專利名稱：一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯片及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及曼氏無針烏賊放流標(biāo)記，具體涉及一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯片及 檢測方法。
背景技術(shù)：
曼氏無針烏賊(S^iella maindroni, Rochebrune)俗稱烏賊、墨魚、墨斗魚、海貓 等，隸屬軟體動(dòng)物門、頭足綱、十腕目、烏賊科，由于烏賊噴墨的習(xí)性和耐干露能力差，長期 以來很難養(yǎng)活，少有人見到活的烏賊，用活體來研究烏賊的生物學(xué)及其育苗、養(yǎng)殖技術(shù)為世 界性難題。本發(fā)明人通過自然海區(qū)捕到37只活的曼氏無針烏賊，不但養(yǎng)活了烏賊，而且通 過一定措施，使其正常產(chǎn)卵，然后進(jìn)行人工育苗與養(yǎng)殖研究，獲得了突破性的進(jìn)展，人工育 出烏賊苗種7300余只，養(yǎng)出成品烏賊1008只，并通過馴化將烏賊攝食活餌的習(xí)性逐步改變 成攝食死餌，為人工養(yǎng)殖烏賊奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。放流標(biāo)記是研究水生生物資源重要方法之一，放流標(biāo)記主要有作標(biāo)記法和加標(biāo)法 兩類。作標(biāo)記法是在生物體的原有器官做上標(biāo)記，如全部或部分地切除魚鰭，此法簡便又 快，缺點(diǎn)是切除的器官在很多情況下會(huì)繼續(xù)再生。加標(biāo)法是把特別的標(biāo)志物附加在生物體 上，加標(biāo)法又分為體外標(biāo)志法和體內(nèi)標(biāo)志法兩種。體外標(biāo)志法最廣泛使用的是將標(biāo)志牌系 掛于魚體表面，體內(nèi)標(biāo)志法將標(biāo)志物(傳如導(dǎo)體)置于生物體內(nèi)的方法。上述方法應(yīng)用于 烏賊的放流標(biāo)記研究中都存在較大的困難，目前，烏賊的放流仍然是采用剪觸腕的簡單標(biāo) 記，該法只可鑒別針對(duì)標(biāo)記的烏賊個(gè)體，無法鑒別以該烏賊為親本的群體的標(biāo)記，且觸腕再 生就失去標(biāo)記的穩(wěn)定性，所以回捕后的數(shù)據(jù)分析存在較大的誤差，對(duì)烏賊損傷也較大。所以 迫切需要開發(fā)一種高靈敏度和低損傷的放流標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯片，該放流標(biāo)記 芯片可以鑒別以該烏賊為親本的群體，該標(biāo)記特異性和穩(wěn)定性好，對(duì)烏賊損傷極少，回捕后 的各群體的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析誤差率得到降低。本發(fā)明還提供了該芯片的檢測方法，為研究曼 氏無針烏賊放流群體及子代的相關(guān)性提供了方便，尤其為研究烏賊生長繁殖規(guī)委提供較準(zhǔn) 確的數(shù)據(jù)依據(jù)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯 片，包括經(jīng)化學(xué)修飾的固相基片，所述固相基片的表面固化有質(zhì)控探針點(diǎn)樣和檢測探針點(diǎn) 樣，所述質(zhì)控探針點(diǎn)樣包括固定化陽性探針點(diǎn)樣、雜交陽性探針點(diǎn)樣，陽性對(duì)照探針點(diǎn)樣、 陰性對(duì)照探針點(diǎn)樣和空白點(diǎn)樣液，所述檢測探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，所述固定化陽性探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示，該核苷酸 序列的5’修飾有被cy3激發(fā)的熒光素，所述雜交陽性探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示，所述陽性對(duì)照探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0. 5至SEQ IDN0.8所示，所 述陰性對(duì)照探針的核苷酸序列如Operon公司的序列號(hào)為H2NC000001至H2NC000012所示(公司網(wǎng)站:http //www, operon. com)。