專利名稱：載有干擾核糖核酸的細胞微粒子、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及載有干擾核糖核酸的細胞微粒子、制備方法及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明 涉及提供載有干擾核糖核酸的細胞微粒子，將干擾核糖核酸負載于細胞微粒子的方法，以 及此方法在生物醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)改良及疾病預(yù)防/治療中的作用。
背景技術(shù)：
細胞微粒子(microvesicles)是一類大小在10-500nm之間，具有脂質(zhì)雙層膜的 生物囊泡結(jié)構(gòu)。早在1967年就有報道，當(dāng)時被稱為“platelet dust”，其來源于血小板， 包含囊泡，具有促進凝結(jié)的作用。體外研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、血小板、白細 胞、淋巴細胞、紅細胞等都能釋放微粒子。根據(jù)微粒子產(chǎn)生的途徑，又可以將微粒子區(qū)分為 exosomes禾口 shedding vesicles。Exosomes是細胞在被朿Ij激的情況下，通過多囊泡小體 (Multivesicular bodies，MVBs)胞吐到細胞外的，而 shedding vesicles 則是直接從細 胞表面以出芽的方式分泌出來的。目前，不同細胞分泌的shedding vesicles被命名為不 同的名稱，比如中性粒細胞和單核細胞分泌的被稱為ectosomes，而血小板分泌的則被稱為 microparticleso細胞微粒子的膜成分取決于其來源的細胞，主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，但細胞微 粒子的內(nèi)部成分尚不清楚。細胞微粒子的質(zhì)膜含有來源細胞的特征，即來源細胞表面特異 性的分子標(biāo)記以及細胞受體/配體。細胞微粒子明確的生理功能至今尚未研究清楚。干擾核糖核酸(small interfering RNA, siRNA)是一類由20多個核苷酸組成的 雙鏈RNA分子，可以通過特異性降解靶基因的信使核糖核酸(messager RNA, mRNA)起到沉 默基因表達的作用。這一過程被稱為RNA干擾(RNA interference，RNAi)。RNA干擾是基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種方式，是生物界古老而且進化的高度保守的現(xiàn) 象之一。通過siRNA介導(dǎo)的識別，并靶向切割同源性靶mRNA的方式，特異性高效抑制基因 表達。RNA干擾具有生物催化反應(yīng)特征，反應(yīng)中需要多種蛋白因子以及ATP參與。近幾年來RNA干擾研究取得了突破性進展，被《Science》雜志評為2001年的十大 科學(xué)進展之一，并名列2002年十大科學(xué)進展之首。由于使用RNA干擾技術(shù)可以特異性剔除 或關(guān)閉特定基因的表達，所以該技術(shù)已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)實驗研究及各種疾病的^MM 茳領(lǐng)域。在RNA干擾技術(shù)出現(xiàn)以前，基因敲除(gene knockout)是主要的反向遺傳學(xué) (reverse genetics)研究手段，但其技術(shù)難度高，操作復(fù)雜，周期長。由于RNA干擾可以利 用siRNA或siRNA表達載體快速、經(jīng)濟、簡便的同時又具有高度的序列專一性，可以特異地 使特定基因沉默，獲得功能喪失或減低突變序列特異方式剔除目的基因表達，所以現(xiàn)在已 經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。在功能基因組研究中，需要對特定基因功能喪失或 減低突變，以確定其功能，因此RNA干擾可以作為一種強有力的研究工具，用于功能基因組 的研究。同時siRNA表達文庫構(gòu)建方法的建立，使得RNA干擾技術(shù)進行高通量篩選成為可 能，對闡明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點有重要意義。
RNA干擾技術(shù)也被廣泛應(yīng)用與治療疾病領(lǐng)域。在利用RNA干擾技術(shù)對HIV- 1、乙型 肝炎、丙型肝炎等進行基因治療研究中發(fā)現(xiàn)，選擇病毒基因組中與人類基因組無同源性的 序列作為抑制序列可在抑制病毒復(fù)制的同時避免對正常組織的毒副作用。同時將抑制序列 選擇在特定的位點，可對部分有明確基因突變的惡性腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)作用。此外尚 可通過使用腫瘤特異性啟動子，引導(dǎo)針對某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表達， 從而達到特異性殺傷腫瘤細胞的目的。由于RNA干擾是針對轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默，相對于傳統(tǒng)基因治療對基因水平上 的敲除，整個流程設(shè)計更簡便，且作用迅速，效果明顯，為基因治療開辟了新的途徑。其總體 思路是通過加強關(guān)鍵基因的RNA干擾機制，控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進程或外源致 病核酸的復(fù)制及表達，尤其針對引起一些對人類健康嚴重危害的核酸病毒。目前，研究已經(jīng)證明，SiRNA能有效地抑制HIV病毒在體外培養(yǎng)細胞中的復(fù)制。 siRNA可以通過抑制HIV病毒自身基因Gnple，gag，rev，tat*env)或宿主基因(如HIV 的主要受體CD4)達到阻止HIV感染的目的。同時研究發(fā)現(xiàn)，在兩種自身免疫性肝炎的小鼠 模型中靜脈注射抑制Fas的siRNA進入小鼠，肝細胞中的Fas mRNA及蛋白質(zhì)水平均降低， 故保護了肝細胞免受自身免疫肝炎引起的細胞凋亡的傷害。更有研究發(fā)現(xiàn)利用RNA干擾 去沉默P53基因，可以抑制腫瘤細胞從良性到惡性的轉(zhuǎn)化。雖然RNA干擾已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究各個方面，但目前該技術(shù)仍有一些難以 解決的問題。