duì)照 (FJZ3) ；26為清水對(duì)照。4號(hào)生理小種菌株可得兩條帶大小為593bp和729bp，1號(hào)生理小 種菌株也有兩條帶，大小為354bp和729bp，同時(shí)尖鐮孢的菌株有一條帶，大小為729bp，而 清水及外圍菌株半裸鐮孢、立枯絲核菌則沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，應(yīng)用三重PCR檢測(cè)引物及體系可在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)出香 蕉枯萎病菌1號(hào)和4號(hào)生理小種；同時(shí)，因?yàn)橛锌勺鳛閮?nèi)參照的尖鐮孢特異性引物，所以又 能夠檢查所提DNA的質(zhì)量，從而避免了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。實(shí)施例4 三重PCR檢測(cè)體系靈敏度檢測(cè)鑒定取4號(hào)生理小種菌株XJZ2的新鮮菌絲IOOmg抽提DNA后溶于50 μ L的水中，用10 倍濃度梯度倍比稀釋后作為模板進(jìn)行三重PCR檢測(cè)，并設(shè)清水對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 0%的瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)。三重PCR檢測(cè)體系靈敏度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖5，DNA抽提液在稀釋IO4倍后仍能擴(kuò)增出特異條帶，表明該體系能夠檢測(cè)出最低相當(dāng)于0. 2μ g的新鮮菌絲的存在。附 圖5中，M為DL2000 ；1 7為XJZ2的基因組DNA稀釋梯度(10° 10_6) ；8為清水對(duì)照。
實(shí)施例5 三重PCR檢測(cè)體系對(duì)發(fā)病香蕉組織DNA的檢測(cè)鑒定從廣東省香蕉枯萎病發(fā)病區(qū)采集香蕉病害標(biāo)本，按本發(fā)明的檢測(cè)進(jìn)行香蕉方法病 組織總DNA的抽提，并以之為模板，同時(shí)用清水，已知1號(hào)和4號(hào)生理小種的菌株DNA做對(duì) 照，進(jìn)行三重PCR檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如附圖6所示，香蕉病 組織DNA及已知4號(hào)生理小種DNA得到兩條大小為729bp和593bp擴(kuò)增條帶，而罹病的粉蕉 組織DNA及已知1號(hào)生理小種的兩條擴(kuò)增產(chǎn)物大小為別為729bp和354bp。由此可判斷，所 采集的香蕉病害標(biāo)本是由4號(hào)生理小種引起的，而粉蕉的病害則由1號(hào)生理小種造成。附 圖6中，M為DL2000 ；1為XJZ2菌DNA ；2為FJZl菌DNA ；3為珠海香蕉病樣；4為珠海粉蕉 病樣；5為東莞香蕉病樣；6為東莞粉蕉病樣；7為清水對(duì)照。實(shí)施例6 三重PCR檢測(cè)體系對(duì)分離得到的病原菌DNA的檢測(cè)鑒定將實(shí)施例5采集的病害標(biāo)本進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，具體步驟同實(shí)施例2所示，抽 提病原菌株的DNA，方法同實(shí)施例2，并以此為模板，同時(shí)用清水和已知的1號(hào)、4號(hào)生理小種 菌株DNA做對(duì)照，進(jìn)行三重PCR檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如附圖7 所示，由罹病香蕉上分離到的病原菌與已知4號(hào)生理小種均能擴(kuò)增到兩條大小為729bp和 593bp擴(kuò)增條帶，而從粉蕉上分離到的病原菌與已知1號(hào)生理小種則得到兩條大小為別為 729bp和354bp的產(chǎn)物。附圖7中，M為DL2000 ；1為XJZ2菌DNA ；2為FJZl菌DNA ；3為珠 海香蕉病樣；4為珠海粉蕉病樣；5為東莞香蕉病樣；6為東莞粉蕉病樣；7為清水對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)施例5的結(jié)果，從而說(shuō)明本發(fā)明所建立的三重PCR檢測(cè) 體系不論是針對(duì)罹病的香蕉組織，還是從中分離到的病原菌的DNA均能得到可靠的鑒定結(jié)^ ο實(shí)施例7 三重PCR檢測(cè)體系對(duì)拌菌土壤的檢測(cè)鑒定在三份200mg滅菌土壤中分別加入IOmg 4號(hào)生理小種菌株XJZ2、1號(hào)生理小種菌 株FJZ3以及苦瓜枯萎病菌的新鮮菌絲，各自混勻。