專利名稱：用于固定化酶的載體及其用途和固定有酶的載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工領域，涉及用于固定化酶的載體，具體地說是一種具有超大孔的聚合物微球，作為用于固定化酶的載體。本發(fā)明還涉及用于固定化酶的載體在固定化酶方面的用途以及固定有酶的載體。
背景技術：
酶作為一種天然的高分子催化劑，因具有極高的選擇性、催化反應、條件溫和、無污染等諸多優(yōu)點，在食品加工、醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)中有著極為廣闊的應用前景。然而，自由酶的不穩(wěn)定和容易變形等缺點使其難以在工業(yè)中得到更為廣泛的應用。此外，在反應體系中分離和提純酶也增加了生產(chǎn)成本，因此，固定化酶研究日益受到人們的重視。固定化酶經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已經(jīng)得到廣泛應用，有的已進行工業(yè)性運轉(zhuǎn)，被廣泛用于食品生產(chǎn)與建材、生物制藥、生物傳感器、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)保技術及生物技術等多種領域。作為固定化酶的一部分，載體材料的結(jié)構和性能對固定化酶有著巨大的影響。由于載體材料的重要性，自固定化酶技術興起以來，很多學者就一直致力于對載體的研究。迄今為止，固定化酶的載體材料已從最初的天然高分子材料發(fā)展到合成高分子材料、無機材料、復合材料等。天然高分子載體材料一般對生物無毒、傳質(zhì)性能好，原料比較易得，比較適合擔當酶的載體材料。目前常用的天然高分子材料有瓊脂糖、卡拉膠、海藻酸鹽、纖維素、明膠、膠原、殼聚糖等。然而，天然高分子材料的機械強度較差，在厭氧條件下易被微生物分解，使用壽命較短，而且天然高分子原料來源往往受產(chǎn)地所限，這在一定程度上限制了它的應用。因此，合成有機高分子材料被用以替代天然高分子材料作為固定化酶的載體。合成有機高分子材料由于其化學、物理性能都有很大的可變性，從理論上來講，可以擔當任何一種酶的固定化載體，而且它們對微生物的腐蝕也有較強的抵抗力。與天然高分子材料相比，合成高分子材料強度較大是一個突出的優(yōu)點。聚苯乙烯材料是世界上第一個被用來擔當用于固定化酶的載體的合成有機高分子，主要通過吸附作用來固定化酶。其后，帶有功能基團的聚甲基縮水甘油酯(PGMA)聚合物、聚丙烯酸甲酯聚合物、以及親水性能更強的聚丙烯酰胺類聚合物等也被用作用于固定化酶的載體。但是，合成高分子材料的傳質(zhì)性能較差是其作為用于固定化酶的載體的一個不利之處。因此，有必要提供一種具有良好傳質(zhì)性能的合成高分子材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對上述問題，提出使用一種具有特定孔道大小分布的聚合物微球作為固定化酶的載體。該載體除具有常規(guī)十至幾十納米的孔道外，還具有90-1000nm 的大孔結(jié)構。根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種用于固定化酶的載體，該載體是一種具有90-1000nm大孔道的聚合物微球，小于90nm的孔道占微球總孔隙率的1 % -30%,90nm以上且小于IOOnm的孔道占微球總孔隙率的5% -30% ； IOOnm以上且小于300歷的孔道占微球總孔隙率的15% -75%,300nm以上且小于500nm的孔道占微球總孔隙率的15% -75%, 500nm以上且小于800nm的孔道占微球總孔隙率的5% -20%,800-1000nm的孔道占微球總孔隙率的_20%，最可幾孔徑為90-600nm。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了上述載體在固定化酶中的用途，其中酶通過吸附或化學交聯(lián)的方法固定于載體上。本發(fā)明的第三個方面，提供了一種固定有酶的載體，其包括如上所述的載體以及固定于所述載體上的酶。本發(fā)明用于固定化酶的載體，滲透性能良好，酶可以固定于載體內(nèi)部，微球表面的利用率可以達到70% -100%。本發(fā)明的固定有酶的載體，酶受到載體的良好保護，穩(wěn)定性、 活性、重復使用性良好，尤其適于裝柱進行連續(xù)反應。


圖1表示現(xiàn)有技術中僅固定于載體表層的固定化酶的圖片圖2表示本發(fā)明超大孔聚苯乙烯微球的電鏡照片。圖3表示本發(fā)明超大孔聚甲基丙烯酸縮水甘油酯聚合物微球的電鏡照片。圖4表示本發(fā)明超大孔聚苯乙烯微球(圖4a_最可幾孔徑313nm、圖4b_最可幾孔徑104nm)和常規(guī)多孔聚苯乙烯微球(圖4c_最可幾孔徑14. 7nm)固定脂肪酶后的激光共聚焦照片(其中，白色部分是用熒光標記的酶，可以看出圖如和圖4b的固定有酶的載體上，酶已固定于微球內(nèi)部，而圖4c中酶僅固定于載體的殼層)。圖5表示本發(fā)明超大孔聚苯乙烯微球(最可幾孔徑313nm、104nm)和常規(guī)多孔聚苯乙烯微球(最可幾孔徑14. 7nm)固定脂肪酶的熱穩(wěn)定性對比實驗(圖5a-50°C，圖 5b-70°C )。圖6表示本發(fā)明超大孔聚苯乙烯微球(最可幾孔徑313nm、104nm)和常規(guī)多孔聚苯乙烯微球(最可幾孔徑14. 7nm)固定脂肪酶的儲存穩(wěn)定性實驗。圖7表示本發(fā)明超大孔聚苯乙烯微球(最可幾孔徑313nm、104nm)和常規(guī)多孔聚苯乙烯微球(最可幾孔徑14. 