例如，應(yīng)用現(xiàn)有的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，siRNA進入某些細胞，如免疫細胞的效率 非常低。這就影響其在這一領(lǐng)域的進一步應(yīng)用。同時，盡管siRNA藥物的研究開發(fā)取得了不少成果，但要將其作為藥物真 正用于醫(yī)療還面臨很多問題。雖然可以直接將siRNA注射到動物體內(nèi)，但是這種沒 有經(jīng)過包裹的siRNA的半衰期極短，治療效果差強人意。目前，siRNA藥物運送的 載體主要有脂質(zhì)體、毫微型膠襄(Nanocapsules/Nanoparticles)、β環(huán)糊精包含物 (β-cyclodextrininclusionCompound或稱β環(huán)糊精膠襄)等，雖然可以延長藥物在體內(nèi) 的存留時間并一定程度上提高siRNA藥物的吸收率，但是其傳送藥物的靶向性和高效性仍 然不足。如何對人進行有效的給藥，既能確保藥效在靶器官靶組織有效釋放，還要具有高度 安全性等等問題都尚需進一步研究。siRNA作為生物、醫(yī)學(xué)研究的重要手段以及潛在的藥物，目前還存在一些未解決的 問題，遞送siRNA的特異性(靶向性)差、穩(wěn)定性差、效率低是妨礙其應(yīng)用的主要原因，因 此，迫切需要一種更加穩(wěn)定、高效、特異的運送siRNA的方式，高效地、特異性地傳送siRNA。申請人:意外地發(fā)現(xiàn)細胞微粒子是一種在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運效率高，特異性強的生物 囊泡載體。這些細胞微粒子大小不一，分布在10-500納米范圍。原則上不同細胞釋放的微 粒子的膜表成分(包括特異性表面受體及膜脂結(jié)構(gòu))與對應(yīng)細胞的質(zhì)膜成分相同。因此，細 胞微粒子帶有來源細胞表面特有的受體蛋白或膜脂結(jié)構(gòu)，與對應(yīng)的靶細胞有高親和性。如 果采用細胞微粒子作為運送siRNA的載體，就可以高效率、選擇性地遞送siRNA到靶細胞/ 組織，從而大大提高siRNA調(diào)控細胞功能的作用。顯然，由于細胞微粒子(包括所有具有細 胞微粒子特征的膜脂囊泡結(jié)構(gòu)，比如exosome和shedding vesicles以及針對各種細胞分 泌的shedding vesicles的特稱)本身具有和特定組織及細胞結(jié)合的特異性，其所載siRNA 也呈現(xiàn)較強的靶向性、穩(wěn)定性及高效率，它在疾病機制的研究及治療方面有重大應(yīng)用前景。
發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)以細胞微粒子作為載體運送干擾核糖核酸(microRAN)進入靶 細胞，由于細胞微粒子是細胞自身分泌的物質(zhì)，具有生物親和性，不會對生物體本身造成傷 害；同時，由于細胞微粒子表面攜帶了來源細胞特異的表面分子，對其靶細胞具有高親和 性，因此可以高效、特性地進入靶細胞。進入靶細胞的干擾核糖核酸可以發(fā)揮其功能，通過 與靶基因信使核糖核酸特定序列的結(jié)合，阻斷靶基因蛋白質(zhì)翻譯過程，從而起到特異性阻 斷基因表達的作用。應(yīng)用細胞微粒子作為載體運送SiRNA的優(yōu)勢在于首先，細胞微粒子來源于細胞， 是生物體本身存在的，從而可以克服目前人工合成的藥物載體對細胞的毒性以及對身體的 損害；其次，將siRNA包裹進入細胞微粒子的過程中所應(yīng)用的各種技術(shù)手段都很容易實現(xiàn)， 同時包裹效率很高，這在一定程度上加大了其實際應(yīng)用的潛力；更重要的是細胞微粒子是 具有雙層質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡結(jié)構(gòu)，外膜和細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)類似，可以通過和細胞膜融合、胞吞作 用進入細胞。同時，由于細胞微粒子膜表面攜帶有來源細胞的質(zhì)膜表面的分子標(biāo)記物，如 表面蛋白、各種受體/配體等，可以通過特異性的識別，高效地進入靶細胞。如果應(yīng)用病人 自身組織或細胞的原代培養(yǎng)物分泌的細胞微粒子包裹siRNA還可減少免疫排斥并進一步 提高細胞微粒子攜帶siRNA進入生物體的效率?；谝陨蟽?yōu)勢，細胞微粒子作為載體運送 siRNA作為藥物將會在藥物開發(fā)及臨床疾病的預(yù)防和治療中起到重要的作用。發(fā)明概述 本發(fā)明提供了含有干擾核糖核酸的細胞微粒子。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，包括含有干擾核糖核酸的細胞微粒子和藥物上可 用的載體。本發(fā)明進一步提供了一種試劑盒，其中包括含有干擾核糖核酸的細胞微粒子或者 含有含有干擾核糖核酸的細胞微粒子的藥物組合物，以及使用說明。本發(fā)明此外還提供了一種制備含有干擾核糖核酸的細胞微粒子的方法，包括下列 步驟應(yīng)用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將干擾核糖核酸轉(zhuǎn)入細胞；或病毒載體法將干擾核糖核酸轉(zhuǎn)入 細胞；分離含有干擾核糖核酸的細胞微粒子。本發(fā)明還提供了一種研究方法，包括將siRNA及其對照序列導(dǎo)入供體細胞內(nèi)，優(yōu)選通過轉(zhuǎn)染或病毒載體法；分離含有干擾核糖核酸的細胞微粒子；將該含有干擾核糖核酸的細胞微粒子加入受體，優(yōu)選受體細胞；研究該含有干擾核糖核酸的細胞微粒子進入受體細胞后的影響。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或治療疾病的方法，包括將含有干擾核糖核酸的 細胞微粒子轉(zhuǎn)入受體。本發(fā)明還提供了含有干擾核糖核酸的細胞微粒子在輸送干擾核糖核酸中的用途。


圖1顯示正常人血清/血漿細胞微粒子的透射電鏡圖。圖2-A Real time-PCR方法檢測c_myb基因siRNA干擾效率
圖2-B流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率的結(jié)果圖2-C熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率的結(jié)果圖3-A顯示流式細胞法檢測細胞微粒子圖3-B顯示流式細胞法檢測含有SiRNA的細胞微粒子圖3-C顯示SiRNA以細胞微粒子作為載體進入靶細胞圖4-A顯示SiRNA在靶細胞特異性將靶蛋白表達量下調(diào)圖4-B顯示未含有SiRNA的細胞微粒子對靶細胞遷移能力的影響圖4-C含有SiRNA的細胞微粒子對靶細胞遷移能力的影響圖4-D顯示含有SiRNA的細胞微粒子對靶細胞遷移能力影響的統(tǒng)計結(jié)果圖5含有SiRNA的細胞微粒子對HIV病毒的抑制作用