用E.Z.N.ASoil DNA kit(OMEGA)試劑 盒(市購(gòu))提取土壤中各菌的基因組DNA，具體步驟如下(1)在15mL離心管中加入混勻的樣品，再加入1毫升的SLX溶液，在最大速度下渦 旋3分鐘直至樣品被打散，再加入100 μ L的DS緩沖液，渦旋混勻，然后置于70°C水浴鍋中 溫浴lOmin，在孵育的過(guò)程中震蕩樣品2次以充分混勻樣品；(2)加入200 μ L的SP2溶液，振蕩2分鐘充分混勻樣品，冰上靜置5min后，4°C下 13，000g，離心 5min ；(3)小心轉(zhuǎn)移取上清液至一個(gè)新的2mL離心管中，注意不要吸到沉淀或細(xì)胞碎片， 加入與所取上清液等體積的異丙醇，并翻轉(zhuǎn)離心管5 10次以混勻樣品，室溫下13，000g, 離心IOmin ； (4)小心倒掉上清液并確保DNA沉淀不被倒出，將離心管倒置在吸水紙上風(fēng)干DNA 樣品；(5)加入200 μ L的ddH20并渦旋10秒，65°C溫浴10 20min以完全溶解DNA沉
淀，短暫離心以收集粘在離心管壁上的液體。(6)加入IOOyL被均勻重懸的HTR溶液并震蕩10秒后，室溫下靜置2min，13，000g，離心 2min ；(7)轉(zhuǎn)移上清液至一個(gè)新的離心管中。注意如果上清仍然呈現(xiàn)較為重的顏色，重 復(fù)HTR抽提步驟6 ；(8)加入2μ L RNase A(25mg/ml)并震蕩10s，37 °C下溫浴IOmin以消除樣品中的 DNA ；(9)加入300 μ L ΧΡ2溶液，振蕩混勻樣品，移至一個(gè)裝有2ml收集管的HiBind DNA 結(jié)合柱中，室溫下13，000g，離心lmin，棄去濾液；(10)將HiBind DNA結(jié)合柱置于原來(lái)的收集管中，加入300 μ L的XP2溶液，室溫下 13，OOOg,離心lmin，棄去濾液；(11)將DNA結(jié)合柱移至另一收集管上，加入700 μ L SPW洗液(已用無(wú)水乙醇稀 釋)室溫下13，000g，離心lmin，棄去濾液，重復(fù)本步驟一次；(12)室溫下13，000g,離心空DNA結(jié)合柱2min以盡棄SPW洗液；(13)將DNA結(jié)合柱移至一新的1. 5ml離心管上，加入50 μ L的TE (或ddH20)至柱 子的中央，65°C溫浴至少5min后，室溫13，000g,離心以洗脫DNA。(14)取1 2μ L抽提的DNA利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品的純度及濃度，以 OD260/OD280的比值為1. 8 2. 0時(shí)最佳，調(diào)整DNA的濃度為IOng/ μ L 50ng/ μ L為宜；然 后置于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆?。得到所需檢測(cè)的拌菌土壤DNA，并以此為模板進(jìn)行三重PCR檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如附圖8所示，附圖8中，M為DL2000 Marker ；1為 接種XJZ2的土壤樣品；2為接種FJZ3的土壤樣品；3為接種苦瓜枯萎病菌的土壤樣品；4為 滅菌土對(duì)照；5為F0C4陽(yáng)性對(duì)照；6為FOCl陽(yáng)性對(duì)照；7為尖鐮孢陽(yáng)性對(duì)照；8為清水對(duì)照。 三重PCR檢測(cè)體系能檢測(cè)土壤中的香蕉枯萎病菌1號(hào)、4號(hào)生理小種及其它尖鐮孢。由混 有菌株XJZ2的土壤中提取DNA用10倍梯度稀釋后進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如附圖9， 附圖9中，M為DL2000 Marker ；1 6為接種XJZ2的土壤樣品DNA稀釋梯度(10° 10_5)； 7為F0C4陽(yáng)性對(duì)照；8為清水對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明拌有XJZ2的土壤中DNA模板在稀釋100 倍后還能進(jìn)行有效檢測(cè)。實(shí)施例7表明三重PCR檢測(cè)體系可應(yīng)用于香蕉枯萎病病區(qū)土壤中 DNA的檢測(cè)，以鑒定該種植區(qū)是否有病原的存在，為生產(chǎn)種植提供了方便和技術(shù)保障。
