專利名稱：嗜尼古丁節(jié)桿菌在透明質(zhì)酸降解中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嗜尼古丁節(jié)桿菌在透明質(zhì)酸降解中的應(yīng)用，特別涉及一株產(chǎn)透明質(zhì)酸 酶的嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)CGMCC N01. 1933在降解透明質(zhì)酸中 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸，又名玻尿酸，是體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)。透明質(zhì)酸在不同的代謝階 段，因其相對分子質(zhì)量的不同而產(chǎn)生不同的生物活性，低分子透明質(zhì)酸具有高分子透明質(zhì) 酸沒有的某些生物活性，甚至兩者有完全相反的作用。低分子透明質(zhì)酸易吸收，在體內(nèi)可重 新合成高分子透明質(zhì)酸，增加內(nèi)源性透明質(zhì)酸的含量，可發(fā)揮保健和美容養(yǎng)顏的功效。目前 發(fā)酵法和從動物組織中提取的透明質(zhì)酸相對分子量一般都在100萬以上，目前降解透明質(zhì) 酸的方法主要包括物理法、化學(xué)法和酶法。生物大分子的酶法降解由于其專一性強、效率高、反應(yīng)條件溫和沒有副產(chǎn)物 等優(yōu)點，常被人們首選用于大分子的降解。但是由于透明質(zhì)酸酶的來源非常有限，價 格昂貴，在很大程度上限制了它們的應(yīng)用。很多革蘭陰性以及革蘭陽性細菌都產(chǎn)可降 解透明質(zhì)酸的酶。革蘭陰性菌產(chǎn)生的酶存在于周質(zhì)空間而不是釋放到胞外，不大可 能與發(fā)病機制有關(guān)，而且，這些酶類更像是軟骨素酶。產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的革蘭陽性菌有 Streptococcus, Staphylococcus,Clostridium,Propionibacterium,Peptostreptococcus 以 及 Streptomyces0 Clostridiumperfringens, Propionibacterium acens 及 P印tostreptococcus均為厭氧菌，對其研究不多。而關(guān)于鏈球菌透明質(zhì)酸酶的報道則很多， 且深入。其他的如Ti^ponema pallidum及T. pertenue產(chǎn)生表面締合的透明質(zhì)酸降解酶，但 好像是水解酶，還需進一步研究。巴西的Shimizu等發(fā)現(xiàn)Candida的一些菌也產(chǎn)透明質(zhì)酸 酶，但是沒有進一步研究，后來又報道Paracoccidioides brasiliensis也產(chǎn)透明質(zhì)酸酶。總體來說，目前產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的微生物比較多，但是進行深入研究很少，主要以鏈 球菌透明質(zhì)酸酶為主。且，透明質(zhì)酸酶來源有限，價格昂貴。目前急需一種易于培養(yǎng)，酶活 高，且安全高效的微生物菌種，以提供新的透明質(zhì)酸酶的來源。嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)，已由他人保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏日期為2000年1月16日，保藏號為CGMCC N01. 1933，標(biāo)準菌株，其用途主要為降解尼古丁，目前，并未發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)透明質(zhì)酸酶并將其 應(yīng)用于透明質(zhì)酸降解中的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans) CGMCCN01. 1933 (保藏日期為2000年1月16日)的一種新用途，即在透明 質(zhì)酸降解中的應(yīng)用，其在常溫條件下對透明質(zhì)酸具有高效的降解作用。具體應(yīng)用時，可以采用以下兩種方案
1、在透明質(zhì)酸發(fā)酵生產(chǎn)的后期，即發(fā)酵結(jié)束前3-12小時，向培養(yǎng)物中添加培養(yǎng)物 體積 0. 1 5% 的嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans) CGMCC N01. 1933，并混 合發(fā)酵，發(fā)酵3-12小時，即得分子量在500-200000Da之間的低分子透明質(zhì)酸。以降解透明 質(zhì)酸，嗜尼古丁節(jié)桿菌可以降低發(fā)酵液粘度，并降解透明質(zhì)酸，進而得到低分子透明質(zhì)酸， 降解得到的透明質(zhì)酸分子量在500-200000Da之間。2、在高分子透明質(zhì)酸溶液(分子量大于100萬Da)中添加嗜尼古丁節(jié)桿菌 (Arthrobacternicotinovorans)CGMCC N01. 1933，作用 2-24 小時后，即可以得到分子量在 500-200000Da之間的低分子透明質(zhì)酸。所述高分子透明質(zhì)酸溶液中高分子透明質(zhì)酸的質(zhì)量百分比為0. 1 5% ；添加嗜 尼古丁節(jié)桿菌的量優(yōu)選溶液體積的0. 1 5%。所述添加的嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacternicotinovorans) CGMCC N01. 1933 為 嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans) CGMCC N01. 1933 的發(fā)酵液，或嗜尼古丁 節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans) CGMCC N01. 1933 產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶。本發(fā)明的發(fā)明人通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)對透明質(zhì)酸具有高效降解作用(詳見實施實例2_5)，因此，可以用于降解 透明質(zhì)酸。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明實施實例1 菌種的鑒定本發(fā)明的發(fā)明人從透明質(zhì)酸腐敗液中分離得到一菌株，用下述方法對其進行鑒 定提取細菌染色體DNA，并PCR擴增菌株16S rDNA序列。擴增16S rDNA的正向引 物為 27F 5‘ -AGAGTTTGATC (C/A) TGGCTCAG-3‘(對應(yīng)于 E. coil 16S rDNA 序列的第 8-27 個 堿基位置)，反向引物 1492R :5，-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3‘(對應(yīng)于 E. coli 16S rDNA的第1492-1510個堿基位置)。