專利名稱：一種用于發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的節(jié)桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷節(jié)桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)磷酸腺苷是人體內(nèi)廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質(zhì)，作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，它對(duì)糖、脂肪、核酸、蛋白質(zhì)等的代謝以及合成調(diào)節(jié)起著重要的作用。臨床上用于治療心絞痛、心肌梗死、心肌炎及心源性休克；對(duì)改善風(fēng)濕性心臟病的心悸、氣急、胸悶等癥狀也有一定的作用；可提高急性白血病結(jié)合化療的療效，亦可用于急性白血病的誘導(dǎo)緩解； 此外，對(duì)老年慢性支氣管炎、各種肝炎和銀屑病也有一定療效。環(huán)磷酸腺苷也可作為藥物中間體制備二丁酰環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸腺苷葡甲胺，提高脂溶性，從而更有效地發(fā)揮生理及藥理作用。環(huán)磷酸腺苷亦可用于畜禽食品添加劑，在離體條件下模擬生長(zhǎng)激素的作用，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，增加優(yōu)質(zhì)禽產(chǎn)品產(chǎn)量。環(huán)磷酸腺苷的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法三種。國(guó)內(nèi)外產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)全部采用化學(xué)合成法，以一磷酸腺苷為原料，采用高效分離柱進(jìn)行中間體分離，該方法溶劑損耗量大，收率低，成本高，產(chǎn)量小，且環(huán)境污染嚴(yán)重。利用酶法可以高效地催化三磷酸腺苷生成環(huán)磷酸腺苷，但是此方法僅僅局限于實(shí)驗(yàn)室階段，離產(chǎn)業(yè)化還有一定的距離。目前，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有發(fā)酵法制備環(huán)磷酸腺苷的報(bào)道。在國(guó)外，1963年馬克曼等在大腸桿菌Crookes株細(xì)胞中最早檢出了 1. 1納克/毫升的環(huán)磷酸腺苷。1971年，石山等分離篩選了某種小桿菌No. 205 ATCC21376以及數(shù)株屬于榜狀桿菌科的細(xì)菌，通過(guò)化學(xué)誘變成抗藥性突變株后，可從葡萄糖直接發(fā)酵生成2g/L以上的環(huán)磷酸腺苷。1973年，鈴木報(bào)道，利用烴同化菌玫瑰色石蠟節(jié)桿菌ATCC15584菌株，能以正十四烷為碳源，發(fā)酵積累1. 4g/L環(huán)磷酸腺苷。離子注入技術(shù)作為一種生物品種改良的新技術(shù)已在誘變育種、植物轉(zhuǎn)基因、生命起源和進(jìn)化以及環(huán)境輻射與人類健康等方面取得了一些重要研究成果。其中，在微生物誘變育種的研究中，離子注入已廣泛用于對(duì)微生物菌種的誘變育種，并取得了良好效果。離子注入與傳統(tǒng)誘變?cè)聪啾?，除了具有能量沉積效應(yīng)外，還有動(dòng)量傳遞、質(zhì)量沉積及電荷中和與交換效應(yīng)，是一種將物理誘變和化學(xué)誘變特性集于一身的綜合誘變方法，能夠在低劑量注入、細(xì)胞損傷較輕的情況下，強(qiáng)烈地影響生物細(xì)胞的生理、生化性能，造成遺傳物質(zhì)的基本單位-堿基的改變，誘發(fā)染色體結(jié)構(gòu)變異(余增亮，物理，1997，沈(6) :333-338)。趙洪英 (天津理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，17(1) :14-17)等用礦離子注入慶大霉素產(chǎn)生菌的成熟孢子，經(jīng)篩選得到的菌株產(chǎn)抗生素能力提高27. 39%。王紀(jì)(微生物學(xué)雜志，1998，18 ) :25-28)等通過(guò)離子注入誘變篩選得到一株遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌，得率較出發(fā)菌提高55% 60%。 姚建銘(生物工程學(xué)報(bào)，2000 (16) =478-481)等應(yīng)用離子注入誘變篩選得到高產(chǎn)花生四烯酸的一株菌株，并應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，其產(chǎn)量比國(guó)外專利報(bào)道高1倍
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株環(huán)磷酸腺苷的高產(chǎn)發(fā)酵。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種用于發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的節(jié)桿菌，該節(jié)桿菌的保藏編號(hào)為CGMCC No. 3584。這種作為生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的節(jié)桿菌的分類命名為節(jié)桿菌 (Arthrobacter sp.)A302,目前該菌株已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3584，保藏日期為2010年1月18日。該菌株是通過(guò)對(duì)土壤篩選到的節(jié)桿菌進(jìn)行低能離子束注入，然后將誘變后的菌株轉(zhuǎn)接于平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選單菌落轉(zhuǎn)接于牛肉膏斜面培養(yǎng)，后經(jīng)含碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水的液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)從而篩選出的環(huán)磷酸腺苷高產(chǎn)菌。CGMCC No. 3584菌株具有下述性質(zhì)1、菌落形態(tài)學(xué)特征在固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形，濕潤(rùn)，低凸起，表面光滑，直徑為約1.5-2mm;有光澤，菌落呈黃色，幼齡菌為淺黃色，隨著菌齡增加，菌落呈深黃色2、生理與生化特性菌株為專性好氧菌，厭氧條件不生長(zhǎng)；氧化酶反應(yīng)為陰性，接觸酶反應(yīng)為陽(yáng)性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陽(yáng)性；該菌的最佳生長(zhǎng)溫度為30°C，最適pH值為7. 