專利名稱：一種克隆湖羊肌細(xì)胞生成素基因編碼區(qū)全序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因克隆等領(lǐng)域，具體涉及一種克隆湖羊肌細(xì)胞生成素基因編碼區(qū)全 序列的方法。
背景技術(shù)：
重疊延伸 PCR 技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR，簡稱 SOE PCR) 由于采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過 重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來.此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn) 行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術(shù)很快獲得其它 依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補(bǔ) 引物的設(shè)計(jì)。重疊延伸PCR在基因的定點(diǎn)突變、融合基因的構(gòu)建、長片段基因的合成、基因 敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有其廣泛而獨(dú)特的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是研究利用重疊PCR通過外顯子拼接克隆湖羊肌細(xì)胞生成素基因編 碼區(qū)全序列的方法，以建立一種基因克隆的新方法。本發(fā)明可通過以下具體實(shí)施步驟來實(shí)現(xiàn)步驟一依據(jù)已發(fā)表的波爾山羊肌細(xì)胞生成素基因序列，針對三個(gè)外顯子設(shè)計(jì)三 對具有末端互補(bǔ)序列的特異性引物并引入酶切位點(diǎn)(圖1)。引物序列如下(下劃線部分為
酶切位點(diǎn))
ExlF:5，-AGCGGATCCATGGAGCTGTATGAGACCT-3，(引入 BamHr酶切位點(diǎn))；
ExlR:5，-GCATTCACTGGGCACCCCTGGCTGGGGTCC-3’ ；
Ex2F:5，-GGACCCCAGCCAGGGGTGCCCAGTGAATGC-3’ ；
Ex2R:5，-CTGGGAGCAGATGATCCCCTGGGTTGGGGC-3’ ；
Ex3F:5，-GCCCCAACCCAGGGGATCATCTGCTCCCAG-3’ ；
Ex3R:5，-AGCGAATTCTCAGTTTGGTATGGTTTCA-3，(引入 EcoRr酶切位點(diǎn))
步驟:_以湖羊基因組DNA為模板，分別以ExlF, ExlR ；Ex2F、Ex2R ；Ex3F、Ex3R為
引物，擴(kuò)增肌細(xì)胞生成素外顯子并切膠回收，以回收的片段為模板，通過重疊PCR將其拼接 成一段核苷酸序列(SEQ NO. 1)，即湖羊肌細(xì)胞生成素基因編碼區(qū)全序列。將拼接得到的核苷酸序列進(jìn)行序列測定，應(yīng)用DNAMAN綜合分析軟件，將測序結(jié)果 與已發(fā)表的波爾山羊肌細(xì)胞生成素基因編碼區(qū)序列(登錄號(hào)為FJ607135)對比，以驗(yàn)證序 列的正確性及該方法的可靠性。結(jié)果顯示，拼接序列開放閱讀框完整，大小與FJ607135序列一致，為675bp，兩者 在132、223、364、498位點(diǎn)處有四個(gè)堿基的差異，同源性達(dá)99%。


如下圖1重疊PCR擴(kuò)增湖羊肌細(xì)胞生成素基因引物設(shè)計(jì)
圖2三個(gè)外顯子擴(kuò)增結(jié)果，其中M. Marker ；1.外顯子1 ；2.外顯子2 ；3.外顯子3圖3三個(gè)外顯子拼接結(jié)果，其中M. Marker ；1.外顯子拼接序列圖4拼接結(jié)果與GenBank登錄號(hào)為FJ607135序列對比
具體實(shí)施例方式1.根據(jù)GenBank報(bào)道的波爾山羊肌細(xì)胞生成素基因(登錄號(hào)為FJ607135)序列， 針對三個(gè)外顯子分別設(shè)計(jì)三對特異性引物并引入酶切位點(diǎn)(下劃線部分為酶切位點(diǎn))ExlF :5，-AGCGGATCCATGGAGCTGTATGAGACCT-3‘(弓丨入 B α mH I 酶切位點(diǎn))；Ex1R 5 ’ -GCATTCACTGGGCACCCCTGGCTGGGGTCC-3‘Ex2F 5' -GGACCCCAGCCAGGGGTGCCCAGTGAATGC-3'Ex2R 5' -CTGGGAGCAGATGATCCCCTGGGTTGGGGC-3'Ex3F 5' -GCCCCAACCCAGGGGATCATCTGCTCCCAG-3'Ex3R :5，-AGCGAATTCTCAGTTTGGTATGGTTTCA-3‘(引入 EcoR I 酶切位點(diǎn))其中，ExlR5，端的15個(gè)堿基與外顯子2的5，端序列互補(bǔ)，Ex2F5，端的15個(gè)堿基 為外顯子1的3’端序列；Ex2R5’端的15個(gè)堿基與外顯子3的5’端序列互補(bǔ)，Ex3F5’端的 15個(gè)堿基為外顯子2的3’端序列(圖1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合 成。