固定化陽性探針(Hex)為人工合成，此序列經(jīng)過我們blast比較，和已知的生物核酸沒有重大同源性。在芯片實(shí)驗(yàn)最后檢測雜交結(jié)果時(shí)，此序列應(yīng)該在cy3的激發(fā)波長下有 較強(qiáng)的熒光信號(hào)，在偽彩圖上顯示為綠色，表明芯片上的核酸固定是沒有問題。雜交陽性探針選用具有較高保守性的動(dòng)物線粒體16SrRNA序列人工設(shè)計(jì)合成。陽性對(duì)照探針為與實(shí)驗(yàn)樣品無關(guān)的核苷酸序列，用來檢測芯片系統(tǒng)的有效性，稱 為外參；本發(fā)明序列表SEQ ID NO. 5-N0. 8作為外參選取酵母人工合成的4個(gè)核苷酸序列， 經(jīng)過比較分析此4個(gè)序列與烏賊基因序列沒有同源性。將外參核苷酸序列克隆到帶有多聚 核苷酸尾(PolyA)的載體中通過體外轉(zhuǎn)錄的方法制備外參核酸序列對(duì)應(yīng)的PolyA-RNA。把 此PolyA-RNA按照不同比例摻入到實(shí)驗(yàn)樣品的RNA中去，一同進(jìn)行芯片反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。雜交后 外參序列就會(huì)有雜交信號(hào)，通過調(diào)節(jié)摻入的PolyA-RNA的量而得到外參的不同雜交信號(hào)。序列表的核苷酸序列排列是從5’------3’。所述固相基片每張具有4個(gè)矩陣，每個(gè)矩陣為22行、22列的點(diǎn)樣。每列第一排為陽性對(duì)照探針點(diǎn)樣，每列最后一、二排由陰性對(duì)照探針點(diǎn)樣、固定化 陽性探針點(diǎn)樣、雜交陽性探針點(diǎn)樣和空白點(diǎn)樣液組成，其它為檢測探針點(diǎn)樣，點(diǎn)樣的直徑為 150 μ m,點(diǎn)樣的間距為185 μ m。一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯片的檢測方法，包括下述步驟DRNA的提取用Trizol試劑(Invitrogen公司提供)提取曼氏無針烏賊組織或 細(xì)胞中的總RNA，用異丙醇沉淀濃縮RNA，分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢，RNA純化 柱純化得到純化樣品；2)cRNA合成取上述純化樣品lug，以T7_01igOd(T) (Takara公司提供)為引物， 用Reverse Transcription System試劑盒(Promega公司提供)合成雙鏈cDNA，合成完畢 用DNA純化柱純化，再用T7體外轉(zhuǎn)錄酶(Takara公司提供)將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合 成cRNA，轉(zhuǎn)錄合成后用RNA純化柱純化得到cRNA樣品；3)反轉(zhuǎn)錄DNA合成取上述cRNA樣品5ug，用反轉(zhuǎn)錄酶MLV (Takara公司提供)和 隨機(jī)引物(Takara公司提供)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后用DNA純化柱純化，得到反轉(zhuǎn)錄DNA ； 隨機(jī)引物為引物名稱。4)熒光標(biāo)記DNA合成以反轉(zhuǎn)錄DNA為模板，以隨機(jī)引物(Takara公司提供) 和克列諾片段(Fermentas公司提供)合成DNA互補(bǔ)鏈，合成過程中摻入帶有熒光基團(tuán)的 Cy3-dCTP和Cy5-dCTP，合成完畢純化并定量，得到熒光標(biāo)記DNA ；5)檢測樣品制備將熒光標(biāo)記DNA溶于80ul的雜交液(CapitalBio公司)中，于 42°C雜交過夜，雜交結(jié)束后，先在42°C預(yù)熱的洗液I中洗4min，再在42°C預(yù)熱的洗液II中 洗4min，然后在離心機(jī)甩干得到檢測樣品，所述洗液I為含有質(zhì)量百分濃度0.2%十二烷 基硫酸鈉(SDS)的2X鹽酸檸檬溶液(SSC原液濃度為20X，由CapitalBio公司提供，2X 或0.2 X為稀釋后的濃度)，所述洗液I為0.2 X鹽酸檸檬溶液；6)描儀檢測將檢測樣品點(diǎn)于所述放流標(biāo)記芯片上，用CapitalBio公司提供的雙 通道激光掃描儀進(jìn)行掃描檢測，采用Luxscan 3. O圖像分析軟件(CapitalBio公司提供) 對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，然后對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn) 行歸一化，確定檢測樣品屬于哪個(gè)放流群體。