具體實施例方式含有干擾核糖核酸的細胞微粒子細胞微粒子包括各種大小在10-500nm之間，由細胞分泌的具有脂質(zhì)雙層膜的天 然生物囊泡，包括通過多囊泡小體(Multivesicular bodies, MVBs)分泌的Exosome ；細胞 以出芽方式分泌的shedding vesicles以及針對各種細胞分泌的shedding vesicles的特 稱。細胞微粒子包括來自人或動物的各種細胞產(chǎn)生的細胞微粒子，特別地，包括正常 的或者患病的人或動物的細胞，可以是原代培養(yǎng)物、傳代培養(yǎng)物(細胞系)，例如內(nèi)皮細胞、 血管平滑肌細胞、血小板、白細胞、淋巴細胞和紅細胞。SiRNA包括所有針對受體基因設(shè)計的通過RNA干擾原理特異性降解靶基因的 siRNA序列。本發(fā)明還提供了可用于疾病治療的藥物組合物及試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包括含有干擾核糖 核酸的細胞微粒子以及藥物上可用的載體。載體例如包括生理鹽水、血清、細胞培養(yǎng)液、磷 酸鹽緩沖液(PBS)等。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其中包括含有干擾核糖 核酸的細胞微粒子或者含有含有干擾核糖核酸的細胞微粒子的藥物組合物，以及使用說 明。使用含有干擾核糖核酸的細胞微粒子或者含有該含有干擾核糖核酸的細胞微粒 子的藥物組合物或試劑盒能夠預(yù)防和/或治療的疾病包括各種腫瘤；各種急慢性傳染病， 例如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等病毒性疾病，例如結(jié)核、細菌性肺炎等細菌 性疾病，以及其它各種病原微生物導(dǎo)致的急慢性傳染?。黄渌甭约膊?，例如呼吸系統(tǒng)疾 病，免疫系統(tǒng)疾病，血液與造血系統(tǒng)疾病，循環(huán)系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝性疾病，消化系統(tǒng) 疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，泌尿系統(tǒng)疾病，生殖系統(tǒng)疾病和運動系統(tǒng)疾病。
本發(fā)明此外還提供了一種制備含有干擾核糖核酸的細胞微粒子的方法，包括下列 步驟應(yīng)用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將干擾核糖核酸轉(zhuǎn)入細胞；或病毒載體法將干擾核糖核酸轉(zhuǎn)入細胞；分離含有干擾核糖核酸的細胞微粒子。制備細胞微粒子的方法包括，例如差速離心法、免疫吸附法和超濾法。優(yōu)選采用差速離心法制備細胞微粒子，例如包括下述步驟先將體液、血液、細胞、組織、體外培養(yǎng)的細胞或組織離心，除去各類細胞及碎片，然后將上清超速離心，取沉淀便 是細胞微粒子?；蛘邇?yōu)選地，使用免疫吸附法制備細胞微粒子，例如包括以下步驟(1)先將體 液、血液、細胞、組織、體外培養(yǎng)的細胞或組織離心，去除各種細胞及碎片，取上清；(2)將吸 附在組織培養(yǎng)皿上的細胞特異性的抗體或免疫磁珠(Invitrogen，美國)與上清溫育(例如 30 60分鐘)，得到被吸附的細胞微粒子?；蛘邇?yōu)選地，采用例如包括以下步驟的超濾法(1)先將體液、血液、細胞、組織、體外培養(yǎng)的細胞或組織離心去除各種細胞及碎 片，取上清；(2)將上清放入帶有100KD濾膜的濃縮離心管(Millipore，美國)，于4000轉(zhuǎn)/ 分鐘進行離心，濃縮即得細胞微粒子。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種制備負載有SiRNA的細胞微粒子的方法，該微粒子可 以高效、特異進入受體細胞或生物體，通過siRNA干擾其靶基因的蛋白表達。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，該方法包括1)將siRNA包裹進入供體細胞微粒子；2)分離供體細胞分泌的細胞微粒子；3)檢測細胞微粒子中siRNA的裝載效率；4)將含有siRNA的細胞微粒子引入受體，例如受體細胞，優(yōu)選注(射)入生物體。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，制備含有干擾核糖核酸的細胞微粒子的方法包 括1)設(shè)計針對靶基因的siRNA序列；2)化學(xué)合成成熟siRNA或構(gòu)建siRNA表達載體；3)應(yīng)用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將siRNA轉(zhuǎn)入細胞或?qū)iRNA表達載體轉(zhuǎn)入細胞。優(yōu)選，靶基因siRNA序列的設(shè)計遵守以下原則(1) siRNA 片段滿足 AAm9TT，NAN19NN，NARN17YNN 和 NANN17YNN(N 代表任何堿基， R和Y分別代表嘌呤和嘧啶)。(2)選擇無重復(fù)序列的互補DNA外顯子序列以及具有均衡A、G、C、T含量(或GC 含量在30% 70% )的反義鏈。(3)避開序列中有成串的單一堿基，尤其是G堿基。(4)避開3'和5'端未翻譯的區(qū)域(5' -UTR,3' _UTR)，通常這些位點是mRNA 結(jié)合蛋白的結(jié)合位點。(5)避開起始密碼子或者外顯子與外顯子的交界區(qū)域(exon-exonboundaries)。i殳 if 白勺 siRNA 歹[J $ _ ffl NCBI (National Center for BiotechnologyInfermation)的 EST 或 Unigene 數(shù)據(jù)庫進行 BLAST 檢索，以保證 siRNA 序列 對靶基因的特異性。設(shè)計4個以上siRNA序列，進行化學(xué)合成后，通過實驗篩選出沉默效果最好的siRNA序列，進行下一步的基因功能研究。