100 μ L 的 PCR 反應(yīng)體系1 XPCR 緩沖液，1. 5mmol/L MgCl2,4X dNTP 混合物各 200ymol/L，引物各 0. 5ymol/L，Taq DNA 聚合酶 1 μ L (5U/μ L)，2 μ L DNA 原液。PCR 反 應(yīng)條件96°C預(yù)變性6min ；94°C變性lmin，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸2min，30個循環(huán)；最 后72°C溫育6min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，直接交由上海生工生物工程技術(shù)公司進 行純化和序列測定。運用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中已存在的細菌16S rDNA核酸序列進行 相似性比較分析。結(jié)果表明本菌株與嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans) (GenBank登錄號GQ284335. 1)序列相似性為99 %，可以判定該菌株為嗜尼古丁節(jié)桿菌 (Arthrobacternicotinovorans)CGMCC N01. 1933。實施實例2 嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)降解透明質(zhì)酸質(zhì)量百分比為的透明質(zhì)酸溶液(透明質(zhì)酸分子量為140萬Da)，接種體積 的嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)，30°C攪拌培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)結(jié)束后 檢測透明質(zhì)酸分子量為lOOODa。實施實例3 嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)降解透明質(zhì)酸
4
質(zhì)量百分比為3%的透明質(zhì)酸溶液(透明質(zhì)酸分子量為150萬Da)，接種2%體積 的嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)，30°C攪拌培養(yǎng)12小時，培養(yǎng)結(jié)束后 檢測透明質(zhì)酸分子量為60000Da。實施實例4 嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)降解透明質(zhì)酸使用鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸，在發(fā)酵結(jié)束前6小時，接種體積的嗜尼古丁節(jié) 桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)，培養(yǎng)結(jié)束后檢測透明質(zhì)酸分子量為100000Da。實施實例5 嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)降解透明質(zhì)酸使用鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸，在發(fā)酵結(jié)束前10小時，接種0. 5%體積的嗜尼古 丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)，培養(yǎng)結(jié)束后檢測透明質(zhì)酸分子量為60000Da。
權(quán)利要求
嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)CGMCC NO1.1933在透明質(zhì)酸降解中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于具體應(yīng)用方法如下在透明質(zhì)酸發(fā)酵生產(chǎn)的后期，即發(fā)酵結(jié)束前3-12小時，向培養(yǎng)物中添加培養(yǎng)物體積 0. 1 5% 的嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans) CGMCC N01. 1933，并混合發(fā) 酵，發(fā)酵3-12小時，即得分子量在500-200000Da之間的低分子透明質(zhì)酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于具體應(yīng)用方法如下 0JMSIiiy^ Φ i^iJPBf M^Tliff Ir (Arthrobacter nicotinovorans)CGMCCN01. 1933，作用2_24小時后，即可以得到分子量在500_200000Da之間的低分子透明 質(zhì)酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述高分子透明質(zhì)酸溶液中高分子透明 質(zhì)酸的質(zhì)量百分比濃度為0. 1 5% ；添加嗜尼古丁節(jié)桿菌的量為溶液體積的0. 1 5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4所述的應(yīng)用，其特征在于所述添加的嗜尼古丁節(jié)桿菌 (Arthrobacternicotinovorans)CGMCC N01. 1933 ^J Bf M " T ff (Arthrobacter nicotinovorans)CGMCCN01. 1933 的發(fā)酵液，或嗜尼古丁 節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)CGMCC N01. 1933 的透明質(zhì)酸酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了嗜尼古丁節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)CGMCC No1.1933(保藏日期為2000年1月16日)的一種新用途，即在透明質(zhì)酸降解中的應(yīng)用，其在常溫條件下對透明質(zhì)酸具有高效的降解作用。降解時，有兩種方式一、在透明質(zhì)酸發(fā)酵生產(chǎn)的后期，向培養(yǎng)物中添加嗜尼古丁節(jié)桿菌，并混合發(fā)酵，發(fā)酵3-12小時，即得低分子透明質(zhì)酸；二、在高分子透明質(zhì)酸溶液中添加嗜尼古丁節(jié)桿菌，作用2-24小時后，即可以得到低分子透明質(zhì)酸。
文檔編號C12P19/04GK101886099SQ20101019160
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者吉愛國, 宋淑亮 申請人:山東大學(xué)威海分校