專利名稱：Sod除雜純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種SOD提取生產(chǎn)工藝，尤其涉及一種SOD除雜純化工藝。
背景技術(shù)：
SOD是超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase)的縮寫，它是一種源于生命體的 活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase)是1938年Marn等人首次從牛紅血球 中分離得到超氧化物歧化酶開始算起，人們對SOD的研究己有七十多年的歷史。1969年 McCord等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白，并且發(fā)現(xiàn)了它們的生物活性，弄清了它催化過氧陰離子發(fā)生 歧化反應(yīng)的性質(zhì)，所以正式將其命名為超氧化物歧化酶。它催化如下的反應(yīng)2(Γ+2Η+ — Η202+0202_稱為超氧陰離子自由基，是生物體多種生理反應(yīng)中自然生成的中間產(chǎn)物。它是 活性氧的一種，具有極強的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD是機體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，它通過上述反應(yīng)可以把有害的超 氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫。盡管過氧化氫仍是對機體有害的活性氧，但體內(nèi)過氧化氫酶 (CAT)和過氧化物酶(POD)會立即將其分解為完全無害的水。這樣，三種酶便組成了一個 完整的防氧鏈條。SOD常見生產(chǎn)工藝是經(jīng)過采血、取血球、熱處理、離心、超濾、濃縮、冷凍干燥而成。超氧化物歧化酶以多個常見形式存在它們以銅和鋅、或錳、鐵、或鎳作為輔因子。 基本上所有的真核細胞的細胞內(nèi)都含有帶有銅和鋅的超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)。例 如，市場上銷售的從牛紅血球中純化的Cu-Zn-SOD。Cu-Zn-SOD是一個二聚體，分子量為 32，500。兩個亞基主要通過疏水和靜電相互作用結(jié)合在一起。銅和鋅則與活性位點上的組 氨酸側(cè)鏈形成配位鍵。臨床試用SOD治療和預(yù)防下列疾病(1)可抑制心腦血管疾病；(2)抗衰老作用；(3)自身免疫性疾?。虎确螝饽[；(5)輻射病及輻射防護；(6)老年性白內(nèi)障等。目前SOD的生產(chǎn)主要用動物血球為原料，將動物血球破壁之后，需要去除血球中 的雜蛋白，這時候通常使用銅鹽對雜質(zhì)蛋白進行沉淀，但是使用銅鹽進行除雜具有以下缺 陷1)銅鹽價格昂貴；2)處理后的血渣含銅量太高，使血渣無法作為飼料等回收利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種減少銅鹽使用量的SOD純化除雜工藝。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是提供一種SOD除雜純化工 藝，其特征在于，所述工藝包括以下步驟1)取動物血液，離心分離，得到血球與血漿，加入所述血球重量70% 80%的水， 1. 8% 2. 2%的NaCl，0. 18% 0. 22%的葡萄糖，攪拌；2)對步驟1)所得溶液加熱到55°C 60°C，加入硫酸銅溶液并攪拌，所述硫酸銅溶 液中含血球重量0. 9% 1. 0% CuSO4 · 5H20 ；3)加入硫酸鋁溶液與亞硫酸鈉溶液并攪拌，所述硫酸鋁溶液中含血球重量 0. 9 % 1. 0 % Al2 (SO4) 3 · 18H20,所述亞硫酸鈉溶液中含血球重量0. 018 % 0. 02 %的 Na2SO3 ；4)加入氨水將溶液PH值調(diào)整至6. 4 6. 7，同時將溶液加熱到65°C 67 V ；5)加入硫酸銅溶液將溶液調(diào)至過濾后無色或粉紅色；6)將溶液在67°C 70°C保溫15 30分鐘；7)將溶液冷卻到28°C 30°C后進行離心過濾，濾渣為血渣；8)將步驟7)所得濾液通過截流量6000 10000的超濾，得到濃縮液。其中，所述工藝中使用的硫酸銅溶液以CuSO4 · 5H20計濃度為100g/L，硫酸鋁溶液 與亞硫酸鈉溶液為含有硫酸鋁、亞硫酸鈉與硫酸混合溶液，其中以Al2(SO4)3 · ISH2O計硫酸 鋁的濃度為100g/L，以Na2SO3計亞硫酸鈉的濃度為2g/L，硫酸濃度以維持混合溶液PH值為 5 5. 4為準，所述氨水濃度以NH3計為5%。其中，所述硫酸銅溶液、硫酸鋁溶液、亞硫酸鈉溶液加入時采取噴灑式加入。