7nm)固定脂肪酶的重復使用性。圖 5、6、7 中自由酶 ，超大孔聚苯乙烯固定化酶(最可幾孔徑313nm) Δ，超大孔聚苯乙烯固定化酶(最可幾孔徑104nm) ，常規(guī)多孔聚苯乙烯微球固定化酶(最可幾孔徑14. 7nm) X。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種用于固定化酶的載體，該載體是一種具有 90-1000nm大孔道的聚合物微球，小于90nm的孔道占微球總孔隙率的-30%，90nm以上且小于IOOnm的孔道占微球總孔隙率的5% -30% ； IOOnm以上且小于300歷的孔道占微球總孔隙率的15% -75%,300nm以上且小于500nm的孔道占微球總孔隙率的15% -75%, 500nm以上且小于800nm的孔道占微球總孔隙率的5% -20%,800-1000nm的孔道占微球總孔隙率的_20%，最可幾孔徑為90-600nm。最可幾孔徑的優(yōu)選范圍為100-400nm。
所述載體的表面既可以為疏水性也可以為親水性，或兼有疏水和親水性。所述載體的組成可以為(1)含有聚苯乙烯交聯(lián)結(jié)構的聚合物，或(2)含有聚丙烯酸結(jié)構的聚合物，或(3)含有聚丙烯酰胺結(jié)構的聚合物，或(4)含有環(huán)氧基的聚合物，或(5) 含有羥基的聚合物，或(6)含有羧基的聚合物，或(7)含有胺基的聚合物；具體包括聚苯乙烯類聚合物，聚(甲基)丙烯酸類聚合物、聚(甲基)丙烯酸酯類聚合物、聚丙烯酰胺類聚合物、聚乙酸乙烯酯類聚合物、聚乙酸類聚合物；更具體的指聚苯乙烯聚合物、聚甲基丙烯酸縮水甘油酯聚合物、聚羥乙基丙烯酸甲酯聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物，及其復合聚合物。所述的用于固定化酶的載體的交聯(lián)度可以為5% -75%，優(yōu)選范圍為10% -40%0 載體的交聯(lián)度指交聯(lián)劑占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。具有親水性表面的用于固定化酶的載體可以是(1)本身即為親水性的聚合物或親水-疏水復合聚合物載體，如聚羥乙基丙烯酸甲酯聚合物、聚甲基丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺類、聚乙烯醇聚合物；或( 疏水性微球或親水-疏水復合微球經(jīng)化學反應，如胺化、羧化、水解等得到的親水性聚合物，或C3)將親水性物質(zhì)通過物理吸附或化學交聯(lián)的方法修飾到微球表面得到的具有親水性表面的微球。所述的親水性物質(zhì)可以為聚乙烯醇、魔芋葡甘聚糖、葡聚糖、殼聚糖、明膠、海藻酸鹽、膠原、纖維素、卡拉膠、阿拉伯膠。所述的用于固定化酶的載體微球的粒徑可以為5-300微米，優(yōu)選范圍為10-200微米，更優(yōu)選范圍為30-100微米。酶可以通過吸附或化學交聯(lián)的方法固定于載體上，可以是單酶固定也可以是復酶固定。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了上述載體在固定化酶中的用途，其中酶通過吸附或化學交聯(lián)的方法固定于載體上。本發(fā)明的第三個方面，提供了一種固定有酶的載體，其包括如上所述的載體以及固定于所述載體上的酶。本專利所述的具有超大孔結(jié)構的聚合物微球既具有幾十納米的中小孔，又具有上百納米的大孔和超大孔。小孔提供了足夠的比表面積，保證了酶的固載量。大孔和超大孔提供了足夠大的空間，使酶分子能夠固定于載體內(nèi)部。同時，大的孔道又保證了底物和產(chǎn)物進出載體的良好的傳質(zhì)性能，促進了反應的進行。具有超大孔結(jié)構的聚合物微球可以通過表面活性劑反膠團溶脹法[1~2]、納米顆粒凝聚法[3]、溶劑-有機顆粒雙致孔劑法[4]、復乳法 [5]等多種方法制備。下面是制備具有超大孔結(jié)構的聚合物微球的方法的更具體實例。具有超大孔結(jié)構的疏水性或親水-疏水復合微球的制備參考中國專利申請200510087138. 0，在單體和交聯(lián)劑的混合液中，加入引發(fā)劑、稀釋劑和油溶性表面活性劑，攪拌，直至引發(fā)劑完全溶解，制備成油相；其中，油溶性表面活性劑在油相中的質(zhì)量含量為5 % 80 %，稀釋劑在油相中的質(zhì)量含量為0 % 80 %。將穩(wěn)定劑(如聚乙烯醇或明膠等)溶于蒸餾水，配制成質(zhì)量含量為0. 1 10%的溶液，作為水相。 將油相加入水相，攪拌，升溫聚合。反應結(jié)束后，過濾，用蒸餾水和乙醇清洗數(shù)次，將稀釋劑、 表面活性劑組分洗凈，干燥后，即得超大孔聚合物微球。具有超大孔結(jié)構的親水性聚合物微球的制備
