專(zhuān)利名稱(chēng)：高血壓易感基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2236058的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及人線粒體融合基因2 (Mfn2 gene)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn) rs2236058 及其 與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的檢測(cè)。本發(fā)明還涉及檢測(cè)這個(gè)SNP位點(diǎn)的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性高血壓(essential hypertension, EH)是一種多因素、多基因疾病，由環(huán) 境與遺傳因素共同致病的常見(jiàn)而多發(fā)的心血管病癥，對(duì)人類(lèi)健康造成了極大的影響。隨著 分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的高血壓相關(guān)基因已經(jīng)有150余種，但是EH的發(fā)病機(jī)制仍 然不完全清楚，高血壓的早期診斷和預(yù)防問(wèn)題仍然未能完全解決。EH是遺傳因子和環(huán)境共 同作用的結(jié)果，血壓的變化30%-60%歸因于遺傳。由于環(huán)境因素是可以控制和確認(rèn)的，而 對(duì)高血壓遺傳學(xué)因素卻是固定不變的。因此，對(duì)可變因素的控制，如對(duì)高血壓危險(xiǎn)因素的 預(yù)防，可以在一定程度上延緩和防止高血壓的發(fā)病，但是對(duì)固定不變的遺傳因素的認(rèn)識(shí)不 足卻在一定程度上嚴(yán)重影響著對(duì)高血壓發(fā)病、診斷和治療。因此對(duì)高血壓遺傳學(xué)的研究十 分必要(王佐廣，溫紹君，吳兆蘇.高血壓、易感基因與單核苷酸多態(tài)性[J].高血壓雜志， 2001,9 259-264)。近二十余年來(lái)，有關(guān)高血壓治療的研究更多地集中在對(duì)血壓的控制和對(duì)靶器官的 保護(hù)，并已取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。但是，這些手段并不能從根本上控制血壓，目前對(duì)人類(lèi)內(nèi) 源性抗高血壓基因的研究還很少，因此，研究?jī)?nèi)源性抗高血壓機(jī)制是今后高血壓防治研究 的主要方向之一，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景，如果通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗高血壓機(jī)制治 療高血壓病，將會(huì)促進(jìn)我國(guó)生物醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，并為我國(guó)每年節(jié)省巨大的醫(yī)療費(fèi)用。目前所發(fā)現(xiàn)的高血壓相關(guān)基因，歸結(jié)起來(lái)可以概括為促高血壓基因和抗高血壓 基因，Mfn2屬于后者。Mfn2的前身是我國(guó)學(xué)者陳光慧等[Chen GH, Zhang CH, Zhu YQ, et al. Expression of a novel gene related to hypertension[J]. Natl Med J China,1997, 77 =823-828.]于1997年對(duì)培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和正常Wistar Kyoto (WKY)大 鼠的血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行差異顯示，克隆出一個(gè)新基因——增殖抑制基因(hyperplasia suppressorgene, HSG)。它包含有4160bp的堿基對(duì)，共編碼661個(gè)氨基酸(NM_014874， GeneBank AccessU41803)。后經(jīng)一系列體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[Chen KH,Guo ΧΜ,Dalong Ma, et al. Dysregulationof HSG triggers vascular proliferative disorders[J]. Nature Cell Biol，2004，6，872-883. ]，HSG可以明顯地抑制Ras-Raf蛋白_絲裂素活化蛋白激酶 基因表達(dá)，并且可以激活抗癌基因的表達(dá)，有效地阻遏細(xì)胞周期和抑制多種細(xì)胞的增殖，且 這種抑制作用是通過(guò)細(xì)胞凋亡的方式實(shí)現(xiàn)的。因此HSG基因是原發(fā)性高血壓的候選基因 之一，后經(jīng)基因功能研究表明，HSG基因參與線粒體融合，因此正式命名為線粒體融合基因 2 (mitofusin 2，Mfn2)但是目前對(duì)Mfn2與EH的研究較少，沒(méi)有證實(shí)rs2236058與EH相關(guān) 性的報(bào)道。
綜上所述，為了最終實(shí)現(xiàn)治療高血壓，本領(lǐng)域迫切需要尋求原發(fā)性高血壓易感基 因，并開(kāi)發(fā)檢測(cè)原發(fā)性高血壓易感基因的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)高血壓易感基因的方法及檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了一種高血壓易感性基因的檢測(cè)方法，即檢測(cè)Mfn2基因rs2236058位 點(diǎn)的基因型，rs2236058帶有C基因型的個(gè)體高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于普通人群。所述的rs2236058，位于Mfn2的內(nèi)含子11中(片段重疊群contig :NT_021937. 19 位置8067093C/G)其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號(hào)rs2236058位置基于SEQ ID NO 1/6;引物 1 基于 SEQ ID NO :2/6 ；引物 2 基于 SEQ ID NO :3/6 ；探針 1 基于 SEQ ID NO 4/6 ； 探針2基于SEQ ID NO 5/6 ；擴(kuò)增產(chǎn)物基于SEQ ID NO :6/6。具體而言，該方法包括步驟(a)抽提樣品的基因組DNA，擴(kuò)增獲得Mfn2基因內(nèi)含 子11 ;(b)檢測(cè)步驟(a)產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2236058的基因型。所述的擴(kuò)增Mfn2基因內(nèi)含子11的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。所述的檢測(cè)rs2236058的基因型的探針序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示。上述方法中涉及的測(cè)序、擴(kuò)增、抽提基因組DNA等技術(shù)均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)操 作方法。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)高血壓易感基因的試劑盒，它含有與位點(diǎn)rs2236058結(jié)合 的探針。