專利名稱：一種α-半乳糖苷酶及其表達(dá)、純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的酶及其純化方法，特別是涉及一種細(xì)菌的α “半乳 糖苷酶(α-galactosidase)及其表達(dá)、純化方法。
背景技術(shù)：
1900年，Landsteiner首次發(fā)現(xiàn)ABO血型系統(tǒng)并提出同型輸血，為現(xiàn)代輸血醫(yī)學(xué)奠 定了基礎(chǔ)，Landsteiner因此獲得1930年諾貝爾獎(jiǎng)。1960年，Witkins證明ABH的抗原決 定簇是糖類，這一發(fā)現(xiàn)加深了人們對(duì)血型的認(rèn)識(shí)。近二十多年來(lái)，通過(guò)運(yùn)用其它學(xué)科先進(jìn)的 分析方法，輸血醫(yī)學(xué)得到長(zhǎng)足發(fā)展，在保障人民生命安全中發(fā)揮了巨大作用。然而，輸血安 全和血液偏型仍是擺在我們面前的兩大難題。長(zhǎng)期以來(lái)，因血型鑒定錯(cuò)誤、識(shí)別錯(cuò)誤等主客 觀因素引起的錯(cuò)誤輸血發(fā)生率居高不下，在科技發(fā)達(dá)的美國(guó)，錯(cuò)誤輸血發(fā)生率達(dá)1例/1. 2 萬(wàn)單位之多，其中，ABO血型不合的錯(cuò)誤率為1例/3. 3萬(wàn)單位，死亡率約1例/80萬(wàn)單位，是 輸血死亡的首要原因，比輸血傳播疾病(如HIV、HBV等)發(fā)生率(1例/200萬(wàn)單位)高得 多。由于目前紅細(xì)胞的保存期僅6周，在遇到長(zhǎng)節(jié)假日、寒暑假等情況時(shí)采血量大大減少， 很容易出現(xiàn)某種血型RBC供應(yīng)告急而其它型RBC過(guò)剩甚至過(guò)期以至浪費(fèi)的偏型現(xiàn)象。血液 偏型不僅危及需要輸血患者的生命安全，還造成巨大的浪費(fèi)，美國(guó)統(tǒng)計(jì)達(dá)6%之多，這對(duì)本 來(lái)就不充裕的血源來(lái)說(shuō)無(wú)疑是雪上加霜。人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)至少有29種，以ABO和Rh血型系統(tǒng)對(duì)輸血安全最為重要。0 型RBC不含A或B抗原，在RhD血型匹配的前提下，可安全地輸給A、B、AB或0型的受血者， 因此又被稱為“通用型RBC”。應(yīng)用通用型RBC可以極大的降低因ABO血型不合所致的輸血 反應(yīng)，提高輸血的安全性；解決血液偏型難題、減少血液浪費(fèi)；簡(jiǎn)化血液采集、儲(chǔ)存和配型 程序，提高血站和醫(yī)院輸血科的工作效率，輸血成本可節(jié)省近9%，據(jù)報(bào)道美國(guó)每年可節(jié)約 7億美元，保守估計(jì)我國(guó)每年可節(jié)約3億元。美國(guó)紅十字會(huì)血液中心科學(xué)主管Garratty預(yù) 計(jì)未來(lái)幾年內(nèi)有望將A、B或AB型RBC轉(zhuǎn)變成0型，屆時(shí)將只儲(chǔ)存和使用0型RBC，這將是輸 血醫(yī)學(xué)的一場(chǎng)革命。此外，在戰(zhàn)爭(zhēng)、恐怖襲擊、巨大災(zāi)難和其它突發(fā)事件中，及時(shí)安全的輸血 是救治傷員的一個(gè)關(guān)鍵因素。應(yīng)用通用型RBC時(shí)，無(wú)需檢查受血者的ABO血型，使用簡(jiǎn)便、 迅速、安全，可增強(qiáng)應(yīng)急輸血保障能力，提高傷員的存活率。ABH血型抗原的本質(zhì)為糖蛋白和糖脂，血型是由其末端糖鏈的種類及排列順序決 定的。0型RBC僅表達(dá)H抗原；B型RBC僅含B抗原，B抗原非還原端比H抗原多一個(gè)α-1，3 半乳糖；A型RBC較為復(fù)雜，主要分為Al和Α2兩種亞型。在Al亞型紅細(xì)胞上含有A和Al抗 原，而Α2型紅細(xì)胞上僅含有A抗原。Α2亞型RBC表面的人抗原比H抗原多一個(gè)α -1，3-Ν-乙 酰半乳糖胺，而Al亞型RBC表面的Al抗原比A抗原多一個(gè)N-乙酰半乳糖胺α 1 — 3 (巖藻 糖α 1 — 2)半乳糖[GalNAca 1 — 3 (Fuc α 1 — 2)Gal]三糖結(jié)構(gòu)，我國(guó)Al亞型占A型99% 以上；AB型RBC則含有A、B兩種抗原。糖苷水解酶酶解法是目前實(shí)現(xiàn)通用型紅細(xì)胞的最有前途的方法。糖苷水解酶存在廣泛，種類豐富。國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)根據(jù)作用機(jī)制和酶切底物分類，已正式命名了 150多類糖苷水解酶。這些糖苷水解酶部分來(lái)自高等動(dòng)物、酵母、黑曲霉等，這些酶 都是溶酶體酶，最適PH —般都在3. 5-4. 5之間，酶比活性一般不超過(guò)50U/mg，反應(yīng)需要高濃 度的酶蛋白(>3mg/mL)和低pH值，酶解不完全，不能滿足血型轉(zhuǎn)變要求。部分糖苷水解 酶來(lái)源于產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌、肺炎球菌、雙歧桿菌、空腸彎曲桿菌、黃桿菌、糞球菌等 微生物中。α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)可分別將B抗原非還原端的α_1，3半乳 糖酶切，生成O型紅細(xì)胞表面的H抗原。