0，可在pH 10. 0下生長(zhǎng)；最適的NaCl濃度為(質(zhì)量比)，在NaCl濃度為5% (質(zhì)量比)時(shí)也能生長(zhǎng)；有耐熱性(55°〇，加熱20分鐘)。3、16S rDNA 序列分析CGMCC No. 3584菌株的16S rDNA序列已在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登記，登記號(hào)為 GQ141738。將所測(cè)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)種進(jìn)行比較，構(gòu)建16S rDNA全序列為基礎(chǔ)系統(tǒng)的發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明菌株A302與節(jié)桿菌(Arthrobacter)的同源性達(dá)到99%，因此認(rèn)定本發(fā)明得到的菌株為節(jié)桿菌，即節(jié)桿菌A302 (CGMCC No. 3584)。4、營(yíng)養(yǎng)特征該菌能利用葡萄糖、肌醇、山梨醇、木糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、棉籽糖、乳糖、鼠李糖；水解尿素，不產(chǎn)生H2S ；噴哚反應(yīng)為陰性；可水解淀粉，不水解明膠。本發(fā)明還提供了上述節(jié)桿菌在提高發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的產(chǎn)量中的應(yīng)用。本發(fā)明又提供了一種生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的發(fā)酵方法，該方法包括采用上述節(jié)桿菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵。在上述發(fā)酵方法中，液體種子培養(yǎng)基可以包含碳源1 100g/L，優(yōu)選為10 30g/L ；氮源1 100g/L,優(yōu)選為10 30g/L ；無(wú)機(jī)鹽0. 01 100g/L, 1 10g/L ；其余為水。液體發(fā)酵培養(yǎng)基可以包含碳源1 100g/L，優(yōu)選為30 50g/L ；氮源1 100g/L，優(yōu)選為10 30g/L ；無(wú)機(jī)鹽0. 01 100g/L，10 20g/L ；其余為水。其中，碳源可以選自葡萄糖、木糖、果糖和甘油中的一種或多種；氮源可以選自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、尿素和硫酸銨中的一種或多種；無(wú)機(jī)鹽可以選自鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、鹽酸鹽和硫酸鹽中的一種或多種。液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH可以為4. 5 9. 5，優(yōu)選為6 8。在上述發(fā)酵方法中，發(fā)酵溫度可以為25 37°C，優(yōu)選為30 35°C;發(fā)酵時(shí)間可以為對(duì) 120小時(shí)，優(yōu)選為60 100小時(shí)。其中，發(fā)酵前按照體積比為1 30 100，優(yōu)選為8 12 100的接種量接種。本發(fā)明的有益效果包括1.與傳統(tǒng)的輻射法及化學(xué)誘變劑相比，離子束誘變具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定、易于獲得理想新品種等特點(diǎn)。2.本發(fā)明的環(huán)磷酸腺苷高產(chǎn)菌節(jié)桿菌A302 (CGMCC No. 3584)，具有高產(chǎn)性狀穩(wěn)定的特點(diǎn)，該菌株經(jīng)過(guò)10代以上傳代，生產(chǎn)環(huán)磷酸酸的性能保持穩(wěn)定。3.本發(fā)明的環(huán)磷酸腺苷高產(chǎn)菌節(jié)桿菌A302(CGMCC No. 3584)能夠利用多種碳源和氮源發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷，操作方便簡(jiǎn)單。牛物材料的保藏節(jié)桿菌(ArthrcAacter sp. )A302已經(jīng)于2010年1月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 3584。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，根據(jù)下述實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易理解的是，實(shí)施例所描述的具體物料配比、 工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)所涵蓋的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1以從土壤中分離得到的產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的菌株為出發(fā)菌株，將經(jīng)N+離子束誘變(低能離子注入機(jī)靶室內(nèi)真空度為2X 10_4，注入能量為20kev，劑量為5X 1013ions ^nT2. s—1)后的孢子懸浮液經(jīng)無(wú)菌水稀釋100倍后，取0. Iml涂布于牛肉膏平板培養(yǎng)基上30°C下培養(yǎng)3 天，從中挑選單菌落在牛肉膏斜面培養(yǎng)2天。轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 3g/L)的500mL搖瓶中，于30°C 下250rpm搖床培養(yǎng)20小時(shí)。再轉(zhuǎn)接4mL于裝有40mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖50g/L， K2HP0410g/L, KH2P0410g/L, MgS04lg/L，尿素 5g/L，蛋白胨 5g/L)的 500mL 搖瓶中，于 30°C下 ^Orpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)。經(jīng)過(guò)初篩，得到88株比出發(fā)菌株產(chǎn)量高的突變株。用同樣的條件下進(jìn)行復(fù)篩，最終得到產(chǎn)量最高的菌株A302，環(huán)磷酸苷產(chǎn)量最高產(chǎn)量達(dá)到2. 