優(yōu)選，構(gòu)建siRNA表達載體的方法包括將長約70bp的含有特定莖環(huán)以及終止信 號的DNA分子插入到特定載體中。優(yōu)選，轉(zhuǎn)染siRNA的方法采用脂質(zhì)體(Invitrogen公司Lipofectamine2000)法。細胞微粒子的制備方法選自差速離心法、免疫吸附法和超濾法中的一種或多種。檢測細胞微粒子中siRNA裝載效率的方法選自RT-PCR、Realtime-PCR, Northern blot、免疫熒光、流式細胞法中的一種或多種。RT-PCR方法，例如包括以下步驟(1)提取RNA干擾后的細胞/組織總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；(2)應(yīng)用靶基因特異性引物進行PCR反應(yīng)；(3)進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；(4) EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。Real-time PCR方法，例如包括以下步驟(1)提取RNA干擾后的細胞/組織，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；(2)設(shè)計靶基因特異性引物；(3)加入熒光探針進行PCR反應(yīng)；Northern blotting方法，例如包括以下步驟(1)收集血清/血漿及細胞、組織樣本；(2)通過Trizol試劑提取總RNA ；(3)進行變性PAGE電泳和膜轉(zhuǎn)移實驗；(4)制備同位素標(biāo)記靶基因探針；(5)進行膜雜交反應(yīng)；(6)同位素信號檢測如磷屏掃描檢測結(jié)果。免疫熒光方法，例如包括以下步驟(1)將細胞附著在支持物上；(2)應(yīng)用細胞固定劑如多聚甲醛等，將細胞固定；(3)應(yīng)用脫脂牛奶或牛血清白蛋白對細胞進行封閉；(4)應(yīng)用熒光標(biāo)記抗體標(biāo)記特異性靶基因蛋白；(5)熒光顯微鏡下觀測細胞熒光強度。受體細胞包括現(xiàn)有所有細胞系、細胞株、以及正常人或疾病患者自身組織/細胞 的原代培養(yǎng)物。細胞微粒子能夠進入的生物體包括人類、各種動物及各種致病微生物。動物包括 軟骨魚、硬骨魚、兩棲動物、爬行動物、鳥類及哺乳類，致病微生物包括細菌、螺旋體、支原 體、立克次體、衣原體和放線菌。特別的，所述致病微生物包括各DNA及RNA病毒，如乙肝病 毒、天花病毒、艾滋病病毒、SARS病毒、流感病毒等。本發(fā)明還提供了一種研究方法，包括通過轉(zhuǎn)染將SiRNA及其對照序列導(dǎo)入供體細胞內(nèi)；分離含有siRNA的細胞微粒子；將該含有siRNA的細胞微粒子加入受體細胞；
研究該含有siRNA的細胞微粒子進入受體細胞后的影響。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，應(yīng)用攜帶siRNA的細胞微粒子進行基因功能研究的方法包括(1)通過轉(zhuǎn)染將siRNA及其對照序列導(dǎo)入供體細胞內(nèi)；(2)分離制備含有siRNA的供體細胞微粒子；(3)將細胞微粒子加入受體細胞；(4)研究細胞微粒子攜帶siRNA進入受體細胞后對受體細胞功能的影響，從而研 究其靶基因?qū)毎δ艿挠绊懀谎芯亢衧iRNA的細胞微粒子進入受體后對受體細胞功能的影響的方法包括共 聚焦熒光顯微鏡法、Western bloting方法、細胞遷移方法的一種或幾種。例如，Western blot方法包括以下步驟(1)應(yīng)用蛋白質(zhì)裂解液提取細胞或組織總蛋白；(2)進行SDS-PAGE電泳和膜轉(zhuǎn)移實驗；(3)應(yīng)用脫脂牛奶或牛血清白蛋白對膜進行封閉；(4)應(yīng)用HRP標(biāo)記過的特異性抗體，對膜上的特異性靶基因蛋白進行標(biāo)記；(5)加HRP底物，產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)；(6)放射自顯影。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或治療疾病的方法，包括將含有干擾核糖核酸的 細胞微粒子轉(zhuǎn)入受體。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，應(yīng)用攜帶SiRNA的細胞微粒子預(yù)防/治療疾病的方 法包括1)通過轉(zhuǎn)染將siRNA導(dǎo)入供體細胞內(nèi)；2)分離制備含有siRNA的供體細胞微粒子；3)將細胞微粒子加入受體細胞或注入病人體內(nèi)。4)細胞微粒子攜帶SiRNA進入受體細胞或病人組織，通過干擾其靶基因表達，弓丨 起靶基因蛋白質(zhì)含量的改變。5)通過改變細胞內(nèi)蛋白質(zhì)影響細胞功能，從而起到預(yù)防/治療疾病的作用。疾病包括各種腫瘤；各種急慢性傳染病，例如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、 SARS等病毒性疾病，例如結(jié)核、細菌性肺炎等細菌性疾病，以及其它各種病原微生物導(dǎo)致的 急慢性傳染病；其它急慢性疾病，例如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，血液與造血系統(tǒng)疾病， 循環(huán)系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝性疾病，消化系統(tǒng)疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，泌尿系統(tǒng)疾病，生殖 系統(tǒng)疾病和運動系統(tǒng)疾病。siRNA包括所有針對致病基因設(shè)計的通過RNA干擾原理特異性降解靶基因的 siRNA序列；基因包括所有能轉(zhuǎn)錄成有功能分子的基因片段，例如蛋白質(zhì)基因、mciroRNA基因 等。致病基因包括人類，各種動物，包括軟骨魚、硬骨魚、兩棲動物、爬行動物、鳥類及哺乳動 物等生物自身參與疾病發(fā)生發(fā)展的各種基因，以及各種致病微生物基因。上述致病微生物包括細菌、螺旋體、支原體、立克次體、衣原體和放線菌。特別的， 所述致病微生物包括各種DNA及RNA病毒，如乙肝病毒、天花病毒、艾滋病病毒、SARS病毒、流感病毒等。本發(fā)明還提供了含有干擾核糖核酸的細胞微粒子在輸送干擾核糖核酸中的用途。 實施例可以理解的是，在此描述的特定實施方式通過舉例的方式來表示，其并不作為對 本發(fā)明的限制。在不偏離于本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實施方 式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會意識到或能夠確認，使用常規(guī)實驗，許多等同物都能應(yīng)用于本文 所描述的特定步驟中。這些等同物被認為處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且被權(quán)利要求所覆蓋。