國(guó)夕卜文獻(xiàn)(Liu QP, Sulzenbacher G, Yuan HP, et al. Bacterial glycosidasesfor the production of universal red blood cells[J]. Nat Biotechnol,2007,25 (3) 454-464.)提供了一種α-半乳糖苷酶，其來(lái)源于脆弱類桿菌，氨基酸殘基序列為605個(gè)氨 基酸，編碼基因在基因庫(kù)中登錄序列號(hào)為ΑΜ109954. 1(由1818個(gè)脫氧核苷酸組成)。該工 具酶具有酶解B型紅細(xì)胞功能，但酶比活僅為0. 3U/mg。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種可用于將人紅細(xì)胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)?型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型 的高活性的α-半乳糖苷酶。本發(fā)明所提供的α _半乳糖苷酶，名稱為α -gal,來(lái)源于脆弱類桿菌 (Bacteriodes fragilis) ATCC25285，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)將序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加并具有將人紅細(xì)胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)?型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型作用的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO :1由572個(gè)氨基酸殘基組成。編碼所述α -半乳糖苷酶的基因可命名為α _gal，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 3的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO=I的核苷酸序列；3)與序列表中SEQ ID NO 3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有將人 紅細(xì)胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)?型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO 3限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下與 NC膜或PVDF膜雜交并洗滌。序列表中的SEQ ID NO 3由1719個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中SEQ ID NO :1氨 基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種可表達(dá)可溶性且有活性的α “半乳糖苷酶的方法。木發(fā)明所提供的表達(dá)上述α -半乳糖苷酶的方法，是將含有上述α -半乳糖苷酶 基因的編碼序列插入表達(dá)載體中，再將構(gòu)建的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，經(jīng)表達(dá)、純化得 到高活性的α-半乳糖苷酶。
所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為 大腸桿菌。所述大腸桿菌具體可為BL21(DE3)、BL21(DE3, plysS), Ε. coli JM109, Ε. coliHBlOl 或 Ε· coli ToplO 等，優(yōu)選為 BL21 (DE3)。當(dāng)所述宿主為大腸桿菌時(shí)，用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為現(xiàn)有的在 上述大腸桿菌中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體。
所述重組表達(dá)載體具體可為將所述α-半乳糖苷酶基因的編碼序列(自5' 末端的第70至1785位核苷酸)插入pET-22b(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體 pET-22b_a -gal。具體來(lái)講，轉(zhuǎn)化有pET-22b_ α -gal的重組大腸桿菌為pET_22b- α -gal/大腸桿菌 BL21(DE3)上述重組表達(dá)載體和工程菌均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。培養(yǎng)含有本發(fā)明α -半乳糖苷酶基因編碼序列的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件， 均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。