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，與位點(diǎn)rs2236058結(jié)合的探針的序列如SEQ ID NO 4 和 SEQID NO 5 所示。上述試劑盒還可以包括特異性擴(kuò)增Mfn2基因內(nèi)含子11中包含rs2236058位點(diǎn)的 區(qū)域的引物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，與特異性擴(kuò)增Mfn2基因內(nèi)含子11中包含rs2236058 位點(diǎn)的區(qū)域的引物的序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明經(jīng)過(guò)多年研究，首次證明了 Mfn2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2236058 (位 于Mfn2內(nèi)含子11中，片段重疊群contig :NT_021937. 19位置8067093C/G)與高血壓密切 相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能Mfn2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2236058位于Mfn2，內(nèi)含子 11中(片段重疊群contig :NT_021937. 19位置8067093C/G)基因型的改變將導(dǎo)致高血壓 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在Mfn2基因rs2236058C — G在病例和對(duì)照組中 的分布存在顯著性差異(P < 0. 05)，該SNP多態(tài)性可改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上 完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟檢測(cè)該 個(gè)體的Mfn2基因rs2236058位點(diǎn)的基因型，以此判斷該個(gè)體患高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是否高于 普通人群。在一優(yōu)選例中，所述的差異是選自rs2236058的單核苷酸多態(tài)性。rs2236058位 于Mfn2，內(nèi)含子11中(片段重疊群contig:NT_021937. 19位置8067093C/G)。其中，脫氧 核糖核酸(DNA)序列編號(hào)rs2236058位置基于SEQID NO :1/6。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品是否存在Mfn2基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用Mfn2基因內(nèi)含子11特異性引物擴(kuò)增樣品的基因組DNA，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2236058的基因型。Mfn2基因的詳細(xì)序列可參見(jiàn)登錄號(hào)為rs2236058的核苷酸序列(可參見(jiàn)網(wǎng)址 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。本發(fā)明人對(duì)Mfn2基因中的內(nèi)含子11中(片段重疊群contig :NT_021937. 19位置 8067093C/G)區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序。Mfn2基因rs2236058位點(diǎn)的多態(tài)性可直接用于高血壓的個(gè)性化治療。在使用本發(fā) 明Mfn2基因rs2236058位點(diǎn)的多態(tài)性時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療高血壓的藥劑。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效的本發(fā)明Mfn2蛋白以及藥學(xué) 上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、 乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形 式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑 和膠囊之類(lèi)的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠 囊在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天0. 1微克/千克體重-約 10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的Mfn2蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于普哺 乳動(dòng)物，其中該安全有效劑量通常至少約0. 1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò) 約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0. 1微克/千克體重_約100毫克/千克體重。當(dāng) 然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)。檢測(cè)Mfn2基因的rs2236058的基因型也可用于診斷高血壓。檢測(cè)可以針對(duì)基因 組DNA，也可針對(duì)Mfn2基因的擴(kuò)增片段。Mfn2基因的rs2236058的基因型可用已有的技術(shù) 如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)原發(fā)性高血壓易感性基因的方法，它包括檢測(cè)線粒體融合 基因2(Mfn2)的rs2236058位點(diǎn)的基因型，rs2236058帶有C基因型的個(gè)體，高血壓的易感 性顯著高于普通人群。本發(fā)明還公開(kāi)了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有擴(kuò)增rs2236058 位點(diǎn)的引物，還可以包括擴(kuò)增Mfn2基因第11號(hào)內(nèi)含子區(qū)域的引物。利用本發(fā)明檢測(cè) rs2236058位點(diǎn)的基因型，方法簡(jiǎn)單易行，快速高效，成本低廉，為高血壓的診斷和治療提供 了一個(gè)簡(jiǎn)捷的新途徑。