參考文獻5，配制含有乳化劑的水相，乳化劑的含量為1_10%，將內(nèi)油相(內(nèi)油相與水相的體積比為1 4至3 幻分散到水相，得到水包油初乳液。配制含有乳化劑的外油相，乳化劑的含量為1-10%，將上述水包油初乳液分散到外油相，通過加熱交聯(lián)或膠凝等方法成球。用乙醇和水依次清洗，去除內(nèi)油相后，即可得超大孔微球。本專利所述的用于固定化酶的載體既可以為疏水性表面也可以為親水性表面，具有疏水性表面的載體包括聚苯乙烯類聚合物，聚甲基丙烯酸類聚合物、聚甲基丙烯酸酯類聚合物、聚乙酸乙烯酯類聚合物、聚乙酸類聚合物，及其復合聚合物。具有親水性表面的載體包括三類(1)本身即為親水性聚合物或親水-疏水復合聚合物載體，如聚羥乙基丙烯酸甲酯聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、聚丙烯酰胺類、聚乙烯醇聚合物；或( 疏水性微球或親水-疏水復合微球經(jīng)化學反應，如胺化、羧化、水解等得到的親水性聚合物，或C3)將親水性物質(zhì)如聚乙烯醇、魔芋葡甘聚糖、葡聚糖、殼聚糖、明膠、海藻酸鹽、膠原、纖維素、卡拉膠、阿拉伯膠等，通過物理吸附或化學交聯(lián)的方法修飾到微球表面得到的具有親水性表面的微球。所述的物理吸附方法除常規(guī)的吸附方法外，還包括將親水性物質(zhì)偶聯(lián)上一定的疏水基團，如苯基、苯氧基、碳鏈等，增強親水性物質(zhì)與疏水微球間的結(jié)合力，而后進行吸附。吸附的親水層可以通過后交聯(lián)，使修飾層更為穩(wěn)定。所述的疏水修飾劑可以是縮水甘油醚類，如苯基縮水甘油醚、丁基縮水甘油醚、烯丙基縮水甘油醚、甲苯基縮水甘油醚等。所述的交聯(lián)劑可使用環(huán)氧氯丙烷或乙二醇二縮水甘油醚等。本發(fā)明提出的用于固定化酶的載體可以為規(guī)則球形，是一種具有90-1000nm大孔道的聚合物微球，小于90nm的孔占微球總孔隙率的-30%,90nm以上且小于IOOnm 的孔道占微球總孔隙率的5% -30% ；IOOnm以上且小于300nm的孔道占微球總孔隙率的 15% -75%,300nm以上且小于500nm的孔道占微球總孔隙率的15% -75%,500nm以上且小于SOOnm的孔道占微球總孔隙率的5 % -20 %，SOO-IOOOnm的孔道占微球總孔隙率的
-20%，最可幾孔徑為90-600nm，優(yōu)選范圍為100_400nm。其中，小于90nm的孔以及90nm 以上且小于IOOnm的孔道能夠提供足夠高的比表面積，由此保證了足夠的酶載量。IOOnm以上且小于300nm的孔道適于粒徑較小的微球載體或分子量較小的酶，既減小了酶進入微球內(nèi)部的傳質(zhì)阻力，又能夠保證酶的載量，從而提高固定化酶的催化效果。300nm以上且小于 500nm的孔道適于粒徑較大的微球載體或分子量較大的酶，能夠提高微球的滲透性，提供足夠通透的孔道結(jié)構，使酶分子能夠進入微球內(nèi)部，而不會堵塞在孔道入口處。500nm以上且小于SOOnm的孔道以及SOO-IOOOnm的孔道主要提供了酶分子進入微球內(nèi)部的大的通道，能夠有效減少酶固定化過程的傳質(zhì)阻力以及底物和產(chǎn)物進出載體受到的傳質(zhì)阻力。實驗證明，符合以上載體特征的固定化酶其米氏常數(shù)Km比自由酶的米氏常數(shù)還要低，說明與底物具有良好的親合性，底物進入載體內(nèi)部不受傳質(zhì)阻力影響(實施例1 。本專利所述的用于固定化酶的載體基本沒有超過IOOOnm的大孔徑。如果孔徑過大(超過IOOOnm)，會影響微球的機械強度，造成易碎等問題。本專利所述微球的機械性能良好，尤其對于裝柱進行連續(xù)生產(chǎn)時，多糖類微球受壓容易變形，無法在較高流速下操作，而本發(fā)明提出的用于固定化酶的載體則能夠耐受高達20MPa的壓強，同時由于具有超大孔結(jié)構，載體的滲透性良好，能夠在高流速下操作，有效提高生產(chǎn)效率。另外，雖然有研究人員通過本體聚合法也制備出具有大孔徑的塊狀PGMA 聚合物，然后研磨成顆粒[6]，但這種顆粒的外形并不規(guī)則，在裝柱操作時易造成溝流等流動不均勻的情況。即使是在攪拌情況下進行批次操作，規(guī)則球形的固定化酶微載體也更為有利。本專利提出的用于固定化酶的載體，酶可以通過吸附法固定到載體上，也可以通過化學交聯(lián)的方法固定到載體上。所述的吸附法包括物理吸附和離子交換吸附。這種方法的優(yōu)點在于操作簡單，可選用不同的載體，固定化的同時可與純化過程同時實現(xiàn)，酶失活后載體仍可再生。所述的化學交聯(lián)方法指酶分子的功能基團與載體表面的活性功能基團通過形成化學共價健實現(xiàn)結(jié)合的酶固定方法。能夠與載體以共價鍵結(jié)合的酶的功能團，包括(1)氨基賴氨酸的ε -氨基和多肽鍵的N-末端的α -NH2基；(2)羧基天門冬氨酸的 β -羧基、谷氨酸的α -羧基和末端羧基；(3)酚羥基酪氨酸的酚羥基；(4)巰基半胱氨酸的巰基；(5)羥基絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的羥基；(6)咪唑基組氨酸的咪唑基；(7)吲哚基色氨酸的吲哚基。最常見的為氨基、羧基、酪氨酸和組氨酸的芳環(huán)。對于本身具有官能團如環(huán)氧基、胺基、羧基的載體，可以直接用于酶固定化。對于多數(shù)載體，不具備與酶直接作用的能力，在固定化前需要經(jīng)過活化。載體的活化可能是簡單的一步過程，也可能是復雜的多步過程。常用的共價結(jié)合方法包括重氮化法、疊氮法、戊二醛法、烷化法、芳基化法、肽鰲合法、肽鍵法等。以上各種酶的固定方法各有所長，幾種方法聯(lián)用往往效果更好。本專利提出的超大孔固定化酶微載體具有大的孔徑，因此，另一個突出的優(yōu)點就在于載體的滲透性能良好，酶可以固定于載體內(nèi)部，微球表面的利用率為70% -100%。受到載體的良好保護。穩(wěn)定性、活性、重復使用性良好，尤其適于裝柱進行連續(xù)反應酶可以通過多種方法固定到載體上。物理吸附法可以用去離子水將超大孔微球充分潤濕(對于疏水性載體可用乙醇預先浸潤，而后用去離子水置換完全)，稱取一定量的酶加入緩沖液中，溶解完全。將已潤濕的載體加入酶液中，室溫下緩慢振蕩至達到吸附飽和。 離心，去掉上清液，用緩沖液清洗3次，即得到固定化酶。