用上述方法表達(dá)的α-半乳糖苷酶以胞內(nèi)可溶形式存在，需要對(duì)其進(jìn)行純化，具 體方法包括以下步驟1)預(yù)處理用BufferA (20mM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，25mM NaCl，pH5. 0)懸浮 菌體沉淀，超聲破碎菌體，離心，取上清液用0. 45um膜過(guò)濾；2)陽(yáng)離子純化將上清液上樣至BufferA已經(jīng)平衡的陽(yáng)離子柱Histrap SP HP層 析柱，用BufferA洗滌，用BufferB (20mM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，300mM NaCl，pH7. 6) 洗脫目的蛋白；3)陰離子純化將洗脫蛋白調(diào)pH至8. 6，再用水將樣品稀釋至NaCl濃度為60mM， 上樣至BufferC(40mMTris-Hcl，IOmMNaCl，pH8. 6)平衡好的陰離子交換層析柱Hitrap Q XL，接流出液及平衡液，測(cè)活有活性，保留；用BufferC洗滌，用BufferD(40mMTriS-Hcl， 300mMNaCl, pH8. 6)洗脫，測(cè)活無(wú)活性；4)超濾將流出液采用超濾的方法進(jìn)行濃縮并更換緩沖液為酶解緩沖液(等滲的 檸檬酸_磷酸氫二鈉緩沖液，PH6. 8)，得到經(jīng)純化的α -半乳糖苷酶。本發(fā)明還提供了 一種用于將人紅細(xì)胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)?型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型 血型轉(zhuǎn)變的試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒，包含有本發(fā)明的α -半乳糖苷酶α -gal。本發(fā)明提供一種α-半乳糖苷酶及其編碼基因。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的α-半乳糖 苷酶α "gal能夠在中性pH下高效、完全酶解人RBC表面的B抗原，使之轉(zhuǎn)變?yōu)镠抗原，從 而實(shí)現(xiàn)B型RBC到0型RBC的轉(zhuǎn)變。表明α -gal可將人紅細(xì)胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)?型、由 AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型。本發(fā)明的α-半乳糖苷酶α-gal用途廣泛(可用于制備用于血型轉(zhuǎn)變 的試劑盒、通用型紅細(xì)胞等)，表達(dá)及純化方法簡(jiǎn)便、成本低廉，具有重要的臨床及科學(xué)研究 (可成為糖生物學(xué)研究的一個(gè)工具酶)意義，市場(chǎng)前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為α -gal全長(zhǎng)基因的PCR產(chǎn)物電泳圖譜圖2為α -gal基因編碼序列的PCR產(chǎn)物電泳圖譜圖3 為 pET-22b_ α -gal 的 PCR 鑒定圖譜圖4為pET-22b_ α -gal/大腸桿菌BL21 (DE3)的表達(dá)圖譜圖5為純化后的α -gal的SDS-PAGE圖譜圖6為用血型定型試劑檢測(cè)酶解前后紅細(xì)胞的血型顯微照片圖7為B型紅細(xì)胞與人源0型血清主側(cè)配血實(shí)驗(yàn)結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中末注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人所編《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所 述的條件，或按照制造廠商建議的條件。實(shí)施例1、α -半乳糖苷酶α -gal編碼基因的克隆用Promega公司的基因組DNA提取試劑盒并按照說(shuō)明書提取脆弱類桿菌 (Bacteriodes fragilis)ATCC25285 (購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(American TypeCulture Collection, ATCC))的基因組DNA。再以提取的基因組DNA為模板，用上游引物(序列為 5' -GC GGATCCATGAAGACAATCCTACTCTT-3‘)和下游引物(序列為5' GGAAGCTTTCGCTCTGAAATCTTCACGT-3 ‘)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 條件為先 95 °C 預(yù)變性5min ；然后95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸120s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C 延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示(M : DL2000DNA Marker, 1 α -gal的全長(zhǎng)基因)，得到分子量約為1788bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相 符?