專利名稱：一種雞α干擾素的生產(chǎn)方法及構(gòu)建的工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程菌株的構(gòu)建方法；更具體地說，本發(fā)明涉及一種雞α干擾素 的生產(chǎn)方法及構(gòu)建工程菌。
背景技術(shù)：
干擾素具有廣譜抗病毒作用，由多種氨基酸組成，在ρΗ2 10時比較穩(wěn)定，對熱比 較穩(wěn)定，為干擾素制品的研制提供了良好的條件。在干擾素家族中，α-干擾素的抗病毒作 用最為顯著，是目前市場上的主流干擾素產(chǎn)品。利用基因工程技術(shù)研制重組干擾素是一條 高效而經(jīng)濟的途徑。隨著禽類保健的迫切需求和生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，各種禽類干擾 素的研究成為近年來的研究熱點。目前，實驗室用于表達目的蛋白的質(zhì)粒載體有pBS、pET系列和pMAL系列等載體， 誘導(dǎo)方式有溫度誘導(dǎo)、IPTG誘導(dǎo)和乳糖誘導(dǎo)等。在大腸桿菌(E.coli)表達系統(tǒng)中，許多 外源蛋白的高水平表達都會導(dǎo)致形成包涵體，包涵體是細(xì)菌表達的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，通 過低速離心可以分離出這些包涵體。由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，必須對其 進行變性和復(fù)性才能恢復(fù)其生物學(xué)活性。自1994年Sick等首先報道了雞α干擾素基因 (GGIFN-α )，并在大腸桿菌(E.coli)和COS細(xì)胞中表達后，雞α干擾素(ChIFN-α)和雞 Y干擾素(ChIFN-Y)基因相繼得到克隆，并在原核表達載體中獲得表達，表達的產(chǎn)物為包 涵體型。外源基因在大腸桿菌宿主中的過量表達時，常常導(dǎo)致表達產(chǎn)物在胞內(nèi)形成不溶性 的聚集體，即包涵體形成。包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，需要進行變性和復(fù)性才能 恢復(fù)其活性。防止形成包涵體的一個方法是用含有原核信號肽的載體進行表達。信號肽對 蛋白質(zhì)的定位有著非常重要的作用，根據(jù)研究報道，適當(dāng)改造信號肽結(jié)構(gòu)可提高外源蛋白 的分泌效率。信號肽能夠引導(dǎo)IFN-a通過細(xì)胞膜而分泌到細(xì)胞外，新合成的蛋白被轉(zhuǎn)運 到周質(zhì)空間，在周質(zhì)空間中新合成的蛋白是可溶的，然后信號肽通過蛋白分解，保留成熟的 IFN蛋白，這種方法對真核分泌蛋白尤為有效。L-天(門)冬酰胺酶iKL-asparaginase， 簡稱ASP)信號肽是一種外周胞質(zhì)酶，分析編碼這種酶的ansB基因顯示該酶在它的氨基酸 末端包含了一種典型的22個堿基的分泌型信號肽，當(dāng)這種酶被分泌到細(xì)胞周質(zhì)時，信號肽 就被清除同時產(chǎn)生一種含N末端的成熟蛋白亮氨酸，這種特性表明ASP信號肽能夠被用來 直接分泌表達大腸桿菌中的活性干擾素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種雞α干擾素的生產(chǎn)方法；本發(fā)明的另一目的是提供一種能夠分泌表達雞α干擾素的工程菌。本發(fā)明的目的按照下述方案實現(xiàn)一種雞α干擾素的生產(chǎn)方法，其工藝過程為首先將獲得細(xì)菌信號肽L-天(門) 冬酰胺酶II基因序列插入攜帶雞α干擾素成熟蛋白基因序列的pET-28a(+)載體中，得到
