專利名稱：一種降解硫代葡萄糖甙的復合菌系及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種降解硫代葡萄糖甙的復合菌系及其應用，屬于應用微生物技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
菜粕中含有較高的蛋白含量。但是由于菜籽粕中含有植酸、單寧、粗纖維等抗營養(yǎng) 因子，尤其是硫代葡萄糖甙(簡稱硫甙)。目前已從數(shù)百種植物中發(fā)現(xiàn)120多種硫甙。硫甙 能引起飼用動物甲狀腺腫大，從而造成其生長發(fā)育遲緩，使菜籽粕難以作為優(yōu)質(zhì)飼料蛋白 資源加以充分應用的原因所在，所以脫除菜籽粕中硫甙顯得尤為重要。目前，脫除硫甙方法 有物理法、化學法、生物法和遺傳學方法等，物理化學發(fā)往往有較好的硫甙脫除效果，但會 造成大量的蛋白質(zhì)損失，同時使用有機溶劑會造成一定的環(huán)境污染、物料的干燥需要大量 的能量以及只能對其中的一種抗營養(yǎng)因子起脫除作用等諸多缺陷。遺傳法是未來重點發(fā)展 的方向。微生物固態(tài)發(fā)酵發(fā)由于具有經(jīng)濟、對環(huán)境污染小、簡便和脫毒徹底等優(yōu)點。是目前 國內(nèi)進行菜籽粕生物脫毒主要方式。然而硫甙是含有不同烴基的一類物質(zhì)，烴基可以是烷烴、烯烴以及芳香烴等多種 情況，而酶又具有高度的專一性，一種酶往往只能對其中的一種物質(zhì)起降解作用，單菌固態(tài) 發(fā)酵所產(chǎn)生酶系較單一，往往造成硫甙降解效率不高，同時當前研究菜粕硫甙降解時沒有 考慮對其中的單寧、植酸、粗纖維和蛋白質(zhì)的含量的影響。本實驗所采用的兩株霉菌具有很 好的硫甙降解效果，據(jù)報道熱帶假絲酵母具有較好的提高蛋白含量的能力，和熱帶假絲酵 母復配后，可以利用菜粕中加入的無機氮合成自身的菌體蛋白。所以兩株霉菌和一株酵母 的復配菌系不僅很好的降低了菜粕中硫甙含量，而且在一定程度上降低了粗纖維的含量、 提高了蛋白含量(單寧和植酸含量基本無影響)，大大提高了菜粕的飼用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能降解硫代葡萄糖甙的復合菌系，以及在降解菜粕中的 硫甙、粗纖維和提高蛋白質(zhì)含量中的應用。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為本發(fā)明提供的一種微生物復配菌系，是由兩株霉菌和一株熱帶假絲酵母構(gòu)成，兩 株霉菌是從腐爛的菜籽粕中分離純化得到了，一株熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)由 江南大學食品學院谷物功能成分研究室提供，兩株霉菌由生工生物工程(上海)有限公司 鑒定，鑒定結(jié)果為橫梗霉屬(Lichtheimia sp.)和土曲霉(Aspergillus terreus)，橫梗霉 屬(Lichtheimia sp. JN3C)已于2010年5月13日保臧于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號為CCTCC M2010114。本發(fā)明的霉菌取材于腐爛的菜籽粕樣品，實驗初期只以硫甙降解率為指標進行菌 種的篩選，即通過初篩、復篩、發(fā)酵培養(yǎng)基硫甙降解率測定和復配菌株的篩選等實驗最終確 定了土曲霉和橫梗霉屬兩株霉菌。以選出兩株霉菌作為基礎(chǔ)和熱帶假絲酵母進行復配。
3
在15g的菜籽粕中加入3%的(NH4)2SO4作無機氮源和的葡萄糖，并選擇發(fā)酵 溫度30°C，料水比1 1.3，發(fā)酵時間70h的條件下，用5ml無菌水沖洗試管斜面制備菌懸 液后，以0.6ml 0.8ml 1. Oml (土曲霉橫梗霉屬熱帶假絲酵母)為配比進行固態(tài)發(fā)酵。以上條件進行固態(tài)發(fā)酵后，硫甙的降解率達90%以上，蛋白含量從38. 01 % (干 基)提高到48. 47%，粗纖維的含量由14. 5% (干基)降低到2. 78%，單寧和植酸含量略有 降低。顯著的改善了菜粕的飼用品質(zhì)。


圖 1 為橫梗霉屬(Lichtheimia sp. JN3C)和土曲霉(Aspergillus terreus)平板 培養(yǎng)菌落圖片。圖2為硫甙的降解率隨時間的變化曲線。圖3為發(fā)酵前后蛋白質(zhì)和粗纖維的變化圖。
具體實施例方式實施例1 菌株的篩選1培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基用菜粕餅粕按1 6(g/ml)加90°C左右的水，沸水浴加熱30min，冷