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供了一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯片及檢測方法，該芯片包括質(zhì)控探針和檢測探針，質(zhì)控探針包括人工合成的固定化陽性探針、雜 交陽性探針、陽性對(duì)照探針和陰性對(duì)照探針，檢測探針為兩條特異性好的Tai-2009-l或 Zhou-2009-l放流群體的核苷酸序列，該放流標(biāo)記芯片可以鑒別以這二個(gè)烏賊為親本的群 體，該放流標(biāo)記芯片特異性和穩(wěn)定性好，對(duì)烏賊損傷極少，回捕后各群體的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析誤 差率得到降低，為研究曼氏無針烏賊放流群體及子代的相關(guān)性提供了方便，尤其為研究烏 賊生長繁殖規(guī)委提供較準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)依據(jù)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1、建立放流群體高通量檢測體系運(yùn)用毛細(xì)管電泳SSR熒光標(biāo)記，在DNA快速提取、PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物檢測等方面 建立一套高通量的烏賊放流群體的EST-SSR標(biāo)記檢測體系，本發(fā)明人建立了曼氏無針烏賊 放流群體的cDNA指紋庫，如本發(fā)明的兩條Oligo DNA =SEQ ID NO. 1(編號(hào)Tai-2009_l)和 SEQ ID而.2(編號(hào)21!011-2009-1)所示，為篩選得到的烏賊群體的特異性指紋標(biāo)記。1. 1提取每個(gè)曼氏無針烏賊群體的DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序94°C預(yù)變性 5min，30個(gè)循環(huán)(94°C變性30s ；合適溫度退火30s ；72°C延伸45s)，72°C延伸IOmin01. 2將PCR產(chǎn)物稀釋30倍，在96孔板的各孔中加入9. 05 μ L去離子甲酰胺、 0. 05 μ LGS3730_500分子量內(nèi)標(biāo)和1 μ L稀釋后的PCR產(chǎn)物，95 °C變性5min，于4°C保溫 10min，3000rpm離心lmin，于ABI 3730XLDNA分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳；預(yù)電泳15KV， 2min ；2KV電壓進(jìn)樣IOs ；電泳15KV，20min。用Data Collection軟件收集原始數(shù)據(jù)。1. 3分別對(duì)每個(gè)樣品設(shè)置3次獨(dú)立的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明一致性很好。數(shù)據(jù)結(jié)果通 過統(tǒng)計(jì)軟件分析可以進(jìn)行聚類。本實(shí)驗(yàn)建立了毛細(xì)管電泳技術(shù)平臺(tái)，后續(xù)工作對(duì)每個(gè)放流 群體進(jìn)行取樣，獲得的樣品提取DNA后進(jìn)行SSR毛細(xì)管電泳檢測，所得數(shù)據(jù)建立放流群體指 紋數(shù)據(jù)庫。當(dāng)群體數(shù)達(dá)到一定水平后，可以從中篩選各群體的特異性指紋基因片段，設(shè)計(jì)成 為芯片探針本發(fā)明的兩條Oligo DNA :Tai-2009-l和Zhou-2009-l，進(jìn)行放流群體識(shí)別芯 片開發(fā)。微衛(wèi)星DNA又稱簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats, SSR)，SSR由1 6個(gè) 核苷酸，重復(fù)10 20次的首尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列。在同一物種的不同品種間存在大量 的多態(tài)性標(biāo)記，都具有一些特異性DNA片段的組合作為該品種的“指紋”，具有高度特異性 和穩(wěn)定性。