3能夠分泌表達雞α干擾素的工程菌；再在LB培養(yǎng)液中，370C，200rpm培養(yǎng)4 8h，加IPTG 至終濃度為lmmol/L，37°C，180rpm繼續(xù)在TEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 6h ；所得菌液經(jīng)進一步分 離處理得到雞α干擾素產(chǎn)品；所述菌液的分離處理過程為將菌液移到離心管中，在冰上低溫超聲破碎， 2 8 °C高速離心30min，收集沉淀；沉淀用含0. 5% TritonX-IOO和IOmM EDTA的PBS Buffer (pH7. 0 7. 4)洗滌1 3次；將沉淀懸浮于PBS buffer，加甘油凍存；所述菌液的分離處理過程為菌液進入冷凍干燥機，冷凍干燥20h以上；一種能夠分泌表達雞α干擾素的工程菌，該工程菌已提交到中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號為CGMCC3800 ；所述的能夠分泌表達雞α干擾素的工程菌，其重組表達載體由以下元件構(gòu)成1)雞α干擾素成熟蛋白基因序列；2)細(xì)菌信號肽L-天(門)冬酰胺酶II基因序列；3)pET-28a(+)；所述雞α干擾素工程菌分泌表達的過程為首先通過PCR獲得編碼雞α干擾素 成熟蛋白和細(xì)菌信號肽L-天(門)冬酰胺酶II的基因序列，連接在pET28a(+)的多克隆 位點的下游，構(gòu)建出表達載體；再將其轉(zhuǎn)化到基因工程大腸桿菌表達細(xì)菌中，在TEM的培養(yǎng) 液中誘導(dǎo)表達。本發(fā)明提高了雞α干擾素基因目的蛋白的表達效率，屬國內(nèi)首次采用在包涵體 型重組表達質(zhì)粒pET-28a-ChIFN-a前加入一段L-天(門)冬酰胺酶II(ASP)信號肽基 因，重新改造構(gòu)建成分泌型表達載體，使其得到改善，省去了 pET-28a-ChIFN-a表達形成 包涵體后的變性、復(fù)性提純過程，并實現(xiàn)了誘導(dǎo)表達。ASP信號肽在重組表達載體中的考察 結(jié)果表明，ASP信號肽可使重組質(zhì)粒經(jīng)人工改造后，由目的蛋白包涵體型表達轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛?表達，并且提高了雞α干擾素成熟蛋白基因的表達效果，這為篩選出雞α干擾素成熟蛋白 的高效表達菌株奠定了基礎(chǔ)。


圖1 構(gòu)建的ASP-ChIFN-α基因工程菌株示意圖。圖2 重組質(zhì)粒pET-28a_ChIFN- α的酶切鑒定。圖中 1，2 :pET-28a-ChIFN_a digested by EcoR I and Sal I ；M :DL2000 DNAMarker圖3 重組質(zhì)粒pET-28a-ASP_ChIFN- α的酶切鑒定。圖中 1，2 :pET-28a-ASP-ChIFN- α by EcoR I and Nco I ；M :DL2000 DNA Marker圖 4 重組質(zhì)粒 pET-28a_ASP-ChIFN- α 的 SDS-PAGE 和 Western-blot 結(jié)果。圖中 1 induced BL21 ；2，6 induced pET_28a_ChIFN-α ；3 :non-inducedpET_28a ； 4 :non-induced pET_28a_ChIFN-α ；5 :non-inducedpET-28a-ASP_ChIFN-α ；7 : induced 3h pET-28a/ASP-ChIFN-a ；8:induced 6hpET_28a/ASP_ChIFN-α ；9 :western_blot result；M :protein marker。
具體實施例方式1.材料大腸桿菌JM109、BL21 (DE3)、DH5 α (pMD18T)、質(zhì)粒 pET_28a(+)為本實驗室保藏； 連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶 EcoR I(15U/yL)、Nco I(10U/yL)、sal I(15U/yL)、Ex Taq DNA聚合酶(5U/ μ L)等購自takara有限公司；DNA回收試劑盒購自Promega公司；其余試 劑均為國產(chǎn)純；引物Pl 為 5， -cttgaattctgcaaccaccttcgcc-3',P2 為 5， -caggtcgacctaagtgcgcgtgttgcct-3‘；P3 為 5， -cgccat￡gagtttttcaaaaag-3',P4 為 5，-ggaattctgccaatgctgcacc-3‘；由上海生工公司合成。2.步驟第一步屮0 擴增？0^^目的片斷利用引物PI、P2，采用25 μ L，以提取的雞肝組織基因組DNA為模板，進行PCR反 應(yīng)；PCR儀程序設(shè)定為94°C變性4min ；94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸lmin，擴增 32個循環(huán)；72°C延伸IOmin。