卻后過濾，取濾液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分離細菌培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入牛肉膏0.05%，蛋白胨0. 15%，NaCl 0.5%, 瓊脂 2%，0· 15%納它霉素，PH7. 0-7.2。分離真菌培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加K2HPO4 0. 1%, KCl 0. 5%, MgSO4 0. 05%, FeSO4 0. 001 %，瓊脂2%，氯霉素0. 1%，PH自然。菌種復篩培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基去除蛋白質(zhì)，過濾后加2%的瓊脂，PH自然。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基15g經(jīng)粉碎后的菜粕。2優(yōu)勢降解菌株的篩選2. 1菌種的分離、純化和篩選取土壤Ig制備土壤稀釋液和稀釋梯度，每個稀釋梯度做兩個平行，將梯度稀釋液 分別涂布到分離細菌培養(yǎng)基和分離真菌培養(yǎng)基中，選擇適合的梯度將培養(yǎng)出的肉眼可見的 菌落依照形態(tài)特征差異，同時結(jié)合顯微鏡觀察，據(jù)此可在一定程度上鑒別微生物，把平板 上的細菌接到LB培養(yǎng)基上，霉菌和酵母分別轉(zhuǎn)接到PDA和YEPD培養(yǎng)基上分離純化2 3 次，鏡檢以獲得純的培養(yǎng)物。將經(jīng)過分離純化后的細菌，酵母和霉菌轉(zhuǎn)接到復篩培養(yǎng)基中， 細菌2天，酵母3天，霉菌5天后觀察生長情況，長勢很差或在復篩培養(yǎng)基上一直未見生長 的菌將遭到淘汰。長勢較好的菌種活化后制備孢子懸液或種子液接入滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基 進行固態(tài)發(fā)酵，測定該菌的硫甙降解率。經(jīng)過上述篩選后的菌株再與熱帶假絲酵母進行復配，此時固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入 3%的(NH4)2SO4作無機氮源和的葡萄糖供酵母菌利用，以生產(chǎn)菌體蛋白。以硫甙的降解 和蛋白含量的提高為指標篩選出較優(yōu)的復合菌系。硫甙的降解率測定選用氯化鈀法(汪正華，魏晶石，沈儉.對菜籽餅中硫葡萄糖苷有高效降解作用的菌種篩選研究[J].微生物學雜志，2000，20(1) :57 59)。
降解率=乞 E1式中E1表示發(fā)酵前采用氯化鈀法測定干基態(tài)菜粕的吸光值E2表示發(fā)酵后采用氯化鈀法測定的吸光值3 結(jié)果經(jīng)過菌種的初篩，分離純化和復篩后保留下來了 13株酵母，41株細菌，13株霉菌， 再接到經(jīng)過滅菌后固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行硫甙降解率測試，最終取硫甙降解較好的4株霉 菌。四株霉菌經(jīng)過兩株復配，三株復配和四株復配進行固態(tài)發(fā)酵，以硫甙降解率為指 標進行篩選，最終選擇霉菌C4和C8復配組合。霉菌C4、C8和熱帶假絲酵母復配后，復合菌系的硫甙降解率在70h達到最高。此 時硫甙降解率達到90%以上，見附圖2。附圖中在Oh也有一定的降解率，是因為經(jīng)過高壓 蒸汽滅菌后，硫甙的含量也有一定的降低。實施例2菌種的配比對硫甙降解率和蛋白含量的影響酵母種子液的制備酵母菌在YEPD固體試管斜面上活化3天后，挑取一環(huán)到 250ml三角瓶裝有50ml的YEPD液體培養(yǎng)基中，120r/min, 28°C搖床培養(yǎng)16h左右，制的酵母 種子液。孢子懸液的制備霉菌在PDA斜面培養(yǎng)基上活化5天左右，在轉(zhuǎn)接到另一試管斜 面，待孢子成熟后，用5ml的無菌水沖洗斜面制的孢子懸液。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中再加入3%的(NH4)2SO4作無機氮源和的葡萄糖，并選擇發(fā) 酵溫度30 °C，料水比1 1.3，取不同體積的孢子懸液和酵母種子液復配，霉菌和酵母的接 種量和復配情況見表1。發(fā)酵70h后測定硫甙降解率和蛋白質(zhì)含量(此時的菜粕不作滅菌 處理，且剛把水加入到菜粕后，菜粕呈泥狀，傳質(zhì)和傳熱效果差，所以加入水的菜粕放置一 段時間，使得含水的菜粕較松散)。表1霉菌和酵母的復配比例(單位ml)
C4_C8_酵母
1θΓθ08 Γο"
20.61. O0.8
30.80.61.0
40.81.00. 6
51.00. 60.8
61.00. 80.6 70. 80.80.8 發(fā)酵后的蛋白含量=(總氮_無機氮)Χ6. 25。總氮的測定采用凱式定氮法，無機 氮的測定硼酸吸收法(張秀英，王琳，張有娟，等.無機銨鹽中氮含量測定方法的改進[J]. 化學研究與應用，2001，13(6) =699-700.)并一些修改。