；厥詹⒓兓疨CR產(chǎn)物，將該P(yáng)CR產(chǎn)物與pGEM-T Easy質(zhì)粒(購(gòu)自Promega公司)連接， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-T Easy載體上的羧卞青霉素抗性 標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-α -gal。以該重組質(zhì)粒載 體上的SP6和T7序列為引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與序列表中SEQ ID NO 2 的核苷酸序列(GenBank :AM109955. 1，標(biāo)準(zhǔn)序列)相同。以pGEM-α -gal為模板，在上游引 物為5' -GGGGATCCTGATGACGACGACAAGGAGCGTGTTTATGACATT-3'(下劃線處為 BamH I 酶 切位點(diǎn)),下游引物為5' -GGAAGCTTTCGCTCTGAAATCTTCACGT-3‘(下劃線處為 Hind III 酶切位點(diǎn))的引導(dǎo)下擴(kuò)增α-半乳糖苷酶基因。PCR擴(kuò)增條件為先95°C預(yù)變性5min;然 后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸120s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。利用 BamH I和Hind III雙酶切將α -半乳糖苷酶基因克隆到表達(dá)載體pET_22b (+)中，命名為 pET-22b- α -gal。重組質(zhì)粒經(jīng)序列測(cè)定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，利用含有氨芐青霉 素的LB平板進(jìn)行篩選，提取生長(zhǎng)的菌落的質(zhì)粒，利用PCR和DNA測(cè)序方法進(jìn)行鑒定。測(cè)序結(jié)果表明本發(fā)明的α-半乳糖苷酶基因具有序列表中SEQ ID NO :3的核苷酸序列屬于重組DNA序列，由1719個(gè)堿基組成。序列表中SEQ ID NO 2第1_69位核苷酸為信 號(hào)肽的編碼序列，序列表中SEQ ID NO 3的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO 2的核苷酸序 列的第70-1788位堿基，且在1050位的堿基序列由G變成了 Α，其編碼序列表中SEQ ID NO 1 氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)(與SEQ ID NO :2的編碼蛋白相比去掉了 N端1-23位的信號(hào)肽)。
另外，本發(fā)明得到的SEQ ID NO 3的核苷酸序列與美國(guó)ZymeQuest公司的Liu等 發(fā)表的文章(NAT BI0TECHN0L. 2007 Apr ；25 :454_464)中記載的序列GenBank :AM109954. 1 不同，兩者相似性僅為23.6%。實(shí)施例2、α -半乳糖苷酶α -gal的表達(dá)及純化一、含有α -半乳糖苷酶α -gal基因編碼序列的表達(dá)載體pET_22b (+) - α -gal的 構(gòu)建 以 pGEM- α -gal 為模板，用上游引物(序列為5 ‘ -GGGGATCCTGATGACGACGACAAGG AGCGTGTTTATGACATT-3 ‘(具有BamH I 酶切位點(diǎn))，和下游引物(序列為5 ‘ -GGAAGCTTTCG CTCTGAAATCTTCACGT-3'(具有Hind III酶切位點(diǎn)))PCR擴(kuò)增α -半乳糖苷酶α -gal基因 編碼序列。PCR條件為先95°C預(yù)變性5min ；然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸 120s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(M :DL2000DNA Marker, 1 α -gal基因編碼序列)，得到分于量 約為1700bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。按照TaKaRa公司的操作指南，用BamH I和HindIII 雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-22b (+) (Novagen公司)，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收DNA片 段，用T4DNA Ligase (Promega公司)連接所得產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑 選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，用酶切法、PCR法和測(cè)序鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒，鑒定結(jié)果表明獲得了序列 及插入位置均正確的含有α "gal基因編碼序列的重組表達(dá)載體，命名為pET-22b-a -gal。 