使用化學交聯(lián)法時，操作與上述步驟相同，但酶與載體的反應時需要的緩沖液以及PH值、反應溫度等條件需要視酶與載體反應的官能團而定。超大孔微球的孔徑分布、孔隙率等結(jié)構特征由壓汞儀進行測定，粒徑由激光粒度儀進行測定，微球表面的利用率是由激光共聚焦亮點與暗點的相對比例得到的半定量數(shù)據(jù)。酶在微球內(nèi)部的分布情況由激光共聚焦逐層掃描表征得到。固定有酶的載體的傳質(zhì)性能通過對固定化酶進行動力學研究得到的米氏常數(shù)說明，固定化酶的米氏常數(shù)等于或小于自由酶，說明底物和產(chǎn)物進出載體不受傳質(zhì)阻力的影響；大于自由酶時，說明受到傳質(zhì)阻力影響，相差越大，傳質(zhì)阻力越為嚴重。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但本發(fā)明并不僅僅限制于以下實施例。實施例1 [最可幾孔徑為313nm的超大孔PST微球]超大孔聚苯乙烯(PST)微球(圖2)，該載體小于90nm的孔占微球總孔隙率的8%， 90nm以上且小于IOOnm的孔道占微球總孔隙率的12% ；IOOnm以上且小于300nm的孔道占微球總孔隙率的39%，300nm以上且小于500nm的孔道占微球總孔隙率的35%，500nm以上且小于SOOnm的孔道占微球總孔隙率的5%，最可幾孔徑為313nm。平均粒徑為100微米， 孔隙率60%，比表面積34m2/g，交聯(lián)度12%。實施例2 [最可幾孔徑為104nm PST微球)
超大孔聚苯乙烯微球，該載體小于90nm的孔占微球總孔隙的10%，90歷以上且小于IOOnm的孔道占總孔隙的30%, IOOnm以上且小于300nm的孔占微球總孔隙的40%, 300nm以上且小于500nm的孔道占微球總孔隙率的10%，最可幾孔徑為104nm。平均粒徑為 40微米，孔隙率60%，比表面積86m2/g，交聯(lián)度25%。實施例3 [最可幾孔徑為400nm PGMA微球]超大孔聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)微球(圖3)，該載體小于90nm的孔占微球總孔隙率的4%，90歷以上且小于IOOnm的孔道占微球總孔隙率的8% ；IOOnm以上且小于300nm的孔道占微球總孔隙率的30%，300nm以上且小于500nm的孔道占微球總孔隙率的45%，500nm以上且小于800nm的孔道占微球總孔隙率的10%，800_1000nm的孔道占微球總孔隙率的3%，最可幾孔徑為400nm。平均粒徑為30微米，孔隙率70%，比表面積^m2/ g，交聯(lián)度25%。 實施例4 [最可幾孔徑為200nm的PST-GMA復合微球]超大孔PST-GMA復合微球，該載體小于90nm的孔占微球總孔隙率的5%，90nm以上且小于IOOnm的孔道占微球總孔隙率的10% ；IOOnm以上且小于300nm的孔道占微球總孔隙率的40%，300nm以上且小于500nm的孔道占微球總孔隙率的30%，500nm以上且小于 SOOnm的孔道占微球總孔隙率的10%，SOO-IOOOnm的孔道占微球總孔隙率的5%，最可幾孔徑為200nm。平均粒徑為20微米，孔隙率80%，比表面積80m2/g，交聯(lián)度50%。實施例5 [最可幾孔徑為90nm的PHEMA微球]超大孔聚羥乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)微球，該載體小于90nm的孔占微球總孔隙率的25%，90nm以上且小于IOOnm的孔道占微球總孔隙率的30% ；IOOnm以上且小于300nm 的孔道占微球總孔隙率的20 %，300nm以上且小于500nm的孔道占微球總孔隙率的15 %，最可及孔徑為90nm。平均粒徑為10微米，孔隙率50%，比表面積50m2/g，交聯(lián)度25%。實施例6 [PVA修飾超大孔PST微球]超大孔PST微球表面修飾聚乙烯醇(PVA)形成的具有親水性表面的用于固定化酶的載體。取0.8g聚苯乙烯微球(實施例1所述微球)置于20mL 二氯甲烷中，加入無水三氯化鋁1.2g，攪拌均勻后，滴加氯乙酰氯0.8mL，30°C下反應證。無水狀態(tài)下抽濾，依次用冰鹽酸、去離子水、無水乙醇清洗，干燥后即得氯乙?；郾揭蚁┪⑶?。將所得氯乙?；郾揭蚁┪⑶?. 6g，在5mL DMF中溶脹過夜，加入35mL PVA的DMF溶液(PVA濃度為20mg/ mL)，在攪拌狀態(tài)下依次加入四丁基溴化銨0. 4g，氫氧化鈉0. 8g，70°C下反應Mh。過濾，用熱水洗去未偶聯(lián)上的PVA，真空干燥，即得PVA覆層聚苯乙烯微球。PVA偶聯(lián)量可以控制在 0. 8-1. Omg/m2，激光共聚焦顯微鏡觀察及BSA吸附實驗證明，微球的全部表面(包括所有內(nèi)部孔道表面)都已修飾上PVA。其他親水性化合物的化學修飾方法與此相同。實施例7 [瓊脂糖修飾超大孔PST微球]取l.Og瓊脂糖粉，在去離子水中加熱溶解后，加入IM NaOH溶液。在攪拌條件下加入一定量的苯基縮水甘油醚，在60°C下反應Mh，將所得反應液在無水乙醇中沉淀2次， 再用去離子水透析、凍干后得到苯氧基瓊脂糖。將所得的苯氧基瓊脂糖加熱溶解后配成一系列不同濃度的溶液，加入實施例1所述超大孔聚苯乙烯微球，濃度為70ml/g干球，在55°C 恒溫振蕩水浴槽中吸附Mh。吸附后的微球，用熱水清洗掉未吸附的瓊脂糖，收集濾液，用紫外分光光度計測定溶液在269nm的吸光度，確定瓊脂糖的吸附量。取所得瓊脂糖修飾微球2. 