目前該指紋技術(shù)僅限于在品種間檢測，通過引入毛細(xì)管電泳技術(shù)，運(yùn)用高通量的 SSR分析可以獲得更多的差異基因片段和遺傳信息，進(jìn)一步建立指紋圖，可以大大提高檢測 的精度和速度，從而能夠從群體甚至個(gè)體層面進(jìn)行鑒定。2、芯片制作在每個(gè)放流群體上設(shè)計(jì)Oligo DNA，每條Oligo DNA代表一個(gè)放流群體，將本發(fā) 明的兩條 Oligo DNA 用 SmartArray (Capital Bio Corp.，Beijing，China)點(diǎn)制在一張 75X25mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上，點(diǎn)制在芯片上的樣品還包括質(zhì)控探針點(diǎn)樣一條固定 化陽性探針，一條雜交陽性探針，四條陽性對(duì)照探針，十二條陰性對(duì)照探針，及空白點(diǎn)樣液，點(diǎn)樣液為常用基因芯片制作的點(diǎn)樣液，市售獲得。3、芯片檢測方法3. IRNA的提取用Trizol試劑(Invitrogen公司提供)提取采捕到的曼氏無針烏賊組織或細(xì)胞中的總RNA，用異丙醇沉淀濃縮RNA，分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢， RNA純化柱純化得到純化樣品。3. 2cRNA合成取上述純化樣品lug，以T7-01igod(T) (Takara公司提供)為引物， 用Reverse Transcription System試劑盒(Promega公司提供)合成雙鏈cDNA，合成完畢 用DNA純化柱純化，再用T7體外轉(zhuǎn)錄酶(Takara公司提供)將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合 成cRNA，轉(zhuǎn)錄合成后用RNA純化柱純化得到cRNA樣品。3. 3反轉(zhuǎn)錄DNA合成取上述cRNA樣品5ug，用反轉(zhuǎn)錄酶MLV(Takara公司提供) 和隨機(jī)引物(Takara公司提供)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后用DNA純化柱純化，得到反轉(zhuǎn)錄DNA。3. 4熒光標(biāo)記DNA合成以反轉(zhuǎn)錄DNA為模板，以隨機(jī)引物(Takara公司提供) 和克列諾片段(Fermentas公司提供)合成DNA互補(bǔ)鏈，合成過程中摻入帶有熒光基團(tuán)的 Cy3-dCTP和Cy5-dCTP，合成完畢純化并定量，得到熒光標(biāo)記DNA。3. 5檢測樣品制備將熒光標(biāo)記DNA溶于SOul的雜交液中，于42 °C雜交過夜， 雜交結(jié)束后，先在42°C預(yù)熱的洗液I中洗4min，再在42°C預(yù)熱的洗液II中洗4min，然后 在離心機(jī)甩干得到檢測樣品，洗液I為含有質(zhì)量百分濃度0. 2% SDS的2XSSC，洗液I為 0. 2XSSC03. 6描儀檢測將檢測樣品點(diǎn)于放流標(biāo)記芯片上，用CapitalBio公司提供的雙通 道激光掃描儀進(jìn)行掃描檢測，采用Luxscan 3. O圖像分析軟件(CapitalBio公司提供)對(duì) 芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，然后對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行 歸一化，確定檢測樣品是不是屬于上述Tai-2009-l或Zhou-2009-l放流群體。
權(quán)利要求
一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯片，包括經(jīng)化學(xué)修飾的固相基片，所述固相基片的表面固化有質(zhì)控探針點(diǎn)樣和檢測探針點(diǎn)樣，所述質(zhì)控探針點(diǎn)樣包括固定化陽性探針點(diǎn)樣、雜交陽性探針點(diǎn)樣，陽性對(duì)照探針點(diǎn)樣、陰性對(duì)照探針點(diǎn)樣和空白點(diǎn)樣液，其特征在于所述檢測探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述固定化陽性探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，該核苷酸序列的5’修飾有被cy3激發(fā)的熒光素，所述雜交陽性探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，所述陽性對(duì)照探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.8所示，所述陰性對(duì)照探針的核苷酸序列如Operon公司的序列號(hào)為H2NC000001至H2NC000012所示。