其中，pET-22b- α -gal 的 PCR 鑒定結(jié)果如圖 3 所示(M :DL2000DNA Marker ； 1-8 質(zhì)粒 pET-22b-a-gal的菌落PCR結(jié)果)，得到約為1700bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。二、α -半乳糖苷酶α -gal的表達(dá)將質(zhì)粒pET 22b-α-gal轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)酶切法、PCR法 和測(cè)序鑒定，篩選得到轉(zhuǎn)入pET-22b-a-gal的陽(yáng)性細(xì)胞，所得的陽(yáng)性細(xì)胞即為可以表達(dá)目 的蛋白的遺傳工程宿主細(xì)胞，將該陽(yáng)性菌稱為pET-22b-a -gal/大腸桿菌BL21 (DE3)。將pET-22b_ α -gal大腸桿菌BL21 (DE3)劃線接種于LB固體培養(yǎng)基(含氨卡青 霉素60ug/mL)培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落接種于3mL LB液體培養(yǎng)基(含氨卡青霉素60ug/ ml)培養(yǎng)過(guò)夜，以1 100的體積比稀釋過(guò)夜培養(yǎng)菌液于LB液體培養(yǎng)基(含氨卡青霉素 60ug/ml)中，于37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)至菌液0D600達(dá)到0. 8時(shí)，加異丙基硫代半乳糖 苷(IPTG)至終濃度0. 25mmol/L，于37°C誘導(dǎo)表達(dá)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，4°C離心收集菌體。 pET-22b-a-gal/大腸桿菌BL21(DE3)的表達(dá)圖譜如圖4所示(1 誘導(dǎo)菌的超聲上清，2 誘 導(dǎo)菌的超聲沉淀)。三、α -半乳糖苷酶α -gal的純化用本發(fā)明的方法對(duì)步驟二表達(dá)的α-半乳糖苷酶α-gal進(jìn)行純化，具體方法包括 以下步驟1)預(yù)處理用1/10體積的BufferA(20mM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，25mM NaCl, pH5. 0)懸浮菌體沉淀，超聲破碎菌體。IOOOOrpm離心20min，取上清液用0. 45um膜過(guò)濾。2)陽(yáng)離子純化將上清液上樣至BufferA已經(jīng)平衡的陽(yáng)離子柱(HistrapTM SP HP 層析柱)(購(gòu)自 公司)，用10倍柱體積的Buffer A(20mM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，25mM NaCl，pH5. 0)洗滌，用 Buffer B(20mM 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，300mM NaCl, pH7. 6)洗 脫目的蛋白。
3)陰離子純化將洗脫蛋白用IM Tris調(diào)pH至8. 6，再用水將樣品稀釋至NaCl濃 度為60mM，上樣至Buffer C (40mMTris-Hcl，IOmMNaCl，pH8. 6)平衡好的陰離子交換層析柱 (Hitrap Q XL)(購(gòu)自GE公司)，接流出液及平衡液，測(cè)活有活性，保留。用10倍柱體積的 Buffer C 洗滌，用 Buffer D (40mMTris-Hcl, 300mMNaCl, pH8. 6)洗脫，測(cè)活無(wú)活性。4)超濾將流出液采用超濾的方法進(jìn)行濃縮并更換緩沖液為酶解緩沖液(等滲的 檸檬酸_磷酸氫二鈉緩沖液，PH6.8)。將純化產(chǎn)物進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳鑒定，電泳結(jié)果如圖5所示(1 純化后的 α -gal, 2 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 116. 0,66. 2，45. 0,35. 0,25. 0，18. 4，14. 4)，表明獲得了分子 量為64. 6KD的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。濃縮后的蛋白用BCA蛋白定量試劑盒(pierce 公司)確定蛋白濃度，根據(jù)酶活定義用單糖底物(Gal α -pNPsubstrate)對(duì)蛋白的活性進(jìn)行 測(cè)定。結(jié)果純化后得到了電泳純的重組細(xì)菌α-半乳糖苷酶，比活由純化前的0.42U/mg提 高到了 2. lU/mg。另一方面，將本發(fā)明的純化工藝與國(guó)外文獻(xiàn)(Liu QP, Sulzenbacher G, YuanHP, et al.Bacterial glycosidases for the production of universal red bloodcells[J]. Nat Biotechnol，2007，25(3) =454-464.)