第二步=ChIFNa克隆載體的構(gòu)建采用EcoR I和Sal I雙酶切PCR擴增的ChIFN α目的片斷，按照Wizard SVGel and DNA PCR Clean-up System說明書回收ChIFNα酶切片斷，將回收產(chǎn)物與相應(yīng)酶切回收 的pMD18-T載體按3 1比例連接，4°C過夜，連接產(chǎn)物采用CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，小提質(zhì)粒酶切鑒定并測序。第三步PCR擴增ASP目的片斷利用引物P3、P4，采用25 μ L，以提取的大腸桿菌基因組DNA為模板，進行PCR反 應(yīng)；PCR儀程序設(shè)定為94°C變性4min ；94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸30sec，擴 增30個循環(huán)；72°C延伸IOmin。第四步ASP克隆載體的構(gòu)建采用Nco I和EcoR I雙酶切PCR擴增的ASP目的片斷，按照Wizard SV Gel andDNA PCR Clean-up System說明書回收ChIFN α酶切片斷，將回收產(chǎn)物與相應(yīng)酶切回收 的pMD18-T載體按3 1比例連接，4°C過夜，連接產(chǎn)物采用CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，小提質(zhì)粒酶切鑒定并測序。第五步雞干擾素原核表達載體的構(gòu)建分別用EcoR I和Sal I雙酶切克隆載體pMD18_T_ChIFN α獲取ChIFNa酶切片 斷，按照 Wizard SV Gel and DNA PCR Clean-up System 說明書進行 ChIFNα 酶切片斷的 回收，將酶切片斷與EcoR I和Sal I雙酶切處理的pET_28a(+)回收片段按4 1比例連 接，4°C過夜，連接產(chǎn)物經(jīng)CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α和表達菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞 中，提取質(zhì)粒酶切鑒定，將酶切正確的表達載體命名為pET-28a-ChIFNa。第六步重組ASP-ChIFN-α表達體系的構(gòu)建分別用Nco I和EcoR I雙酶切表達質(zhì)粒pMD18_T_ASP獲取ASP酶切片斷，按照 Wizard SV Gel and DNA PCR Clean-up System說明書進行ASP酶切片斷的回收，將酶切片 斷與Nco I和EcoR I雙酶切處理的pET-28a-ChIFNa回收片段按4 1比例連接，4°C過夜，連接產(chǎn)物經(jīng)CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α和表達菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì) 粒酶切鑒定，將酶切正確的表達載體命名為pET-28a-ASP_ChIFN α。按照CaCl2法制備大腸 桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將pET-28a-ASP-ChIFNa轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，同時進 行對照質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、抗性(Kan)篩選，挑選菌落利用試劑盒提取質(zhì)粒進行酶切鑒定、PCR檢 測等。將正確構(gòu)建的菌株命名為BL21 (DE3) (pET-28a-ASP-ChIFN- α )。第七步ASP_ChIFN α融合蛋白的誘導(dǎo)表達無菌狀態(tài)下，LB培養(yǎng)液添加Kan至終濃度為10 μ g/mL，調(diào)整pH為7. 0 7. 2， 370C，200rpm 培養(yǎng) BL21 (DE3) (pET-28a_ASP-ChIFN- α )，4 8h，力口 IPTG 至終濃度為 0. 1 1. 5mmol/L, 37 °C，180rpm 繼續(xù)培養(yǎng) 2 8h。第八步重組ChIFN α蛋白的粗提將誘導(dǎo)表達后的菌液IOOmL轉(zhuǎn)移到離心管中，4°C超聲破碎(200W，50%振幅，間 歇5s，破碎2s，共20min)，4°C，12000rpm離心30min，棄上清，收集沉淀；沉淀用含0. 5 % TritonX-IOO 和 IOmM EDTA 的 PBS Buffer (pH7. 0 7. 4)洗滌 1 3 次；將沉淀懸浮于 PBS buffer，加甘油凍存?；蛘邔⒘呀獾纳锨?，進入冷凍干燥機，冷凍干燥20h以上。