0g，置于去離子水中，根據(jù)瓊脂糖的吸附量，加入環(huán)氧氯丙烷或乙二醇二縮水甘油醚進行后交聯(lián)，在室溫下反應Mh，反應后再用去離子水清洗，并測定親水性物質(zhì)的吸附量。實施例8 [葡聚糖修飾超大孔PST微球]取l.Og葡聚糖粉，在去離子水中加熱溶解后，加入IM NaOH溶液。在攪拌條件下加入一定量的丁基縮水甘油醚，在60°C下反應Mh，將所得反應也在無水乙醇中沉淀2次， 再用去離子水清洗、凍干后得到丁基葡聚糖。將所得的丁基葡聚糖加熱溶解后配成一系列不同濃度的溶液，加入實施例1所述超大孔聚苯乙烯微球，濃度為70mL/g干球，在55°C恒溫振蕩水浴槽中吸附Mh，吸附后的微球過濾后用熱水清洗掉未吸附的葡聚糖。取所得葡聚糖修飾微球2. 0g，置于去離子水中，根據(jù)親水性物質(zhì)的吸附量，加入環(huán)氧氯丙烷或乙二醇二縮水甘油醚進行后交聯(lián)，在室溫下反應24h，反應后再用去離子水清洗，即得葡聚糖修飾超大孔PST微球。 實施例9 [殼聚糖修飾超大孔PGMA微球]取實施例2中所述的超大孔PGMA微球1. Og,放入200mL 二氧六環(huán)中充分溶脹，加入殼聚糖，用BF3-乙醚為催化劑，在攪拌條件下反應4h。所得產(chǎn)物用乙醇和去離子水反復洗滌，室溫下真空干燥Mh，得到殼聚糖修飾的超大孔PGMA微球。實施例10 [超大孔聚苯乙烯微球物理法固定脂肪酶]取實施例1中的超大孔聚苯乙烯微球，在乙醇中充分浸潤，而后用去離子水置換完全。精確稱取一定量的脂肪酶(Amano Lipase PS, from Burkholderia cepacia)加入 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(0. 1M，pH 7.0)中，4°C下攪拌至酶完全溶解。取15mL脂肪酶溶液置于反應瓶中，加入0. 5g已潤濕的聚苯乙烯微球，25°C下緩慢振蕩(20rpm)至達到吸附飽和。將混合物于20000rpm離心5min，去掉上清液，用緩沖液清洗3次，得到超大孔聚苯乙烯-脂肪酶固定化酶。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)酶能夠固定于載體內(nèi)部(圖 4a)，明顯區(qū)別于對照例中酶僅能在微球表層吸附的情況。微球表面的利用率約為90%。實施例11 [104nm PST微球物理法固定脂肪酶]取實施例2中的超大孔聚苯乙烯微球，按實施例10進行固定化酶操作，同樣發(fā)現(xiàn)， 酶可以固定于微球內(nèi)部(圖4b)。微球表面的利用率約為85%。實施例12 [常規(guī)多孔PST微球]取常規(guī)多孔聚苯乙烯微球進行對照實驗，該載體小于90nm的孔占微球總孔隙的 100%,最可幾孔徑為14. 7nm。平均粒徑為40微米，孔隙率60%，比表面積220m2/g，交聯(lián)度 25%。按照實施例10所述方法進行固定化酶，在飽和吸附情況下，仍發(fā)現(xiàn)酶主要分布于微球的表層，無法進入微球內(nèi)部(圖4c)。微球表面利用率約為39%。圖4d至圖4f是實施例10、實施例11和實施例12所制備固定化酶對應的熒光強度圖。圖4d和圖如的強度曲線比較平穩(wěn)，說明酶分子在整個微球內(nèi)分布都比較均勻，而圖 f在微球的殼層部分的強度表現(xiàn)為明顯雙峰，而球內(nèi)部強度很低，說明內(nèi)部基本沒有酶分子分布，酶分子主要分布于殼層。實施例13 [超大孔(孔徑313nm和104nm)和常規(guī)多孔PST微球固定化酶的對照實驗]參照文獻的標準方法，以橄欖油乳液為底物，檢測自由酶和實施例10、11、12所述固定化酶的活性。固定化酶的比活性(specific activity, U/mg protein):定義為每毫克固定化蛋白的活性單位；固定化酶的活性回收率(activity retention, % )定義為固定化酶的比活性與自由酶的比活性之比。三種固定化酶在載體上的載量和酶活差別較大，實施例10的固定化酶比活可達到自由酶的146% (表1)。酶的熱穩(wěn)定性實驗發(fā)現(xiàn)，在50°C進行操作時，他后，自由酶的保留活性只有57.0%，實施例10所得固定化酶的保留活性高達 94.3%，實施例11所得固定化酶的保留活性為85.9%，實施例12(對照例)所得固定化酶的保留活性為78. 5% (圖fe)。在70°C下進行評價，酶活的差別更大，自由酶幾乎失活，其保留活性只有3. 9%，實施例10所得固定化酶的保留活性仍可達84. 7%，實施例11所得固定化酶的保留活性為56.3%，實施例12(對照例)所得固定化酶的保留活性為31.9% (圖 5b)。實驗說明，超大孔用于固定化酶的載體能夠有效提高固定化酶的熱穩(wěn)定性，拓展了酶的使用范圍，能夠滿足較高溫度下進行反應的需要。對于上述三種固定化酶的儲存穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，固定于超大孔載體上的酶在室溫儲存15天的條件下，保留酶活可達到93%以上，而常規(guī)多孔固定化載體上保留酶活為 86. 2% (圖 6)。根據(jù)參考文獻[7]提供的方法，選用模擬體系對固定化酶的重復利用性進行了考察，超大孔微球在使用100次后，酶活仍保持95%以上，尤其是實施例10的固定化酶，酶活幾乎沒有降低。而實施例12的常規(guī)多孔固定化酶的酶活僅保持了 60% (圖7)。比較實施例10所得固定化酶和自由酶的米氏常數(shù)Km，自由酶的米氏常數(shù)為 0. 441mM，實施例11所得固定化酶的米氏常數(shù)與自由酶相近，為0. 438mM，而實施例10所得固定化酶的米氏常數(shù)為0. 402mM,比自由酶還要低，說明與底物具有良好的親和性，反應不受傳質(zhì)阻力的影響，載體具有良好的傳質(zhì)性能。表 1