實施例1血清/血漿和細胞培養(yǎng)液中細胞微粒子的分離及檢測本實施例分別采用差速離心法方法分離出血清/血漿和細胞培養(yǎng)液中細胞微粒 子具體地，先將血清/血漿或培養(yǎng)細胞于300g離心5分鐘，取上清；(2)將上清于 1500g離心20分鐘，取上清；(3)將上清于10000g離心30分鐘，取上清。(4)將上清于 llOOOOg離心70分鐘，取沉淀即為細胞微粒子。將分離得到的細胞微粒子在透射電鏡下觀察，包括細胞微粒子沉淀用2. 5%戊 二醛固定液在4°C固定過夜，PBS漂洗三遍，每遍10分鐘。之后用的四氧化鋨室溫固定 60分鐘。固定后的樣品用10%的明膠包埋，然后在4°C用戊二醛再固定后，將樣品切成小塊 (體積小于1立方毫米)。樣品用依次增高濃度的乙醇溶液脫水(30%，50%，70%，90%， 95% andl00% X3)。用環(huán)氧樹脂浸透包埋后，用Leica UC6超薄切片機切片，最后用FEI Tecnai T20透射電子顯微鏡在120kV條件下觀察。采用差速離心法分離得到細胞微粒子的透射電鏡圖如圖1所示，顯示從正常人血 清/血漿中分離到的細胞微粒子大小不一，分布在10-500nm范圍。實施例2siRNA轉(zhuǎn)染進入供體細胞本實施例采用以下步驟將熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染進入細胞，并檢測轉(zhuǎn)染效率。首先針對人c-myb基因序列的不同位點設(shè)計siRNA序列(正義鏈 + 環(huán) + 反義鏈)5' -GGTGGAACAGAATGGAACATTGAAGAAG TGTTCCATTCTGTTCCACC TT-3，；同時設(shè)計一條隨機序列作為陰性對照(正 義 鏈 + 環(huán) + 反 義 鏈)5，-GACTTCATAAGGCGCATGC TTGAAGAAGGCATGCGCCTTATGAAGTC TT-3’ .接下來，商業(yè)合成上述設(shè)計的siRNA，同時采用綠色熒光染料FITC標(biāo)記針對c-myb 基因的siRNA。采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國)將siRNA轉(zhuǎn)染進入人單核/ 巨噬細胞系THP-1細胞(中國科學(xué)院上海細胞庫)，具體方法如下(l)THP-l細胞培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清(Gibco，美國)的RPMI 1640培養(yǎng)基 (Gibco，美國)中，5% C02、37°C培養(yǎng)。(2)將 30 u 1 lipofectamine 2000 和 600pmol 的陰性對照 siRNA 分別與 lml 0PTI-MEM(Gibco，美國)混合，形成混合物A和混合物B，室溫下放置5min。(3)將 30ii 1 lipofectamine 2000 禾P 600pmol 的 c_myb siRNA 分另ij 與 lml0PTI-MEM(Gibco，美國)混合，形成混合物C和混合物D，室溫下放置5min。(4)將混合物A和混合物B混合，生成混合物E，放置20min。(5)將混合物C和混合物D混合，生成混合物F，放置20min。(6)將混合物E和F分別加入對照組和實驗組細胞中，補足0PTI-MEM到15ml。5 % C02、37°C 培養(yǎng)。(7)6小時后更換成正常培養(yǎng)液。(8)24h 48h后轉(zhuǎn)染結(jié)束，可以收集樣品。采用Real time-PCR方法檢測c_myb基因信使RNA水平以檢測干擾效率，包括(1)收集轉(zhuǎn)染后的THP-1細胞(2)制備cDNA樣品采用Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取總RNA,總RNA逆 轉(zhuǎn)即得到cDNA樣品。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4 ill 5\々1^緩沖液、2111 10mM each dNTP mixture (Takara，曰本)、0. 5 ii 1 RNase Inhibitor(Takara，曰本)、2 ii 1 AMV(Takara, H 本)以及0. 5iil01igodT(Takara，日本)。反應(yīng)步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)1小時， 85°C孵育5分鐘；(3) Real-time PCR 反應(yīng)取 1 ii 1 cDNA,加入 0. 3 ii 1 Taq 酶(Takara，日 本)，0. 5ii 1 10iiM 正向和反向引物，1. 2ii 1 25mM MgCl2,1. 6u 1 2. 5mM eachdNTP mixture (Takara，日本)，1 ii 1 20XEVA GREEN, 2 u 1 10\卩0 緩沖液，12.41111120，20111體 系進行PCR。儀器使用的是ABI Prism 7300熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為95°C、5分鐘進行 1個循環(huán)一95 V、15秒，60°C、1分鐘進行40個循環(huán)；(4)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理方法為ACT法，A 為反應(yīng)達到域值時的循環(huán)數(shù)，則兩 組樣品干擾核糖核酸的比較可以用方程2_ACT表示，其中ACT = CTgMupl_CTgraup2。組織和細 胞數(shù)據(jù)處理方法是以U6作為內(nèi)標(biāo)，則兩組樣品mRNA表達量的比較可以用方程2_ACT表示，