圖1是MFn2基因rs2236058位點(diǎn)基因型的檢測(cè)結(jié)果。圖2是測(cè)序結(jié)果截圖。顯示了 rs2236058的一種SNP基因型的測(cè)序結(jié)果。 rs2236058 位于 Mfn2，內(nèi)含子 11 中(片段重疊群 contig :ΝΤ_021937· 19 位置 8067093C/G)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。粚?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1熒光PCR檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)材料7900HT熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，聚合酶鏈反應(yīng)液(TaqMan EXPress Master Mix)由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)定制合成。二、引物及探針設(shè)計(jì)與合成以MFn2基因內(nèi)含子11的部分序列為模板，使用Primer ExpressTM 2. 0軟件分析 TaqMan引物和探針位點(diǎn)，并由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)定制合成。檢測(cè)用引物MFn2基因rs2236058上游引物序列5' -CTTGGGCAGTTAGGACACGC-3‘ (SEQ ID NO 2)MFn2 基因 rs2236058 下游引物序列5' -CCTCCAACACAGGGAATCG-3 ‘ (SEQ ID NO 3)熒光探針MFn2 基因 rs2236058 熒光探針 1 :5 ‘ -VIC-TCATCACCCCACCTGGTC-TAMRA-3 ‘ (SEQ ID N04)MFn2 基因 rs2236058 熒光探針 2:5' -FAM-TCATCACCCGACCTGGTC-TAMRA-3 ‘ (SEQ ID N05)三、樣本檢測(cè)實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)920例高血壓病例和500例正常對(duì)照人群，每例收集血樣標(biāo)本約2ml， 用酚/氯仿抽屜基因組DNA，抽提結(jié)果用微量紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(INFINIGEN公司) 檢測(cè)。按如下體系進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，最后用SDS 2. 3掃描并聚類(lèi)分析 四、型檢測(cè)結(jié)果
基因組DNA抽提的檢測(cè)結(jié)果所有樣本的基因組DNA符合檢測(cè)要求(260/280 > 1. 8，濃度> lOng/ul，如下圖所 示樣本1176號(hào)的檢測(cè)結(jié)果)MFn2基因rs2236058位點(diǎn)基因型的檢測(cè)結(jié)果 實(shí)施例2用測(cè)序法檢測(cè)原發(fā)性高血壓易感基因MFn2基因的rs2236058位點(diǎn)。挑選上述高 血壓病例_對(duì)照組樣本各10例進(jìn)行測(cè)序判斷rs2236058的基因型。一、實(shí)驗(yàn)方法PCR測(cè)序引物仍采用上述熒光PCR用引物，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測(cè)序。測(cè)序的 儀器是ABI公司的3130x1遺傳分析儀，用sequence analysis 5. 2分析軟件進(jìn)行分析，結(jié) 果用chromas也可以查看。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)序結(jié)果截圖如圖2所示。最終，20例的測(cè)序結(jié)果與7900熒光PCR的基因型分析結(jié)果完全一致。三、MFn2基因rs2236058基因型和高血壓易感的關(guān)聯(lián)分析MFn2基因rs2236058在高血壓病人和對(duì)照中分布的比較采用RxCx2檢驗(yàn).用 SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)結(jié)果及SPSS軟件分析結(jié)果如下表所示 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用做參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引 用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
一種高血壓易感性基因的檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)Mfn2基因rs2236058位點(diǎn)的基因型，rs2236058帶有C基因型的個(gè)體高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于普通人群。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，rs2236058位點(diǎn)位于Mfn2基因內(nèi)含子 11內(nèi)。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)抽提樣品的基因組DNA，擴(kuò)增獲得Mfn2基因內(nèi)含子11中包含rs2236058位點(diǎn)的區(qū)域；(b)檢測(cè)步驟(a)產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2236058的基因型。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，擴(kuò)增Mfn2基因內(nèi)含子11中包含 rs2236058位點(diǎn)的區(qū)域的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
5.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)rs2236058的基因型的探針序列如 SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
6.一種檢測(cè)高血壓易感基因的試劑盒，其特征在于，它含有與位點(diǎn)rs2236058結(jié)合的 探針。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，與位點(diǎn)rs2236058結(jié)合的探針的序列如 SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，它還包括特異性擴(kuò)增Mfn2基因內(nèi)含子11 中包含rs2236058位點(diǎn)的區(qū)域的引物。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，特異性擴(kuò)增Mfn2基因內(nèi)含子11中包含 rs2236058位點(diǎn)的區(qū)域的引物的序列如SEQID NO 2和SEQID NO 3所示。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)高血壓易感性基因的方法及其檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)原發(fā)性高血壓易感性基因的方法，它包括檢測(cè)線粒體融合基因2(Mfn2)/增殖抑制基因(HSG)rs2236058位點(diǎn)的基因型，rs2236058帶有C基因型的個(gè)體，高血壓的易感性顯著高于普通人群。本發(fā)明還公開(kāi)了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有擴(kuò)增rs2236058位點(diǎn)的引物，還可以包括擴(kuò)增Mfn2基因第11號(hào)內(nèi)含子內(nèi)包含rs2236058位點(diǎn)的區(qū)域的引物。利用本發(fā)明檢測(cè)rs2236058位點(diǎn)的基因型，方法簡(jiǎn)單易行，快速高效，成本低廉，為高血壓的診斷和治療提供了一個(gè)簡(jiǎn)捷的新途徑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101886125SQ20101018921
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月1日
發(fā)明者嚴(yán)山, 劉潔琳, 劉闊, 劉雅, 吳海, 文杰, 李志忠, 李瑤, 樓煜清, 溫紹君, 牛秋麗, 王佐廣, 謝毅, 顧偉 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院;復(fù)旦大學(xué)