~ 酶載量酶活性 Vc^ 相對活性 ““ (mg/g-載體) (UxIO2Zg-載體) (u/mg 蛋白質(zhì))_(%)
Γ PST-30016.35 ±0.232.28 士 0.75 97.5 士 6.56146.1± 4.51
PST-10018.13 士 0.2230.78 土 0.81169.8 ± 6.09125.8 ±4.49
Source-30 25.22 土 0.2617.33 士 0.1868.69 士 5.8350.88 ±3.93實施例14 [超大孔PGMA微球化學法直接固定脂肪酶]取實施例3中的超大孔PGMA微球，在乙醇中充分浸潤，而后用去離子水置換完全。 精確稱取一定量的脂肪酶(Candida antarctica Lipase B)加入Nii2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液 (0. 1M，pH 8.0)中，4°C下攪拌至酶完全溶解，置于4°C下備用。取15mL脂肪酶溶液置于反應瓶中，加入0.5g已潤濕的PGMA微球，25°C下緩慢振蕩(20rpm)至達到吸附飽和。將混合物于20000rpm離心5min，去掉上清液，用緩沖液清洗3次，得到超大孔PGMA-脂肪酶固定化酶。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)酶能夠固定于載體內(nèi)部。微球表面的利用率約為98%。自由酶的比活為4. 2U/mg,固定后酶的負載量可達47. 5mg/g-support,酶活為 327. 3U/g-support,比活可達 6. 89U/mgprotein，相對活性為 164. 1%。實施例15 [超大孔PST-GMA復合微球化學法直接固定脂肪酶]取實施例4中的超大孔PST-GMA微球，在乙醇中充分浸潤，而后用去離子水置換完全。精確稱取一定量的脂肪酶(Candida antarctica Lipase B)加入Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(0. ΙΜ,ρΗ 7.0)中，4°C下攪拌至酶完全溶解，置于4°C下備用。取15mL脂肪酶溶液置于反應瓶中，加入0. 5g已潤濕的PGMA微球，25°C下緩慢振蕩(20rpm)至達到吸附飽和。將混合物于20000rpm離心5min，去掉上清液，用緩沖液清洗3次，得到超大孔PGMA-脂肪酶固定化酶。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)酶能夠固定于載體內(nèi)部。微球表面的利用率約為95%。自由酶的比活為4. 2U/mg,固定后酶的負載量可達24. 4mg/g-support,酶活為 149. 5U/g-support,比活可達 6. 12U/mg protein，相對活性為 145. 7%0實施例16 [超大孔PGMA微球戊二醛法固定脂肪酶]取實施例3中所述超大孔PGMA微球0. 4g，在65°C下用0. lmol/L HCl水解12h， 用去離子水清洗至中性，加入10%的戊二醛酸性溶液25mL，室溫下震蕩12h，用去離子水洗去戊二醛。稱取適量假絲酵母脂肪酶，用PH 8.0的0. lmol/L磷酸緩沖液配成lOmg/mL的酶溶液。向裝有0. Ig載體的三角瓶中加入15mL配好的酶液，室溫下在搖床中反應一定時間，吸去酶液，用磷酸緩沖液清洗用于固定化酶的載體，直到洗液中不含蛋白質(zhì)為止。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)酶能夠固定于載體內(nèi)部。在最適條件下自由酶的活性為 88. 4U/mg,固定化酶的活性可達118U/mg。實施例17 [超大孔PHEMA微球環(huán)氧修飾固定淀粉酶]取實施例5中的超大孔PHEMA微球1. Og,加入IOmL環(huán)氧氯丙烷，30mL 二甲亞砜， 用NaOH調(diào)解pH為10-11，常溫反應4h。用2mol/L鹽酸滴定到中性，再用丙酮與清水洗凈， 得到環(huán)氧活化超大孔PHEMA微球。再加入0. 3g β -淀粉酶溶液和IOmL pH為8的磷酸緩沖液，在25°C下恒溫振蕩》1。反應結(jié)束后，用磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液(pH 7)充分洗去游離酶，即得固定化酶。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)酶能夠固定于載體內(nèi)部。微球表面的利用率為80%。在優(yōu)化條件下，固定化酶酶活達到180U/g，其pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性和重復使用次數(shù)都得到有效提高。實施例18 [PVA修飾超大孔PST微球化學法固定脲酶]取實施例6中的PVA修飾超大孔聚苯乙烯微球1. 0g，置于5%的戊二醛溶液中， 25°C恒溫振蕩池，用去離子水洗去游離的戊二醛，而后加入IOmL脲酶溶液，于4°C下固化池，得到固定化酶。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)酶能夠固定于載體內(nèi)部。用 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，求得固定化酶的米氏常數(shù)Km為1. 