1權(quán)利要求
香蕉枯萎病菌1號(hào)和4號(hào)生理小種檢測(cè)引物，具有以下序列1號(hào)生理小種特異性檢測(cè)引物序列為上引物5′GTTGAGTCTCGATAAACAGCAAT 3′；下引物5′GACGAGGGGAGATATGGTC 3′；4號(hào)生理小種特異性檢測(cè)引物序列為上引物5′GCCGATGTCTTCGTCAGGTA 3′；下引物5′CTGAGACTCGTGCTGCATGA 3′；尖鐮孢通用引物序列為上引物5′GCAGTCGTACGTCATCGACC 3′；下引物5′CCATGGCAGATGGCGAGTCA 3′。
2.一種利用權(quán)利要求1所述引物檢測(cè)香蕉枯萎病菌生理小種的方法，其特征在于包括 以下步驟(1)抽提罹病香蕉組織總DNA；(2)以罹病香蕉組織抽提的總DNA為模板，以權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)所述罹病香蕉組織為香蕉球莖組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)所述三重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為體積 終濃度10 X緩沖液(含Mg2+)2.5u L IXdNTP(2. 5mmol/L)2u L0. 2mmol/L1號(hào)生理小種特異性上引物(Symol//L)1 u L0. 2u mol/L1號(hào)生理小種特異性下引物(Symol//L)1 u L0. 2u mol/L4號(hào)生理小種特異性上引物(Symol//L)1 u L0. 2u mol/L4號(hào)生理小種特異性下引物(5 u mol；/L)1 u L0. 2u mol/L尖孢鐮刀菌通用上引物(5iimol/L)1 u L0. 2umol/L尖孢鐮刀菌通用下引物(5i!m0l/L)1 u L0. 2umol/LTaq 酶(5U/ u 1)0. 2u L0. 04U/ u LDNA模板1 u L10-50ngddH 013. 3u L0
5.一種權(quán)利要求2所述方法的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于檢測(cè)分自香蕉枯萎病株的真菌 DNA所屬生理小種檢測(cè)。
6.一種權(quán)利要求2所述方法的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于檢測(cè)香蕉枯萎病株病組織總 DNA中所含生理小種。
7.—種權(quán)利要求2所述方法的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于檢測(cè)土壤中所存在的香蕉枯萎 病菌生理小種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了香蕉枯萎病菌1號(hào)和4號(hào)生理小種檢測(cè)引物和快速檢測(cè)方法。本發(fā)明提供了香蕉枯萎病菌1號(hào)、4號(hào)生理小種及尖鐮孢通用引物，實(shí)現(xiàn)了在一次PCR反應(yīng)中能特異性的同時(shí)檢測(cè)香蕉枯萎病菌1號(hào)生理小種和4號(hào)生理小種，檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.2μg的新鮮菌絲；由于本發(fā)明同時(shí)提供了一組尖鐮孢通用檢測(cè)引物，可作為內(nèi)參照以檢測(cè)DNA的質(zhì)量，故避免了假陰性的出現(xiàn)；本檢測(cè)方法既可自罹病香蕉組織抽提的DNA為模板進(jìn)行準(zhǔn)確、快速地鑒定香蕉枯萎病菌生理小種，還能檢測(cè)土壤中的香蕉枯萎病菌；具有省時(shí)、簡(jiǎn)便、可同時(shí)鑒定1號(hào)和4號(hào)生理小種且能避免假陰性等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101899506SQ20101018121
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者習(xí)平根, 余雄濤, 周佳暖, 姜子德, 李敏慧 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)