專利名稱：徐淮山羊體外重組過氧化氫酶體激活增殖受體的細胞定位方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因、核移植、動物克隆、種質(zhì)改良和細胞定位等領(lǐng)域，具體涉及一 種徐淮山羊體外重組過氧化氫酶體激活增殖受體的細胞定位方法。
背景技術(shù)：
過氧化S酶體激活增殖受體(Peroxisome proliferator-activatedreceptor, PPAR)是配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體家族。它主要參與脂肪的形成，促進脂 肪分化和調(diào)控特殊脂肪細胞基因的表達，它可能是體內(nèi)脂質(zhì)平衡的生理傳感器，在維持體 內(nèi)脂質(zhì)代謝動態(tài)平衡中起到樞紐作用。而綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)，特別是綠色熒光蛋白基因可在異源組織中表達并產(chǎn)生熒光，檢測方法簡單而不影響 宿主細胞，因而成為細胞生物學和分子生物學中廣泛使用的報告蛋白。通過綠色熒光蛋白 與外源基因融合表達的方式，外源蛋白在細胞內(nèi)的表定位情況舊可由綠色熒光蛋白示蹤蛋 白產(chǎn)生的綠色熒光來反映。目前，小鼠、豬、牛、綿羊和雞的過氧化氫酶體激活增殖受體基因 已被克隆，而徐淮山羊過氧化氫酶體激活增殖受體基因尚未被克隆，國內(nèi)關(guān)于它的研究主 要集中在對其多態(tài)性的研究，該基因亞細胞定位還未見有報道。此外，過氧化氫酶體激活增 殖受體基因在臨床醫(yī)學研究中有重大的價值。過氧化氫酶體激活增殖受體基因如何參與調(diào) 控脂肪代謝及其與肥胖、高血脂、脂肪肝等醫(yī)學難題有怎樣的關(guān)系，正是科學界亟待解決的 問題?？寺〕鲂旎瓷窖虻倪^氧化氫酶體激活增殖受體基因并研究其亞細胞定位，是為了保 存地方山羊品種遺傳資源并為探索過氧化氫酶體激活增殖受體蛋白調(diào)控脂類代謝奠定科 學基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是克隆徐淮山羊過氧化氫酶體激活增殖受體基因并研究其亞細胞定 位，以保存地方山羊品種遺傳資源并建立一種基因表達定位的新方法。本發(fā)明可通過以下具體步驟實現(xiàn)(1)構(gòu)建含過氧化氫酶體激活增殖受體基因的載體PMD19-T-PPAR:以徐淮山羊 cDNA為模板，F(xiàn)、R為引物PCR擴增全長過氧化氫酶體激活增殖受體基因序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠 回收試劑盒純化回收后與PMD19-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，LB含 氨芐固體培養(yǎng)基培養(yǎng)12_16h后挑選陽性克隆經(jīng)菌液PCR、酶切鑒定，將含正確插入片段的 重組質(zhì)粒命名為PMD19-T-PPAR，引物 F 5，-CGAAGCTTATGGTTGACACAGAGATGCCGTTT-3，引物 R :5，-CGGAATTCCTAATACAAGTCCTTGTAGATTTCC-3’ ；(2)構(gòu)建含有增強型綠色熒光蛋白的真核表達載體pEGFP-Cl-PPAR:用Hind III、 EcoR I酶雙切鑒定正確的PMD19-T-PPAR，膠回收目的片段，同時用Hind III、EcoR I酶雙 切原始載體PEGFP-C1，回收目的載體片段；T4 DNA連接酶16°C過夜連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆經(jīng)菌液PCR、酶切鑒定，將含正確插入片段的重組質(zhì)粒 命名為 pEGFP-Cl-PPAR ；(3).通過聚乙烯亞胺介導pEGFP-Cl-PPAR轉(zhuǎn)染NIH-3T3細胞，48h后于熒光倒置 顯微鏡下觀察細胞的發(fā)熒光部位，以確定過氧化氫酶體激活增殖受體蛋白的細胞亞定位情 況。綜上所述，通過此方法可獲得徐淮山羊過氧化氫酶體激活增殖受體基因cDNA完 整編碼區(qū)序列并實現(xiàn)其亞細胞定位。


圖1 過氧化氫酶體激活增殖受體基因cDNA的PCR擴增結(jié)果。其中1 過氧化氫酶 體激活增殖受體基因；M :1Kb DNA Marker (MBI公司)圖2是轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl-PPAR、pEGFP-Cl和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的NIH-3T3細胞在48h后明、 暗場下的圖片A、a :EGFP-PPAR融合蛋白表達在NIH-3T3細胞的細胞質(zhì)部分；B、b :EGFP熒光蛋白在NIH-3T3細胞的細胞質(zhì)和細胞核部分均有表達；C、c 無熒光蛋白表達的NIH-3T3細胞。具體實施方法1、引物設計與合成根據(jù)GenBank中綿羊過氧化氫酶體激活增殖受體基因序列(登錄號 NM001100921)設計全長過氧化氫酶體激活增殖受體基因的cDNA引物，并在上下游引入酶 切位點Hind III和EcoR I。引物由上海生工合成，序列如下F :5，-CGAAGCTTATGGTTGACACAGAGATGCCGTTT-3‘(下劃線部分為 Hind III 酶切位 占).