其中 A CT — [CTmiENA_CT U6] groupl- tCT miRNA_CT U6] group2 °結(jié)果如圖2-A所示，與轉(zhuǎn)染過隨機序列的陰性對照(左柱)相比，轉(zhuǎn)染過 c-mybsiRNA的細胞中c_myb基因的m RNA表達量顯著降低，說明該實驗中采用的轉(zhuǎn)染方法 的可靠而高效的。同時采用流式細胞法檢測siRNA進入細胞的效率，結(jié)果如圖2-B所示。流式細胞法 包括下述步驟收集干擾后的THP-1細胞，將細胞濃度調(diào)整到106個/ml ；應(yīng)用流式細胞儀檢 (BD FACS，Calibur)測細胞熒光強度，檢測時前向側(cè)向電壓放大模式均為lin，采用FL1-H 檢測熒光強度，F(xiàn)L-1H通道電壓放大模式為log。由結(jié)果可以看出，與對照(細線)相比，轉(zhuǎn) 染了 c-myb siRNA的實驗組(粗線)的熒光強度增強，說明siRNA的轉(zhuǎn)染效率高，此種方法 是一種檢測siRNA轉(zhuǎn)染效率的直觀高效的方法。另外，還可以采用熒光顯微鏡方法檢測siRNA進入受體細胞的效率，具體步驟包 括將轉(zhuǎn)染過c-myb siRNA后的THP-1細胞置于熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS)載物臺，激發(fā)波 長488nm檢測。結(jié)果如圖2-C所示，轉(zhuǎn)染過的細胞可顯示綠色熒光(如圖2-C中亮點所示)，說明 siRNA進入細胞的效率很高。實施例3細胞微粒子攜帶siRNA進入受體細胞本實施例通過收集轉(zhuǎn)染過c-myb siRNA的THP-1細胞的細胞微粒子，檢測其裝載siRNA的效率，并將其加入其靶細胞，檢測其進入靶細胞的效率。選擇在炎癥反應(yīng)中起重要作用的人單核細胞/巨噬細胞系THP-1作為研究對象， THP-1細胞培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清(Gibco，美國)的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，美國) 中，5%C02、37°C下培養(yǎng)。首先，應(yīng)用實施例2中的siRNA轉(zhuǎn)染方法，制備轉(zhuǎn)染過c-myb siRNA 的THP-1細胞。接下來，應(yīng)用實施例1中細胞微粒子的分離方法，分離轉(zhuǎn)染過c-mybsiRNA的THP-1 細胞微粒子。再通過流式細胞法檢測所分離的細胞微粒子裝載siRNA的效率。結(jié)果如圖3-A所示。檢測時前向側(cè)向電壓放大模式均為log，采用FL1-H檢測熒光 強度，F(xiàn)L-1通道電壓放大模式為log。從結(jié)果可以看出，在THP-1分泌的細胞微粒子中，有 一部分(圖3-B豎線以右部分)被標(biāo)記熒光標(biāo)記。由于c-myb siRNA被熒光標(biāo)記，因此，應(yīng) 用流式細胞儀檢測微粒子的熒光強度，就可以反映微粒子裝載siRNA的效率。最后將攜帶有c-myb siRNA的THP-1細胞分泌的微粒子加入人微靜脈內(nèi)皮細胞 HMEC-1 (美國佐治亞州疾控中心)的細胞培養(yǎng)液中。HMCE-1HMEC-1培養(yǎng)在添加了 lOng/mL 表皮生長因子(Becton-Dickinson，美國)、10ng/mL氫化可的松(Sigma)和10%胎牛血清 (Gibco，美國)的MCDB-131培養(yǎng)基中，5% C02、37°C下培養(yǎng)。由于在生理狀況下，單核/巨噬細胞可以和血管內(nèi)皮細胞相互作用，單核細胞表 面的分子可以特異性地和內(nèi)皮細胞表面的配體/受體結(jié)合，誘發(fā)一系列信號傳導(dǎo)及細胞生 理活動。因此，應(yīng)用單核/巨噬細胞系THP-1和微靜脈內(nèi)皮細胞系HMEC-1就可以模擬體內(nèi) 這兩種細胞的相互作用。檢測加入了攜帶siRNA的THP-1微粒子進入HMCE-1細胞的效率。由于細胞微粒 子被綠色熒光標(biāo)記，因此，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測HMEC-1熒光結(jié)果，就可以反映微粒子進入 HMEC-1的效率。結(jié)果如圖3-C所示。由結(jié)果可以看出，攜帶siRNA的細胞微粒子可以高效特異性的進入靶細胞 HMEC-1 (圖3-C中亮點)。又由于所有細胞都能夠像血細胞一樣分泌細胞微粒子；并且所有 細胞也可以像內(nèi)皮細胞一樣接受與其特異性作用的細胞分泌的細胞微粒子。因此，THP-1細 胞微粒子進入HMEC-1細胞的作用方式也可模擬生物體上所有細胞微粒子進入其靶細胞的 作用方式。通過以上的實驗結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，細胞微粒子是理想的穩(wěn)定、高效、特異運載siRNA 的載體，可以通過細胞微粒子將siRNA傳遞給其受體細胞。提示可以通過微粒子，將作為藥 物的siRNA高親和性、特異性的遞送到靶細胞中，通過影響參與疾病發(fā)病的靶細胞的功能， 達到藥物預(yù)防/治療的目的。實施例4應(yīng)用攜帶siRNA的細胞微粒子研究基因功能本實施列應(yīng)用細胞微粒子將針對靶基因的siRNA高效、特異性地轉(zhuǎn)入受體細胞 中，通過特異性降低受體細胞中靶基因的表達，模擬病理狀況或起到基因敲除的作用，以研 究靶基因在細胞中的生理功能。本實施例選擇了 c-myb基因作為研究對象，c_myb基因編碼一個細胞轉(zhuǎn)錄因子，在 細胞的分化、增殖、遷移及血細胞的存活中發(fā)揮重要作用。c-myb已被證明是一個重要的原 癌基因，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。
12
為了研究c-myb基因在內(nèi)皮細胞中的功能，設(shè)計了如下實驗1)應(yīng)用實施例2中的siRNA轉(zhuǎn)染方法，制備轉(zhuǎn)染過c_myb siRNA的THP-1細胞。2)應(yīng)用實施例1中細胞微粒子的分離方法，分離轉(zhuǎn)染過c-myb siRNA的THP-1細 胞微粒子3)將攜帶有c-myb siRNA的細胞微粒子加入到HMEC-1細胞的培養(yǎng)液中，6小時后 收集細胞，按照以下步驟進行Western Blot實驗。具體步驟包括(1)應(yīng)用蛋白質(zhì)裂解液提取細胞總蛋白；(2)在90V恒壓條件下進行SDS-PAGE電泳；(3)在160mA恒流條件下進行膜轉(zhuǎn)移實驗；(4)應(yīng)用5%脫脂牛奶對膜進行封閉；(5)分別應(yīng)用抗c-myb的單克隆抗體(Santa Cluz公司)和抗GAPDH (Santa Cluz 公司)的單克隆抗體分別對c-myb和GAPDH進行標(biāo)記。(6)加對應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗；(7)加HRP底物，產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)；(8)放射自顯影。由于siRNA通過與其靶基因mRNA結(jié)合，招募細胞內(nèi)的沉默復(fù)合物將其靶基因mRNA 被降解，從而導(dǎo)致其靶基因蛋白表達水平的下降。因此，通過檢測特異性蛋白表達水平的 Western blot技術(shù)就可以檢測siRNA進入受體細胞的效率。