50mg/mL小于自由酶的 Kffl = 24. 8mg/mL，說明固定化酶對底物具有更好的親和力，載體具有良好的傳質(zhì)性能，同時酶的熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性和重復使用次數(shù)明顯優(yōu)于游離酶。實施例19 [瓊脂糖修飾超大孔PST微球固定谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶]取實施例7中的瓊脂糖修飾超大孔聚苯乙烯微球，加入一定濃度的戊二醛溶液， 25°C下振蕩交聯(lián)池，抽濾，用去離子水吸去游離的戊二醛后，再加入適量谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶液，30°C下恒溫振蕩1.證，使酶固定到載體上，再用pH 7. 0的磷酸緩沖液反復清洗載體，洗掉未交聯(lián)的游離酶，即得固定化酶。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)酶能夠固定于載體內(nèi)部。使用20次以上仍能保持80%以上的相對酶活，熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶。實施例20 [葡聚糖修飾超大孔聚苯乙烯微球固定果膠酶]取實施例8中的葡聚糖修飾超大孔PST微球0. Ig,加入20mL 3 %的戊二醛溶液中，25°C下振蕩交聯(lián)2h。洗去多余的戊二醛后，再加入果膠酶液(酶液用pH 3. 4的0. Imol/ L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液配制)，4°C下固定12h，用蒸餾水洗去未固定的酶，抽干即得固定化果膠酶。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)酶能夠固定于載體內(nèi)部。以2-10mg/mL 果膠為底物，分別測定不同底物濃度下固定化酶與溶液酶的酶活力，用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法，求得固定化酶的米氏常數(shù)Km為3. 24mg/mL小于自由酶的Km = 5. 16mg/mL, 說明底物和產(chǎn)物進出載體不受傳質(zhì)阻力影響，具有良好的傳質(zhì)性能，有利于果膠酶催化果膠的水解。實施例21 [磺化超大孔PST微球離子吸附木瓜蛋白酶]取實施例1中的超大孔聚苯乙烯微球l.Og，加入IOOmL濃硫酸，攪拌條件下于 60°C反應16h。反應結(jié)束后用蒸餾水反復清洗，得到磺化超大孔聚苯乙烯微球。將木瓜蛋白酶每溶液的PH調(diào)至低于8. 75，此時木瓜蛋白酶帶正電荷，加入一定量磺化超大孔聚苯乙烯微球，吸附lh，而后洗去未吸附的酶，即得固定化酶。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)酶能夠固定于載體內(nèi)部。酶的熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性和重復使用次數(shù)明顯優(yōu)于游離酶。實施例22 [殼聚糖修飾超大孔PGMA微球化學固定復酶]取實施例9中的殼聚糖修飾超大孔PGMA微球0. 5g，加入IOOmL 3%的戊二醛溶液中，25°C下振蕩交聯(lián)池。洗去多余的戊二醛后，再加入糖化酶和α-淀粉酶的復合酶液 (酶濃度為糖化酶20U/mL，α -淀粉酶MU/mL，用pH為7. 0的磷酸緩沖液溶解)，25°C下固定12h，用緩沖液洗去未固定的酶，抽干即得固定化復合酶。使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)酶能夠固定于載體內(nèi)部。測定酶的米氏常數(shù)為8. 9mg/mL，低于游離復合酶，說明載體具有優(yōu)良的傳質(zhì)性能。酶的熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性和重復使用次數(shù)明顯優(yōu)于游離酶。實施例23 [裝柱操作]取實施例15中的固定有脂肪酶的超大孔PGMA微球20. OmL，裝入內(nèi)徑為1.2cm， 柱長為20cm的反應柱中。將50g橄欖油加入IOOOmL異辛烷中，并加入25mM表面活性劑 (Aerosol 0T)，攪拌均勻，為底物溶液。將底物溶液加入3000mL水中，混勻成乳狀液。以 0. 5mL/L的速度將乳狀液加入反應柱中，柱溫為35°C，連續(xù)反應8h。測定底物轉(zhuǎn)化率為50 % 以上，酶活基本保持不變。本專利通過多種結(jié)構表征和性能測定手段分析了超大孔微球的結(jié)構特征，確定酶可以進入微球內(nèi)部進行固定，受到載體的良好保護。酶的熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性和重復使用次數(shù)明顯優(yōu)于游離酶，也優(yōu)于常規(guī)多孔微球載體。通過動力學研究證明底物和產(chǎn)物進出載體不受傳質(zhì)阻力影響，載體具有良好的傳質(zhì)性能。參考文獻[ljffeiqing Zhou, Tingyue Gu, Zhiguo Su, Guanghui Ma. Polymer,2007,48 (7) 1981-1988[2]ffeiqing Zhou, Tingyue Gu, Zhiguo Su, Guanghui Ma. Eur. Polym. J. , 2007, 43(10) :4493-4502[3]Regnier F E. Nature,1991, 350 :634-635[4]Zhang M L，Sun Y. J. Chromatogr. A,2001,922(1-2) :77-86[5]PE Gustavsson, PO Larsson. J. Chromatogr. A,1996, 734(2) :231-240[6]蔡宏舉，王滿意，周鑫，譚天偉.化工學報，2007，58 (6) =1529-1534[7]XH Hou, BL Liu, XB Deng, BT Zhang, HL Chen, R Luo. Analytic. Biochem.， 2007,368 :100-110。