/、、、 / 9R :5’ -CGGAATTCCTAATACAAGTCCTTGTAGATTTCC-3’ (下劃線部分為 EcoR I 酶切位 點)o2、徐淮山羊脂肪組織RNA提取及過氧化氫酶體激活增殖受體基因cDNA擴增Trizol法抽提徐淮山羊皮下脂肪組織總RNA。以總RNA(lug)為模板，參照MBI公 司First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。以F、R為引物，徐淮山 羊cDNA為模板，擴增全長過氧化氫酶體激活增殖受體基因序列。反應體系參照LA Taq DNA 聚合酶說明書，PCR擴增參數(shù)為94°C預變性5min ；94°C變性40s ；60°C退火40s ；72°C延伸 1. 5min ；共35個循環(huán)，72°C總延伸lOmin。擴增產(chǎn)物用0. 8%的瓊脂糖凝膠檢測(圖1)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收后與PMD19-T (大連寶生物公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5ci感受態(tài)細胞，LB(含氨芐)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)12-16h。挑選陽性克隆經(jīng)菌液PCR、酶 切鑒定，將含正確插入片段的重組質(zhì)粒命名為PMD19-T-PPAR，送上海生工測序，測序正確后 提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號⑶082382。3、pEGFP-Cl_PPAR 載體構(gòu)建用Hind III、EC0R I酶雙切鑒定正確的pMD19-T-PPAR，膠回收目的片段。同時用 Hind III,EcoR I酶雙切原始載體pEGFP-Cl(Clontech公司)，回收目的載體片段。T4 DNA 連接酶16°C過夜連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆經(jīng)菌液PCR、酶
4切鑒定，將含正確插入片段的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-Cl-PPAR，送上海生工測序。4、重組質(zhì)粒 pEGFP-Cl-PPAR 轉(zhuǎn)染 NIH-3T3 細胞采用聚乙烯亞胺介導基因轉(zhuǎn)染的方法進行，分為實驗組和對照組。實驗組轉(zhuǎn)染重 組質(zhì)粒pEGFP-Cl-PPAR ；對照組1 轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl。對照組2 未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常NIH-3T3細 胞。取生長良好的NIH-3T3培養(yǎng)至80-90%細胞匯合開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染具體過程參照聚乙烯亞 胺試劑說明書進行，轉(zhuǎn)染48h后于熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的細胞。過氧化氫酶體激活增殖受體基因cDNA擴增結(jié)果顯示該基因完整編碼區(qū)大小為 1428bp，與綿羊過氧化氫酶體激活增殖受體基因完整編碼區(qū)同源性達99%。pEGFP-Cl-PPAR 轉(zhuǎn)染 NIH-3T3 細胞結(jié)果顯示(圖 2)轉(zhuǎn)染 pEGFP-Cl-PPAR 48h 后， NIH-3T3細胞質(zhì)中有熒光，細胞核中沒有熒光；轉(zhuǎn)染pEGFP-Cl 48h后，NIH-3T3細胞質(zhì)和 細胞核中均有熒光；未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常NIH-3T3對照組中無熒光出現(xiàn)。用該定位方法證明 EGFP-PPAR重組蛋白定位在NIH-3T3細胞質(zhì)部分。
權(quán)利要求
一種徐淮山羊體外重組過氧化氫酶體激活增殖受體的細胞定位方法，其特征在于包括以下步驟(1)構(gòu)建含過氧化氫酶體激活增殖受體基因的載體pMD19-T-PPAR以徐淮山羊cDNA為模板，F(xiàn)、R為引物PCR擴增全長過氧化氫酶體激活增殖受體基因序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收后與pMD19-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，LB含氨芐固體培養(yǎng)基培養(yǎng)12-16h后挑選陽性克隆經(jīng)菌液PCR、酶切鑒定，將含正確插入片段的重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-PPAR，引物F5’-CGAAGCTTATGGTTGACACAGAGATGCCGTTT-3’引物R5’-CGGAATTCCTAATACAAGTCCTTGTAGATTTCC-3’；(2)構(gòu)建含有增強型綠色熒光蛋白的真核表達載體pEGFP-C1-PPAR用Hind III、EcoR I酶雙切鑒定正確的pMD19-T-PPAR，膠回收目的片段，同時用Hind III、EcoR I酶雙切原始載體pEGFP-C1，回收目的載體片段；T4DNA連接酶16℃過夜連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆經(jīng)菌液PCR、酶切鑒定，將含正確插入片段的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-C1-PPAR；(3)通過聚乙烯亞胺介導pEGFP-C1-PPAR轉(zhuǎn)染NIH-3T3細胞，48h后于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的發(fā)熒光部位，以確定過氧化氫酶體激活增殖受體蛋白的細胞亞定位情況。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種徐淮山羊體外重組過氧化氫酶體激活增殖受體的細胞定位方法。該方法是先構(gòu)建含過氧化氫酶體激活增殖受體基因的載體pMD19-T-PPAR，再構(gòu)建含有增強型綠色熒光蛋白的真核表達載體pEGFP-C1-PPAR最后通過聚乙烯亞胺介導pEGFP-C1-PPAR轉(zhuǎn)染NIH-3T3細胞，48h后于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的發(fā)熒光部位，以確定過氧化氫酶體激活增殖受體蛋白的細胞亞定位情況。
文檔編號C12N15/85GK101864427SQ201010187618
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者孫敏, 張振韜, 李碧春, 田智泉, 秦玉蓉, 許峰, 陰彥輝, 陳國宏, 高波 申請人:揚州大學