進(jìn)行比較，該文獻(xiàn)介紹的純化方法，在陽(yáng)離子純 化前，還需經(jīng)過(guò)親和層析的步驟，操作繁雜，另外，本發(fā)明前處理中用超聲破菌的方法，并對(duì) 后續(xù)操作的控制參數(shù)進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化，提高了純化效果。文獻(xiàn)中用單糖底物(Gala-pNP substrate)對(duì)純化后的重組細(xì)菌α -半乳糖苷酶測(cè)活時(shí)其比活僅為0. 3U/mg，說(shuō)明本發(fā)明 表達(dá)的重組細(xì)菌α -半乳糖苷酶的活性更好，是其7倍(2. lU/mg)。實(shí)施例3、用α -半乳糖苷酶α -gal將人紅細(xì)胞由B型轉(zhuǎn)變?yōu)?型分別用生埋鹽水洗滌人B型紅細(xì)胞(307醫(yī)院輸血科提供)2遍，用酶解緩沖液(等 滲的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液，PH6. 8)洗滌人B型紅細(xì)胞2遍，取0. 2mL壓積B型紅細(xì)胞， 加入實(shí)施例2表達(dá)及純化的α -半乳糖苷酶50ug，用酶解緩沖液補(bǔ)夠0.5mL, 26°C孵育2小 時(shí)，其間不停搖晃使其均勻酶解。用抗B血型定型試劑(長(zhǎng)春博德生物技術(shù)公司)和主側(cè) 交叉配血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血型。1、用血型定型試劑檢測(cè)紅細(xì)胞血型取酶解前或酶解后的紅細(xì)胞40ul，生理鹽水洗滌2次，配成5%的細(xì)胞懸液，在載 玻片上的兩側(cè)各加入20ul的抗B、抗A抗體(購(gòu)自長(zhǎng)春博德生物技術(shù)公司)，再加入等量的 紅細(xì)胞懸液，充分混勻，用顯微鏡觀察結(jié)果。血型定型試劑檢測(cè)結(jié)果如圖6所示(1 酶解前 B型紅細(xì)胞，與抗B單抗強(qiáng)凝集，2 酶解后B型紅細(xì)胞，抗B單抗不凝集)，α _半乳糖苷酶 (alpha-galactosidase)酶解前B型紅細(xì)胞與抗A不凝集、與抗B強(qiáng)凝集。酶解后的B型 紅細(xì)胞與抗A、抗B均不凝集。本發(fā)明的α -gal將B型RBC表面的人抗原以及B型RBC表 面的B抗原最外側(cè)的α _1，3半乳糖苷鍵斷裂，將α-半乳糖胺降解掉，使B抗原均轉(zhuǎn)化為 H抗原，從而說(shuō)明α -gal為一種α -半乳糖苷酶(alpha-galactosidase)。2、用主側(cè)交叉配血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)酶解前后的紅細(xì)胞取酶解前或酶解后的紅細(xì)胞，用生埋鹽水洗滌2次，配成5%的細(xì)胞懸液。在載玻 片上的加入20ul的人源0型血清(307醫(yī)院輸血科提供)，再加入等量的紅細(xì)胞懸液，充分 混勻，用顯微鏡觀察。結(jié)果如圖7所示(1 酶解前B型紅細(xì)胞與人源0型血清凝集，2 酶解 后的紅細(xì)胞與人源0型血清不凝集，呈0型)，發(fā)現(xiàn)酶解前的B型紅細(xì)胞與0型血清凝集，酶解后的B型紅細(xì)胞與O型血清不凝集，說(shuō)明α-gal已將紅細(xì)胞分別由B型轉(zhuǎn)變O型。實(shí)施例4、用于將人紅細(xì)胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)?型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型血型轉(zhuǎn)變的 試劑盒將α-半乳糖苷酶a-gal(50mg)、四聯(lián)袋(分別為空袋，裝有250ml生理鹽水 的 袋子，裝有250ml酶解緩沖液的袋子，裝有50ml紅細(xì)胞保存液的袋子)、抗A血型定型試劑 (50ul)、抗B血型定型試劑(50ul)共同包裝，得到用于將人紅細(xì)胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)?型、 由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型血型轉(zhuǎn)變的試劑盒。
權(quán)利要求
一種α-半乳糖苷酶，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有將人紅細(xì)胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)镺型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型作用的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述α-半乳糖苷酶的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 3的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 1的核苷酸序列；3)與序列表中SEQID NO :3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有將人紅細(xì) 胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)?型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQID NO :3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2所述基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