權利要求
1.一種用于固定化酶的載體，該載體是一種具有90-1000nm大孔道的聚合物微球，小于90nm的孔道占微球總孔隙率的-30%,90nm以上且小于IOOnm的孔道占微球總孔隙率的5% -30%；IOOnm以上且小于300nm的孔道占微球總孔隙率的15% -75%,300nm以上且小于500nm的孔道占微球總孔隙率的15% -75%,500nm以上且小于800nm的孔道占微球總孔隙率的5% -20%,800-1000nm的孔道占微球總孔隙率的-20%，最可幾孔徑為 90-600nm。
2.如權利要求1所述的用于固定化酶的載體，其特征在于所述載體的表面為選自如下的表面疏水性表面、親水性表面、或兼有疏水和親水性的表面。
3.如權利要求1所述的用于固定化酶的載體，其特征在于所述聚合物選自如下聚合物(1)含有聚苯乙烯交聯(lián)結(jié)構的聚合物，或(2)含有聚丙烯酸結(jié)構的聚合物，或(3)含有聚丙烯酰胺結(jié)構的聚合物，或(4)含有環(huán)氧基的聚合物，或(5)含有羥基的聚合物，或(6) 含有羧基的聚合物，或(7)含有胺基的聚合物，或上述聚合物的復合物。
4.如權利要求1所述的用于固定化酶的載體，其特征在于所述聚合物的交聯(lián)度為 5% -75%。
5.如權利要求2所述的用于固定化酶的載體，其特征在于所述載體具有親水性表面， 并且所述載體是選自如下的聚合物微球(1)本身即為親水性的聚合物或親水-疏水復合聚合物載體；或( 疏水性微球或親水-疏水復合微球經(jīng)化學反應得到的親水性聚合物，或 (3)將親水性物質(zhì)通過物理吸附或化學交聯(lián)的方法修飾到微球表面得到的具有親水性表面的微球。
6.如權利要求5所述的親水性物質(zhì)選自聚乙烯醇、魔芋葡甘聚糖、葡聚糖、殼聚糖、明膠、海藻酸鹽、膠原、纖維素、卡拉膠、阿拉伯膠。
7.如權利要求1所述的用于固定化酶的載體，其特征在于，微球的粒徑為5-300微米。
8.如權利要求1所述的用于固定化酶的載體，其特征在于，最可幾孔徑為100-400nm。
9.如權利要求1所述的用于固定化酶的載體，其特征在于所述聚合物選自如下聚合物聚苯乙烯類聚合物、聚(甲基)丙烯酸類聚合物、聚(甲基)丙烯酸酯類聚合物、聚丙烯酰胺類聚合物、聚乙酸乙烯酯類聚合物、聚乙酸類聚合物、及其復合物。
10.如權利要求1所述的用于固定化酶的載體，其特征在于所述聚合物選自如下聚合物聚苯乙烯聚合物、聚甲基丙烯酸縮水甘油酯聚合物、聚羥乙基丙烯酸甲酯聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、及其復合物。
11.如權利要求1所述的用于固定化酶的載體，其特征在于所述聚合物的交聯(lián)度為 10% -40% O
12.如權利要求5所述的用于固定化酶的載體，其特征在于所述本身即為親水性的聚合物或親水-疏水復合聚合物載體是選自如下的聚合物微球聚羥乙基丙烯酸甲酯聚合物、聚甲基丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺類、聚乙烯醇聚合物。
13.如權利要求5所述的用于固定化酶的載體，其特征在于所述化學反應選自胺化、羧化、水解反應。
14.如權利要求1所述的用于固定化酶的載體，其特征在于，微球的粒徑為10-200微米。
15.如權利要求1所述的用于固定化酶的載體，其特征在于，微球的粒徑為30-100微米。
16.如權利要求1所述的載體在固定化酶中的用途，其中酶通過吸附或化學交聯(lián)的方法固定于載體上。
17.如權利要求1所述的載體在固定化酶中的用途，其中所述固定是單酶固定，也可以是復酶固定。
18.如權利要求17的用途，其中所述固定是復酶固定。
19.如權利要求17的用途，其中至少一部分酶固定于載體內(nèi)部。
20.一種固定有酶的載體，其包括如權利要求1所述的載體以及固定于所述載體上的酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型滲透性良好的用于固定化酶的載體，該載體是一種不僅具有小于90nm的中小孔，還具有上百納米大孔道的聚合物微球。該載體既可以用于單酶固定也可以用于復酶固定。微球表面的利用率可達70％-100％。本發(fā)明還涉及用于固定化酶的載體在固定化酶方面的用途以及固定有酶的載體。由于酶能夠固定于載體內(nèi)部，可以受到載體的良好保護，因此穩(wěn)定性、活性和重復使用性良好，尤其適于裝柱進行連續(xù)反應。
文檔編號C12N11/08GK102260662SQ201010189159
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月24日 優(yōu)先權日2010年5月24日
發(fā)明者周煒清, 李燕, 蘇志國, 馬光輝 申請人:中國科學院過程工程研究所