其中，所述步驟1)中攪拌的時間為20分鐘；所述步驟2)與步驟3)之間的時間 間隔為5分鐘；步驟3)與步驟4)之間的時間間隔為10分鐘；步驟6)的保溫時間為20分鐘。其中，所述動物血液為豬血。在發(fā)明方案中，NaCl作用是增加SOD在水中的溶解度，葡萄糖的作用是穩(wěn)定劑，亞 硫酸鈉是作為還原劑用于消除Fe3+對SOD的氧化影響。本發(fā)明的有益效果是區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的，本發(fā)明使用銅鹽與鋁鹽混合使用進行 除雜，沉淀雜蛋白，大大減低了銅鹽的使用量，節(jié)約了成本，而且降低了生產(chǎn)中產(chǎn)生的血渣 的銅殘余，有利于產(chǎn)物的綜合利用。本發(fā)明的重點在于使用鋁鹽配合銅鹽進行雜質(zhì)蛋白的沉淀去除，因為SOD本身含 有銅、鋅離子，因此對外界離子環(huán)境及其敏感，在大多數(shù)金屬鹽類的溶液環(huán)境中，銅、鋅離子 均可能被其他金屬離子替換而導(dǎo)致酶失活失效，發(fā)明人經(jīng)過長期理論、實驗摸索，終于找到 合適的銅鹽替代物硫酸鋁，并且摸索到合適的離子濃度，使酶活性不失活，而且在生產(chǎn)效率 與產(chǎn)品質(zhì)量上相對于舊工藝還有進一步提高。詳見具體實施方式
部分。
具體實施例方式為詳細說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式 詳予說明。
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實施例1生產(chǎn)工藝流程1)取新鮮豬血，離心分離，得到豬血球100kg，加入70kg的水，1. 8kg的NaCl，180g 的葡萄糖，攪拌30分鐘；2)對步驟1)所得溶液加熱到60°C，以噴灑方式加入硫酸銅溶液12L并攪拌，所述 硫酸銅溶液中含0. 9kg的CuSO4 · 5H20 ；3) 10分鐘后噴灑方式加入硫酸鋁溶液與亞硫酸鈉的混合溶液12L并攪拌，所述混 合溶液中含0. 9kg的Al2(SO4)3 · ISH2O與18g的Na2SO3 ；所述硫酸鋁溶液與亞硫酸鈉的混合 溶液中含有硫酸，且PH值為54) 15分鐘后加入5%的氨水，調(diào)節(jié)溶液的PH值至6. 4，同時將溶液加熱到66°C ；5)加入硫酸銅溶液，加入的同時取小樣過濾，直至小樣的溶液過濾后無色或粉紅 色；6)將溶液在67V 70°C之間保溫15分鐘；7)將溶液冷卻到28°C 30°C之間離心過濾；8)將步驟7)所得濾液通過截流量6000的超濾，得到濃縮液。9)濃縮液經(jīng)過濃縮和丙酮沉淀后進行冷凍干燥，制得成品；10)用鄰苯三酚自氧化法測定成品酶活為8400U/mg，獲得SOD酶活187200U，根據(jù) 理論上每IOOkg豬血球中含SOD酶活260000U，收率為72. 4%。實施例2生產(chǎn)工藝流程1)取新鮮豬血，離心分離，得到豬血球100kg，加入75kg的水，2. Okg的NaCl，200g 的葡萄糖，攪拌20分鐘；2)對步驟1)所得溶液加熱到57°C，以噴灑方式加入硫酸銅溶液IOL并攪拌，所述 硫酸銅溶液中含1. Okg的CuSO4 · 5H20 ；3)5分鐘后噴灑方式加入硫酸鋁溶液與亞硫酸鈉的混合溶液IOL并攪拌，所述混 合溶液中含1. Okg的Al2(SO4)3 · ISH2O與20g的Na2SO3 ；所述硫酸鋁溶液與亞硫酸鈉的混合 溶液中含有硫酸，且PH值為5. 24) 10分鐘后加入5%的氨水，調(diào)節(jié)溶液的PH值至6. 5，同時將溶液加熱到65°C ；5)加入硫酸銅溶液，加入的同時取小樣過濾，直至小樣的溶液過濾后無色或粉紅 色；6)將溶液在67V 70°C之間保溫20分鐘；7)將溶液冷卻到28°C 30°C之間離心過濾；8)將步驟7)所得濾液通過截流量8000的超濾，得到濃縮液。9)濃縮液經(jīng)過濃縮和丙酮沉淀后進行冷凍干燥，制得成品酶活性8750U/mg，收率 為74. 1%，測定方法同實施例1。實施例2生產(chǎn)工藝流程1)取新鮮動物豬血100kg，加入80kg的水，2. 2kg的NaCl，220g的葡萄糖，攪拌10 分鐘；