2.湖羊血樣來自蘇州市種羊場健康雄性公羊，采用酚_氯仿法提取血液基因組 DNA (具體步驟參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社)，分別以ExlF、ExlR ；Ex2F、 Ex2R ；Ex3F、Ex3R為引物，Prime STAR高保真聚合酶擴(kuò)增肌細(xì)胞生成素基因的三個(gè)外顯子。 PCR反應(yīng)程序98°C預(yù)變性5min ；98°C變性10s，55 °C退火15s，72 °C延伸40s，35個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 IOmin0擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，并用小量膠回收試劑盒回收，作為 重疊PCR的模板。3.以回收的外顯子1、2、3為模板，Prime STAR高保真聚合酶擴(kuò)增肌細(xì)胞生成素 基因編碼區(qū)全序列。先進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)體系中不加引物，PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性 5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s，5個(gè)循環(huán)；72攝氏度延伸5min。反應(yīng)完 成后，在體系中加入引物ExlF、Ex3R及LATaq酶，進(jìn)行第2輪PCR，反應(yīng)程序?yàn)?2°C延伸 2min ；94°C預(yù)變性Imin ；94°C變性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72攝氏度 延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)，并用小量膠回收試劑盒回收， 與PMD19-T(購自Takara公司)載體連接，經(jīng)BamH I、EcoRI雙酶切鑒定后，送交上海生工 生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。4.應(yīng)用DNAMAN綜合分析軟件，將測序結(jié)果與已發(fā)表的波爾山羊肌細(xì)胞生成素基 因編碼區(qū)序列(登錄號(hào)為FJ607135)對比，以驗(yàn)證序列的正確性及該方法的可靠性。結(jié)果 顯示(圖4)，拼接序列開放閱讀框完整，大小為675bp，與FJ607135序列分別在132、223、 364,498位點(diǎn)處有四個(gè)堿基的差異，同源性達(dá)99%。
權(quán)利要求
一種克隆湖羊肌細(xì)胞生成素基因編碼區(qū)全序列的方法，其特征在于步驟一設(shè)計(jì)并合成三對具有末端互補(bǔ)序列的特異性引物并引入酶切位點(diǎn)Ex1F5’ AGCGGATCCATGGAGCTGTATGAGACCT 3’；Ex1R5’ GCATTCACTGGGCACCCCTGGCTGGGGTCC 3’；Ex2F5’ GGACCCCAGCCAGGGGTGCCCAGTGAATGC 3’；Ex2R5’ CTGGGAGCAGATGATCCCCTGGGTTGGGGC 3’；Ex3F5’ GCCCCAACCCAGGGGATCATCTGCTCCCAG 3’；Ex3R5’ AGCGAATTCTCAGTTTGGTATGGTTTCA 3’步驟二以湖羊基因組DNA為模板，分別以Ex1F、Ex1R；Ex2F、Ex2R；Ex3F、Ex3R為引物，擴(kuò)增肌細(xì)胞生成素外顯子并切膠回收，以回收的片段為模板，通過重疊PCR將其拼接成SEQ NO.1所示的序列，即湖羊肌細(xì)胞生成素基因編碼區(qū)全序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因克隆等領(lǐng)域，具體涉及一種克隆湖羊肌細(xì)胞生成素基因編碼區(qū)全序列的方法。該方法是依據(jù)已發(fā)表的波爾山羊肌細(xì)胞生成素基因序列，針對三個(gè)外顯子設(shè)計(jì)三對具有末端互補(bǔ)序列的特異性引物并引入酶切位點(diǎn)，以湖羊基因組DNA為模板，擴(kuò)增肌細(xì)胞生成素外顯子并切膠回收，以回收的片段為模板，通過重疊PCR將其拼接得到湖羊肌細(xì)胞生成素基因編碼區(qū)全序列，其與FJ607135序列，同源性達(dá)99％。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101899433SQ20101018764
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者張振韜, 李碧春, 秦玉蓉, 許峰, 陰彥輝, 陳國宏, 高波 申請人:揚(yáng)州大學(xué)