權(quán)利要求
一種雞α干擾素的生產(chǎn)方法，其工藝過程為首先將獲得細(xì)菌信號肽L 天(門)冬酰胺酶Ⅱ基因序列插入攜帶雞α干擾素成熟蛋白基因序列的pET 28a(+)載體中，得到能夠分泌表達雞α干擾素的工程菌；再在LB培養(yǎng)液中，37℃，200rpm培養(yǎng)4～8h，加IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，180rpm繼續(xù)培養(yǎng)2～6h；所得菌液經(jīng)進一步分離處理得到雞α干擾素產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的雞α干擾素的生產(chǎn)方法，其特征在于所述菌液的分離處理過程 為將菌液移到離心管中，2 8°C，低溫超聲破碎，2 8°C高速離心30min，收集沉淀；沉淀 用含 0. 5% TritonX-IOO 和 IOmM EDTA 的 PBS Buffer (pH7. 0 7. 4)洗滌 1 3 次；將沉 淀懸浮于PBS buffer，加甘油凍存。
3.如權(quán)利要求1所述的雞α干擾素的生產(chǎn)方法，其特征在于所述菌液的分離處理過程 為菌液進入冷凍干燥機，冷凍干燥20h以上。
4.一種能夠分泌表達雞α干擾素的工程菌，該工程菌已提交到中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號為CGMCC3800。
5.如權(quán)利要求4所述的能夠分泌表達雞α干擾素的工程菌，其特征在于其重組表達載 體由以下元件構(gòu)成1)雞α干擾素成熟蛋白基因序列；2)細(xì)菌信號肽L-天(門)冬酰胺酶II基因序列；3)pET-28a⑴。
6.如權(quán)利要求4所述的能夠分泌表達雞α干擾素的工程菌，其特征在于其分泌表達的 過程為首先通過PCR獲得編碼雞α干擾素成熟蛋白和細(xì)菌信號肽L-天(門)冬酰胺酶 II的基因序列，連接在pET28a⑴的多克隆位點的下游，構(gòu)建出表達載體；再將其轉(zhuǎn)化到基 因工程大腸桿菌表達細(xì)菌中，在TEM的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)表達。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雞α干擾素的生產(chǎn)方法及其構(gòu)建的工程菌，其工藝過程為首先將獲得細(xì)菌信號肽L-天(門)冬酰胺酶II基因序列插入攜帶雞α干擾素成熟蛋白基因序列的pET-28a(+)載體中，得到能夠分泌表達雞α干擾素的工程菌；再在LB培養(yǎng)液中，37℃，200rpm培養(yǎng)4～8h，加IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，180rpm繼續(xù)培養(yǎng)2～6h；所得菌液經(jīng)進一步分離處理得到雞α干擾素產(chǎn)品。本發(fā)明還提供了一種能夠分泌表達雞α干擾素的工程菌，其分泌表達的過程為首先通過PCR獲得編碼雞α干擾素成熟蛋白和細(xì)菌信號肽L-天(門)冬酰胺酶II的基因序列，連接在pET28a(+)的多克隆位點的下游，構(gòu)建出表達質(zhì)粒；再將其轉(zhuǎn)化到基因工程大腸桿菌表達細(xì)菌中，在常規(guī)的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)表達。
文檔編號C12N15/63GK101948890SQ20101018770
公開日2011年1月19日 申請日期2010年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月1日
發(fā)明者周學(xué)章, 宋振威, 王玉炯, 賈芳 申請人:寧夏大學(xué)