4.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述α-半乳糖苷酶的方法，是將含有權(quán)利要求2所述α-半 乳糖苷酶基因的編碼序列插入表達(dá)載體中，再將構(gòu)建的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，經(jīng)表 達(dá)、純化得到高活性的α-半乳糖苷酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述宿主為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物 細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌；所述大腸桿菌為BL21(DE3)、BL21(DE3，plysS)，E. coli JM109， E.coli HBlOl 或Ε. coli ToplO。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將所述 α-半乳糖苷酶基因的編碼序列插入pET_22b(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體 pET-22b_a -gal。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)化有pET-22b-a-gal的重組大腸桿菌 為 pET-22b- α -gal/ 大腸桿菌 BL21 (DE3)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6或7所述的方法，其特征在于所述對(duì)表達(dá)的α-半乳糖苷 酶進(jìn)行純化的過(guò)程，依次包括超聲破菌的預(yù)處理、陽(yáng)離子純化、陰離子純化和超濾的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述對(duì)表達(dá)的α-半乳糖苷酶進(jìn)行純化 的過(guò)程，具體包括以下步驟1)預(yù)處理用BufferA(20mM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，25mM NaCl, pH5. 0)懸浮菌 體沉淀，超聲破碎菌體，離心，取上清液用0. 45um膜過(guò)濾；2)陽(yáng)離子純化將上清液上樣至BufferA已經(jīng)平衡的陽(yáng)離子柱HistrapTMSP HP層析 柱，用Buffer A洗滌，用Buffer B(20mM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，300mMNaCl，pH7. 6)洗 脫目的蛋白；3)陰離子純化將洗脫蛋白調(diào)pH至8.6，再用水將樣品稀釋至NaCl濃度為60mM，上 樣至 Buffer C(40mMTris-Hcl, IOmMNaCl, ρΗ8. 6)平衡好的陰離子交換層析柱 Hitrap Q XL,接流出液及平衡液，測(cè)活有活性，保留；用Buffer C洗滌，用BufferD (40mMTriS-Hcl， 300mMNaCl, pH8. 6)洗脫，測(cè)活無(wú)活性；4)超濾將流出液采用超濾的方法進(jìn)行濃縮并更換緩沖液為酶解緩沖液(等滲的檸檬 酸_磷酸氫二鈉緩沖液，PH6. 8)，得到經(jīng)純化的α -半乳糖苷酶。
10.一種用于將人紅細(xì)胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)?型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型血型轉(zhuǎn)變的試劑 盒，包含有權(quán)利要求1所述的α “半乳糖苷酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種α-半乳糖苷酶及其表達(dá)、純化方法。該α-半乳糖苷酶由序列表中的SEQ ID NO1表示，由脆弱類桿菌(Bacteriodes fragilis)ATCC25285的重組基因組DNA序列SEQ ID NO3編碼得到，為具有將人紅細(xì)胞血型由B型轉(zhuǎn)變?yōu)镺型、由AB型轉(zhuǎn)變?yōu)锳型作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的α-半乳糖苷酶用途廣泛，表達(dá)及純化方法簡(jiǎn)便、成本低廉，具有重要的臨床及科學(xué)研究意義，市場(chǎng)前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N1/15GK101845425SQ20101018998
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者季守平, 宮鋒, 李素波, 檀英霞, 王玲燕, 王穎麗, 虞立霞, 金泗虎, 高紅偉, 鮑國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所