經(jīng)過上述條件進行固態(tài)發(fā)酵后，測定各水平的硫甙和蛋白質(zhì)含量，最終確定以 C4 C8 熱帶假絲酵母為0. 6ml 0.8ml 1. Oml的配比降解硫甙和提高蛋白含量最好。 其中硫甙的降解率為93.5%，達到了在滅菌條件下的硫甙降解率。蛋白含量從38. 01% (干 基)提高到48. 47%，見附圖3。為了綜合評定菜粕的營養(yǎng)價值，選擇水平1的發(fā)酵組合，測定發(fā)酵前后的的粗纖 維、單寧和植酸含量變化以及發(fā)酵后菜粕的回收率情況，結(jié)果顯示粗纖維從14. 5% (干 基)降低到2. 78%。單寧和植酸含量略有降低。菜粕的回收率為88.7%。發(fā)酵后大大改 善了菜粕的飼用價值。實施例3菌種的鑒定1. 1菌株的形態(tài)學觀察將菌株接到固體培養(yǎng)基上，在適宜的條件下培養(yǎng)一段時間觀察菌種的平板菌落形 態(tài)。1. 2菌種的分子生物學鑒定本實驗分離到的菌送往生工生物工程(上海)有限公司進行鑒定。1. 3 結(jié)果1. 3. 1平板形態(tài)學鑒定菌株C4在PDA平板上5天后，菌落層薄、小、圓。孢子頭密集，表面呈細分裝，土黃 色到黃褐色，分生孢子頭的頂囊半球形，小梗雙層。見附圖1。C8號菌株在PDA平板上培養(yǎng) 48h后，菌落直徑可達到6cm左右，群體形態(tài)類似棉花狀，在37 °C條件下仍可生長，培養(yǎng)過程 中菌落逐漸由白色變?yōu)榛疑ｆ咦幽夜饣该?，形狀呈橢圓或梨形。見附圖1。1. 3. 2分子生物學鑒定兩株霉菌由生工生物工程(上海)有限公司鑒定完成，C4的序列鑒定的結(jié)果為土 曲霉(Aspergillus terreus)。IS067 C4 ITS rDNA 567bpCGAGTGCGGGTCTTTATGGCCCAACCTCCCACCCGTGACTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCAGCGTTGCTGGCCGCCGGGGGGCGACTCGCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTGCAGTCTGAGTGTGATTCTTTGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCTCGTCCCCCGGCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGACGCATTTATTTGCAACTTGTTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT
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AccessionDescription~ ~ Links
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Aspergillus terreus isolate UOA/HCPF 10213 18S ribosomal RNA gene, partial sequence； internal transcribed spacer 1， GQ1619H. 1 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 1048 2，complete sequence ； and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
Aspergillus terreus isolate UOA/IICPF 5704 ISS ribosomal RNA gene, partial sequence； internal transcribed spacer 1， GQ461903. 1 5. 8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 1.048 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
Aspergillus terreus isolate UOA/HCPF 3960 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, CQ461902. 1 5. 8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 1048 2，complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence
Aspergillus terreus isolate UOA/HCPF 3706 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, GQ461901.丄 5. 8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 1048 2，complete sequence； and 28S ribosomal RNA gene，partial sequence