結(jié)果如圖4-A所示。由結(jié)果可見，GAPDH作為內(nèi)參，證明Western blot過程中加入 的總蛋白量在所有條帶中都是一樣的。同時，與轉(zhuǎn)染陰性對照的細胞(條帶2)相比，轉(zhuǎn)染 過c-myb siRNA的細胞(條帶3)中c-myb蛋白的表達有明顯下降。由此，本發(fā)明人證明 細胞微粒子攜帶的c-mybsiRNA進入了 HMEC-1細胞，并且對HMEC-1細胞中c_myb蛋白的表 達起到了干擾作用。進一步證明了，細胞微粒子可以將siRNA高效、特異性的進入靶細胞， 以此作為一種實驗手段，研究基因在特定細胞中的功能。同時本實施例還檢測了微粒子攜帶的siRNA對其靶細胞HMEC-1細胞遷移能力的影響。c-myb基因作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，對細胞的生長、遷移和分化有重要影響。雖 然研究已經(jīng)證明c-myb對多種細胞的遷移有明顯調(diào)控作用，然而，其對于內(nèi)皮細胞遷移是 否發(fā)揮作用仍然有待研究。因此本實施例通過應(yīng)用細胞微粒子所載siRNA作為一種實驗方法，特異性地降低 內(nèi)皮細胞系HMEC-1細胞中的c-myb蛋白表達，以檢測在這種情況下細胞的遷移功能，以此 研究c-myb基因?qū)?nèi)皮細胞的遷移功能是否有作用。具體實驗步驟包括(1)應(yīng)用實施例2中的siRNA轉(zhuǎn)染方法，制備轉(zhuǎn)染過c_myb siRNA的THP-1細胞。(2)應(yīng)用實施例1中細胞微粒子的分離方法，分離轉(zhuǎn)染過c-mybsiRNA的THP-1細 胞的細胞微粒子(3)攜帶有c-myb siRNA的THP-1細胞微粒子孵育HMEC-1細胞2小時。(4)檢測HMEC-1細胞遷移情況。細胞遷移實驗檢測方法包括將Transwell Boyden Chamber(6. 5mm, Costar,Cambridge, MA，美國)的上面小室底部的聚碳酸酯膜(8-ym孔徑)用0. 的明膠覆蓋； HMEC-1細胞用不含血清的培養(yǎng)基懸起，濃度控制在(1-10) X105cellS/mL ；細胞用或者不用 來源于THP-1細胞的包含siRNA的細胞微粒子孵育2小時，然后將HMCE-1細胞加入上面 的小室，同時在下面的小室加入0. 5mL的含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基；5% C02的細胞培養(yǎng) 箱孵育4h ；遷移到下層的細胞用90%乙醇在室溫下固定15分鐘；洗滌；用0. 的結(jié)晶紫 室溫染色15分鐘；將留在濾膜上的細胞小心地刮下；拍照(Olympus，BX51，Japan)；細胞計 數(shù)。遷移后的細胞顯微圖片如圖4_B\C\D所示。由結(jié)果可見，與陰性對照(圖4-B) 相比，被攜帶c-myb siRNA的細胞微粒子處理過的HMCE-1細胞(圖4-C)的遷移能力明顯 增強。細胞計數(shù)5個隨機視野中的細胞數(shù)，結(jié)果如圖4-D所示，與對照相比，被攜帶c-myb siRNA的細胞微粒子處理過的HMCE-1細胞遷移過的細胞數(shù)顯著能加。由此可見，降低了表達量的c-myb基因能夠顯著增強HMEC-1細胞的遷移能力，因 此，相反的可以說明，c-myb基因?qū)?nèi)皮細胞的遷移有抑制作用。因此，本實施例證明，可以將制備載有siRNA的細胞微粒子及相關(guān)方法作為一種 醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究手段，通過特異性降低細胞內(nèi)某種基因的表達來研究該基因的功能。實施例5應(yīng)用載有siRNA的細胞微粒子進行疾病的預(yù)防/治療本實施例應(yīng)用載有針對艾滋病病毒(HIV)基因的siRNA的細胞微粒子抑制HIV在 其宿主細胞中生存及繁殖。具體包括以下步驟1)針對HIV基因組序列設(shè)計siRNA序列；2)將siRNA序列插入到載體中；3)將攜帶有HIV siRNA的載體轉(zhuǎn)染進入供體細胞293T細胞中；4)收集供體細胞分泌的細胞微粒子；5)將供體細胞分泌的載有HIV siRNA的細胞微粒子加入HIV宿主細胞；6)檢測宿主細胞中病毒含量。結(jié)果如圖5所示，縱坐標(biāo)顯示了 HIV病毒在宿主細胞中的含量。如果將完全不加病 毒的空白細胞作為對照(橫軸1代表的柱子)，將其值設(shè)為1 ；那么單加入病毒而不采取任 何治療措施的細胞(橫軸2代表的柱子)中的病毒含量將會是對照細胞的16倍多。然而， 如果采用載有病毒siRNA的細胞微粒子作為治療手段，宿主細胞內(nèi)的病毒含量就會大量減 少。從結(jié)果可見，加入細胞微粒子所載的siRNA(橫軸5、6代表的柱子)后，宿主細胞內(nèi)的 病毒以降低到40%左右(橫軸6代表的柱子)。更重要的是，如果增加微粒子所載siRNA 的用量(橫軸5代表的柱子)，宿主細胞內(nèi)的HIV病毒甚至可以被完全抑制，HIV病毒的含 量可以下降到和不加病毒組(橫軸1代表的柱子)相同的水平。另外，為了排除載有siRNA的細胞微粒子對HIV的抑制作用是由于載體本身，而不 是siRNA造成的，我們還向HIV病毒感染的宿主細胞中轉(zhuǎn)入了不含siRNA的空白載體作為 另一個對照(橫軸3代表的柱子)。從結(jié)果可以看出，僅空載體無法對HIV病毒產(chǎn)生抑制作 用，也證明了產(chǎn)生病毒抑制作用不是載體而是siRNA本身。同時，我們還加入了一種短肽類的抗艾滋病藥物作為陽性對照(橫軸4代表的柱 子)。由結(jié)果可以看出，這種藥物也只能將HIV含量降低到50%左右。因此，可以看出載有HIV siRNA的細胞微粒與常規(guī)治療艾滋病的藥物相比，其作用效率更高，抑制病毒的效果更 好。也進一步說明應(yīng)用載有siRNA的細胞微粒子治療疾病具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。實施?細胞微粒子及其載有的siRNA組成的藥物組合物的檢定本實施例通過一系列方法檢定細胞微粒子及其載有的siRNA組成的藥物組合物 的存在。1)通過實施例2所述方法將熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染入供體細胞。結(jié)果如圖2_C所 示，在熒光顯微鏡下觀察可見熒光標(biāo)記的siRNA已經(jīng)轉(zhuǎn)染進入細胞。2)通過實施例1所述方法分離鑒定轉(zhuǎn)染過熒光標(biāo)記的siRNA的供體細胞分泌的細 胞微粒子。結(jié)果如圖1所示，可見分離得到的細胞微粒子從形態(tài)、大小、膜結(jié)構(gòu)等方面均符 合細胞微粒子的特定。