2)對步驟1)所得溶液加熱到55°C，以噴灑方式加入硫酸銅溶液8L并攪拌，所述 硫酸銅溶液中含0. 95kg的CuSO4 · 5H20 ；3) 5分鐘后噴灑方式加入硫酸鋁溶液與亞硫酸鈉的混合溶液8L并攪拌，所述混合 溶液中含0. 95kg的Al2(SO4)3 · ISH2O與19g的Na2SO3 ；所述硫酸鋁溶液與亞硫酸鈉的混合 溶液中含有硫酸，且PH值為5. 44) 10分鐘后加入5%的氨水，調(diào)節(jié)溶液的PH值至6. 7，同時將溶液加熱到67。C ；5)加入硫酸銅溶液，加入的同時取小樣過濾，直至小樣的溶液過濾后無色或粉紅 色；6)將溶液在67V 70°C之間保溫30分鐘；7)將溶液冷卻到28°C 30°C后離心過濾；8)將步驟7)所得濾液通過截流量10000的超濾，得到濃縮液。9)濃縮液經(jīng)過濃縮和丙酮沉淀后進行冷凍干燥，制得成品酶活性8620U/mg，收率 為73. 2%，測定方法同實施例1。實施例4舊工藝DlOOkg 豬血球，100L 水，2. 2kg NaCl，200g 葡萄糖，攪拌 10 分鐘;2)噴灑入28-32升的10%硫酸銅溶液(以CuSO4 ·5Η20重量計)，加熱至65_67°C， 保溫30分鐘；3)冷卻至常溫，離心過濾；4)用截流分子量10000的超濾管進行超濾、濃縮；5)濃縮液用丙酮沉淀后冷凍干燥，得成品，成品酶活性7500U/mg，收率68%。SOD生產(chǎn)過程中，每IkgSOD成品約需血球16. 6t，以每噸血球加入IOkg CuSO4 · 5H20,與IOkgAl2 (SO4) 3 · 18H20計，需要消耗硫酸銅與硫酸鋁各166kg，以硫酸銅單價 13元，硫酸鋁單價1. 2元計，這兩份原料共計成本2357元。舊工藝中，每噸血球需要26kg CuSO4 · 5H20，硫酸銅成本共計5611元。新舊工藝對比節(jié)約3254元以下表格是新舊工藝血渣中殘余銅含量的對比 由于殘銅量的降低，使產(chǎn)生的血渣可以作為飼料原料進行加工，產(chǎn)生了經(jīng)濟效益， 每16. 6t血球平均產(chǎn)生血渣5t，每噸血渣按1500元價格計算，產(chǎn)生經(jīng)濟效益7500元。以下表格是新舊工藝收率對比 從上述數(shù)據(jù)我們可以得出，新工藝無論是在產(chǎn)品質(zhì)量或是收率，成本等方面均優(yōu) 于舊工藝，而且產(chǎn)生的副產(chǎn)物更便于利用。以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng) 域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種SOD除雜純化工藝，其特征在于，所述工藝包括以下步驟1)取動物血液，離心分離，得到血球與血漿，加入所述血球重量70％～80％的水，1.8％～2.2％的NaCl，0.18％～0.22％的葡萄糖，攪拌；2)對步驟1)所得溶液加熱到55℃～60℃，加入硫酸銅溶液并攪拌，所述硫酸銅溶液中含血球重量0.9％～1.0％CuSO4·5H2O；3)加入硫酸鋁溶液與亞硫酸鈉溶液并攪拌，所述硫酸鋁溶液中含血球重量0.9％～1.0％Al2(SO4)3·18H2O，所述亞硫酸鈉溶液中含血球重量0.018％～0.02％的Na2SO3；4)加入氨水將溶液PH值調(diào)整至6.4～6.7，同時將溶液加熱到65℃～67℃；5)加入硫酸銅溶液將溶液調(diào)至過濾后無色或粉紅色；6)將溶液在67℃～70℃保溫15～30分鐘；7)將溶液冷卻到28℃～30℃后進行離心過濾；8)將步驟7)所得濾液通過截流量6000～10000的超濾，得到濃縮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SOD除雜純化工藝，其特征在于，所述工藝中使用的硫酸銅 溶液以CuSO4 · 5H20計濃度為100g/L，硫酸鋁溶液與亞硫酸鈉溶液為含有硫酸鋁、亞硫酸鈉 與硫酸混合溶液，其中以Al2 (SO4) 3 · ISH2O計硫酸鋁的濃度為100g/L，以Na2SO3計亞硫酸鈉 的濃度為2g/L，硫酸濃度以維持混合溶液PH值為5 5. 4為準，所述氨水濃度以NH3計為 5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SOD除雜純化工藝，其特征在于，所述硫酸銅溶液、硫酸鋁溶 液、亞硫酸鈉溶液加入時采取噴灑式加入。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SOD除雜純化工藝，其特征在于，所述步驟1)中攪拌的時間 為20分鐘；所述步驟2)與步驟3)之間的時間間隔為5分鐘；步驟3)與步驟4)之間的時 間間隔為10分鐘；步驟6)的保溫時間為20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3任意一項所述SOD除雜純化工藝，其特征在于，所述動物血液為 豬血。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種SOD除雜純化工藝，使用銅鹽與鋁鹽混合使用進行除雜，沉淀雜蛋白，大大減低了銅鹽的使用量，節(jié)約了成本，而且降低了生產(chǎn)中產(chǎn)生的血渣的銅殘余，有利于產(chǎn)物的綜合利用。
文檔編號C12N9/08GK101899426SQ20101018455
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者黃發(fā)燦 申請人:大田華燦生物科技有限公司