Aspergillus terreus isolate UOA/HCPF 3355 18S ribosomal RNA gene, partial sequence； internal transcribed spacer 1， GQ461900. 1 5. 8S ribosomal KNA gene, and internal transcribed spacer 1048 2， complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequenceC8序列鑒定結(jié)果為橫梗霉屬(Lichtheimia sp.)。IS039C8 ITS 區(qū)685bpCATTACTGAGAGGTTATTAAGACTCTTGGGTTGAGTTTCTTTGCTCTTCTCTTGAGTTTCCTCACGGTTTTGTGCAATGTTGGGTCACCTTGGTTGACTCTGCCCTAAGTATTGGGCTGGCCTTTGGGGCCCCTAGTATGATTTATCATACTAACCCCAGAGGTTATTTCTACTATGTCTATGAATTGATGTATGAAAAAGTTATTT GTTAACTTGAAGGCTTTTCTGTAAAAAGTGAGTCTTTAAAAACAACTCTTGGCAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGTAGCAAAGTGCGATAATTATTGCGACTTGCATTCATAGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCATCTTGCGCCTAGTAGTCAATCTACTAGGCACAGTTGTTTCAGTATCTGCATCCACCAATCAATACAACTTGCTTGTGTTGGAACTGGGCTTACTTTTGATGGCATTTGGTTGCTGTCATGGCCTTAAATGTATTTAGTCCTAGGTGTTAACTTGTTAATGCCGGATGGAGACTCTAGAGTGCCTTAGAAGCAGCTTGGTTAGTGAGTTCATAATTCCAAGTGTTAGTCTTTTATTGAACTGGGTTTCTAGTCTATGGGACTTACT T
GAGAGTCGACCTCTCTAGTAAATCAAACTCACATCTAGATCTGAAATCAACTGAGATCACCC
1048 100% 0.0 100%
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1048 100% 0.0 100%Lichtheimia '.p CNPMA/f 05-100 18S nb^omal RNA gene, oar+inl 5 Lir.hrheirnia AA J-009a culturp-roilectiun CNM .:M-U97S clnn^ Uchthei mj a sc. AA-2009a culture-col Iecti on CBS;958,68 clone 2 ISS Lichtheimia so. AA-2009a culture-collection CBS;291,66 clone 2 IR ftbsidi^ corvmbifera clone bandFll internal transcribed s Absidia corymbifera internal transcribed soacer 1, cattial ！ Absidia corymbifera done bandFiO internal transo*ibtd §oac r 1, D^ Lichtheimia corvmbifera culture-collection CBS:4Z9.75 dom I IQS Lichtheirnia corYmbifera stra，n CBS 429.75 18S Hbosomai RNA aem Lichtheimia corymb if era culture-collection CBS:519, 1 clone 4 IBS Lichtheimia corYmbifera strain UMIP 1280,81 16S nbosoma! RNa ae Absidia corvmbifera strain IP 1280>81 18S ribosomai RNA gene, oar Uncultured comoost funqus 18S rRNA aene (partiet), ITSl, 5 8S rR卜 Uehthgirma cor^mbif&ra $trmn CfiRMA/F 0B-S4 ISS ribosomd RWA . Uchtheimia corvmbifera stra'm EES 227 18S nbosomal RNA qene, D Lichfheimia corvmbifera strain CMRMfi/T 08-24 US nbosomal RfJA Uchtheirnia corvmbifera strain C眺MA/F