4g/L， 比原始菌株的1. 2g/L提高2倍。實(shí)施例2將菌株A302從牛肉膏斜面轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/ L，蛋白胨8g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏15g/L，NaCl 3g/L)的500mL搖瓶中，于30°C下250rpm 搖床培養(yǎng)20小時(shí)。轉(zhuǎn)接4mL于裝有40mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖40g/L，K2HP0410g/L, KH2P045g/L，MgS044g/L，尿素 8g/L，蛋白胨 5g/L)的 500mL 搖瓶中，于 32°C下 ^Orpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)。環(huán)磷酸苷產(chǎn)量達(dá)到2. Og/L。實(shí)施例3將菌株A302從牛肉膏斜面轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖IOg/ L，蛋白胨3g/L，酵母膏4g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 3g/L)的500mL搖瓶中，于30°C下250rpm 搖床培養(yǎng)20小時(shí)。轉(zhuǎn)接4mL于裝有40mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖45g/L，K2HP045g/L,KH2P0410g/L, MgSO4O. 5g/L，尿素 3g/L，蛋白胨 5g/L)的 500mL 搖瓶中，于 30°CT 300rpm 搖床發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)。環(huán)磷酸苷產(chǎn)量達(dá)到3. 6g/L。實(shí)施例4將菌株A302連續(xù)傳10代，在實(shí)施例3的培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷。結(jié)果表明(見(jiàn)表1和幻，連續(xù)10代遺傳培養(yǎng)，菌株A302生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的性能穩(wěn)定。表1連續(xù)傳1 5代的菌株A302的生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷性能
權(quán)利要求
1.一種用于發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的節(jié)桿菌，該節(jié)桿菌的保藏編號(hào)為CGMCC No. 3584。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的節(jié)桿菌在提高發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的產(chǎn)量中的應(yīng)用。
3.—種生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的發(fā)酵方法，該方法包括采用根據(jù)權(quán)利要求1所述的節(jié)桿菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵的液體種子培養(yǎng)基包含碳源 1 100g/L，優(yōu)選為10 30g/L ；氮源1 100g/L，優(yōu)選為10 30g/L ；無(wú)機(jī)鹽0. 01 100g/L，優(yōu)選為1 10g/L ；其余為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵的液體發(fā)酵培養(yǎng)基包含碳源 1 100g/L，優(yōu)選為30 50g/L ；氮源1 100g/L，優(yōu)選為10 30g/L ；無(wú)機(jī)鹽0. 01 100g/L，10 20g/L ；其余為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述碳源選自葡萄糖、木糖、果糖和甘油中的一種或多種
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述氮源選自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、尿素和硫酸銨中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述無(wú)機(jī)鹽選自鉀鹽、鈉鹽、 磷酸鹽、鹽酸鹽和硫酸鹽中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求3至8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始 pH為4. 5 9. 5，優(yōu)選為6 8。
10.根據(jù)權(quán)利要求3至9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵溫度為25 37°C，優(yōu)選為30 35°C ；發(fā)酵時(shí)間為M 120小時(shí)，優(yōu)選為60 100小時(shí)。
11.根據(jù)權(quán)利要求3至10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵前按照體積比為 1 30 100，優(yōu)選為8 12 100的接種量接種。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的節(jié)桿菌及其應(yīng)用，該節(jié)桿菌的保藏編號(hào)為CGMCC No.3584。保藏編號(hào)為CGMCC No.3584的本發(fā)明的節(jié)桿菌A302菌株比出發(fā)菌株的環(huán)磷酸腺苷產(chǎn)量提高了3倍，該菌株經(jīng)過(guò)10代以上傳代，生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的性能保持穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12P19/32GK102268385SQ20101019151
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者應(yīng)漢杰, 柏建新, 熊健, 陳勇, 陳曉春 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)