3)根據(jù)實施例3的方法，通過流式細胞儀檢測分離純化并鑒定為細胞微粒子的顆 粒中是否包裹有siRNA，即是否組成了細胞微粒子和siRNA復(fù)合物，結(jié)果如圖3-B所示。由 于siRNA是被熒光標(biāo)記的，如果細胞微粒子中含有siRNA，那么，細胞微粒子也一定能被熒 光標(biāo)記。因此，我們采用流式細胞術(shù)檢測細胞微粒子所帶的熒光狀況。由圖3-B可見，有大 量細胞微粒子攜帶有熒光(圖3-B豎線以右部分)，證明細胞微粒子中包裹有siRNA，也即 證明了細胞微粒子-siRNA藥物復(fù)合物的存在。本發(fā)明提供了包括(1)載有干擾核糖核酸的細胞微粒子。(2)應(yīng)用細胞微粒子所 載siRNA進行各種臨床疾病(包括各種腫瘤；各種急慢性傳染病，以及其它各種病原微生物 導(dǎo)致的急慢性傳染??；其它急慢性疾病，如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，血液與造血系統(tǒng) 疾病，例如心腦血管疾病的循環(huán)系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)疾病，消化系統(tǒng)疾病，神經(jīng)系統(tǒng) 疾病，泌尿系統(tǒng)疾病，生殖系統(tǒng)疾病和運動系統(tǒng)疾病)治療的研究；(3)應(yīng)用細胞微粒子高 效、特異性遞送干擾核糖核，作為實驗手段，研究特定基因功能。通過上述一系列的研究，很清楚本發(fā)明提供了一種制備載有干擾核糖 核酸的細胞 微粒子的方法，該方法具有較高靶向性、穩(wěn)定性及高效性。根據(jù)上述方法，本發(fā)明人證明SiRNA可以通過細胞微粒子穩(wěn)定、高效、特異性的進 入靶細胞，通過作用于其靶基因，對靶細胞的功能產(chǎn)生一定影響。由此，載有siRNA的細胞 微粒子不僅可以作為一種生物醫(yī)學(xué)研究手段，在基因功能研究中發(fā)揮作用；同時還能作為 藥物，高效特異性地進入生物體，起到改變基因表達，影響細胞功能，從而治療預(yù)防/疾病 的作用。
權(quán)利要求
含有干擾核糖核酸的細胞微粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞微粒子，其中所述細胞微粒子來自人或動物的供體細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的細胞微粒子，其中所述供體細胞包括細胞系、原代細胞培養(yǎng)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞微粒子，其中干擾核糖核酸包裹于細胞微粒子中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞微粒子，其中細胞微粒子的平均粒徑為10-500納米。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞微粒子，其中細胞微粒子包括exosome和sheddingvesicle 以及其他來自細胞的生物囊泡結(jié)構(gòu)。
7.一種試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的含有干擾核糖核酸的細胞微粒子。
8.—種藥物組合物，包括權(quán)利要求1-6中任一項所述的含有干擾核糖核酸的細胞微粒子。
9.制備權(quán)利要求1-6中任一項所述的細胞微粒子的方法，包括下列步驟 將干擾核糖核酸轉(zhuǎn)入細胞，優(yōu)選應(yīng)用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)或病毒載體法；分離含有干擾核糖核酸的細胞微粒子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中通過選自差速離心法、免疫吸附法和超濾法中的一種或多 種分離含有干擾核糖核酸的細胞微粒子。
11.一種研究方法，包括將權(quán)利要求1-6中任一項的含有干擾核糖核酸的細胞微粒子引入受體； 研究該含有干擾核糖核酸的細胞微粒子進入受體后對受體功能的影響。
12.一種預(yù)防和/或治療疾病的方法，包括將權(quán)利要求1-6中任一項所述的含有干擾 核糖核酸的細胞微粒子引入受體細胞內(nèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述疾病包括腫瘤；急慢性傳染病，細菌性疾病，以及其它各種病原微生物導(dǎo)致的急慢性傳染??；呼 吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，血液與造血系統(tǒng)疾病，循環(huán)系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝性疾病， 消化系統(tǒng)疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，泌尿系統(tǒng)疾病，生殖系統(tǒng)疾病和運動系統(tǒng)疾病。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述疾病包括病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、 SARS，結(jié)核、細菌性肺炎等細菌性疾病，病原微生物導(dǎo)致的急慢性傳染病。
15.權(quán)利要求1-6中任一項權(quán)利要求中的含有干擾核糖核酸的細胞微粒子在輸送干擾 核糖核酸中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有干擾核糖核酸的細胞微粒子，以及含有該含有干擾核糖核酸的細胞微粒子的藥物組合物以及試劑盒。通過該含有干擾核糖核酸的細胞微粒子以及含有該含有干擾核糖核酸的細胞微粒子的藥物組合物和試劑盒，可以研究干擾核糖核酸對受體細胞的影響作用，以及可以通過穩(wěn)定、高效、特異性地輸送干擾核糖核酸，用于治療相關(guān)疾病。同時，本發(fā)明還提供了制備含有干擾核糖核酸的細胞微粒子，以及含有上述含有干擾核糖核酸的細胞微粒子的藥物組合物以及試劑盒的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101869715SQ201010187578
公開日2010年10月27日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者劉丹青, 張玉婧, 張辰宇, 曾科, 顧宏偉 申請人:江蘇命碼生物科技有限公司