OS-4 18S ribesomal RNA Uchtheimia corvmbifera strain CMR^A/F 01-97 I8S ribasomal RMA . Uchtheimia con— strain CNRMft/F 07-88 ISS rib0soma! RNA ‘ Uchtheimia corvmbifera stram CMRMA/F 07-76 I8S nbosomal RNA · Lichtheimis corvmbifera strain O^Ma/F 06-32 18S ribosomal RMA -Lichtheimia Wr^mbifera strem CBS 101040 16S nboiornal RHA aen Uchtheimia co_bifftra strain CNRMA/F 04-14 18S nbosomal RNA -Lichtheimia corvmbifera strain CNR^lA/F 03-82 18S nbosomal RNA , Mycodadus corvmbiferus isolate South-west004 IBS nbosomal RWA Absidia sp, N20 18S ribosomai RMA gene, partial珍；internal
UncuHurnd comoost funaus IBS rRNA aene (partial). ITSl, 5.BS rRt、 Mycocladus corymbifergs strain WM 06,89 internal transcribed spac FunqaI sd- dOY-13 18S ribosomal RNA aene, partial seauersce: intei Absi小a corvmbifera strain CNRMA 03.69 18S ribosomai RNA aene Absidia corvmbifera strain CMRMA 03,611 18S ribosomai 謂A Qene Absidia corvmbifera strain IP 1129.75 18S ribosomai RNA aene, DSf
98% BS% §8% 8Θ% 86% B8% 8S% 88% sa% 88% 88%
Iy Si = HESI二Esifls
權(quán)利要求
一種高效降解硫代葡萄糖甙(簡稱硫甙)的復合菌系及其應用。其特征在于其復合菌系由二株霉菌和一株熱帶假絲酵母構(gòu)成，兩株霉菌是從腐爛的菜粕中分離而得，序列鑒定結(jié)果為橫梗霉屬(Lichtheimia sp.JN3C)和土曲霉(Aspergillus terreus)。橫梗霉屬已于2010年5月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC M2010114。一株熱帶假絲酵母菌由江南大學生工學院友情提供。
2.如權(quán)利1所述的復合菌系的應用，其特征在于所用的復合菌系用于降解菜籽粕中 硫試。
3.如權(quán)利1所述的復合菌系的應用，其特征在于所用的復合菌系用于降解菜籽粕中 的粗纖維。
4.如權(quán)利1所述的復合菌系的應用，其特征在于所用的復合菌系用于提高菜籽粕中 的蛋白含量。
5.如權(quán)利1所述的復合菌系，其特征在于土曲霉、橫梗霉屬和熱帶假絲酵母的復配比 為 0. 6ml 0. 8ml 1. 0ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種降解硫代葡萄糖甙(簡稱硫甙)的復合菌系，這種復合菌系由兩株霉菌和一株熱帶假絲酵母復配而成。兩株霉菌是從腐爛的菜籽粕中篩選而得，序列鑒定的結(jié)果分別為橫梗霉屬(Lichtheimia sp.JN3C)和土曲霉(Aspergillus terreus)。橫梗霉屬(Lichtheimia sp.JN3C)已于2010年5月13日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。保藏編號為CCTCCM2010114。熱帶假絲酵母由江南大學生物工程學院友情提供。本發(fā)明屬于微生物應用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明還公開了這種復合菌系在降解菜籽粕中硫甙、粗纖維和提高蛋白中的應用。土曲霉、橫梗霉屬和熱帶假絲酵母的復配比為0.6ml∶0.8ml∶1.0ml，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后對菜籽粕中的硫甙降解率達到90％以上，蛋白含量提高到48.47％(干基)，粗纖維含量從14.5％(干基)降低到2.78％。在菜籽粕的生物脫毒和品質(zhì)改良中具有很好的利用價值。
文檔編號C12N1/00GK101899396SQ20101018470
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者王興國, 王小三, 金青哲 申請人:江南大學