2.如權(quán)利要求1所述的一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯片，其特征在于所述固相基片每 張具有4個(gè)矩陣，每個(gè)矩陣為22行、22列的點(diǎn)樣。
3.如權(quán)利要求2所述的一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯片，其特征在于每列第一排為 陽性對(duì)照探針點(diǎn)樣，每列最后一、二排由陰性對(duì)照探針點(diǎn)樣、固定化陽性探針點(diǎn)樣、雜交陽 性探針點(diǎn)樣和空白點(diǎn)樣液組成，其它為檢測探針點(diǎn)樣，點(diǎn)樣的直徑為150 u m,點(diǎn)樣的間距為 185 u m。
4.權(quán)利要求1所述的一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯片的檢測方法，其特征在于包括下 述步驟1)RNA的提取用Trizol試劑提取曼氏無針烏賊組織或細(xì)胞中的總RNA，用異丙醇沉淀 濃縮RNA，分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢，RNA純化柱純化得到純化樣品；2)cRNA合成取上述純化樣品lug，以T7_01igod(T)為引物，用Reverse TranscriptionSystem試劑盒合成雙鏈cDNA，合成完畢用DNA純化柱純化，再用T7體外轉(zhuǎn) 錄酶將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA，轉(zhuǎn)錄合成后用RNA純化柱純化得到cRNA樣品；3)反轉(zhuǎn)錄DNA合成取上述cRNA樣品5ug，用反轉(zhuǎn)錄酶MLV和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反 轉(zhuǎn)錄后用DNA純化柱純化，得到反轉(zhuǎn)錄DNA ；4)熒光標(biāo)記DNA合成以反轉(zhuǎn)錄DNA為模板，以隨機(jī)引物和克列諾片段合成DNA互補(bǔ) 鏈，合成過程中摻入帶有熒光基團(tuán)的Cy3-dCTP和Cy5-dCTP，合成完畢純化并定量，得到熒 光標(biāo)記DNA ；5)檢測樣品制備將熒光標(biāo)記DNA溶于80ul的雜交液中，于42°C雜交過夜，雜交結(jié)束 后，先在42°C預(yù)熱的洗液I中洗4min，再在42°C預(yù)熱的洗液II中洗4min，然后在離心機(jī)甩 干得到檢測樣品，所述洗液I為含有質(zhì)量百分濃度0.2%十二烷基硫酸鈉的2X鹽酸檸檬 溶液，所述洗液I為0. 2X鹽酸檸檬溶液；6)描儀檢測將檢測樣品點(diǎn)于所述放流標(biāo)記芯片上，用雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描檢 測，采用Luxscan 3. 0圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，然 后對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化，確定檢測樣品屬于哪個(gè)放流群體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種曼氏無針烏賊放流標(biāo)記芯片及檢測方法，該芯片包括質(zhì)控探針和檢測探針，質(zhì)控探針包括人工合成的固定化陽性探針、雜交陽性探針、陽性對(duì)照探針和陰性對(duì)照探針，檢測探針為兩條特異性好的Tai-2009-1或Zhou-2009-1放流群體的核苷酸序列，該放流標(biāo)記芯片可以鑒別以這二個(gè)烏賊為親本的群體，該放流標(biāo)記芯片標(biāo)記特異性和穩(wěn)定性好，對(duì)烏賊損傷極少，回捕后各群體的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析誤差率得到降低，為研究曼氏無針烏賊放流群體及子代的相關(guān)性提供了方便，尤其為研究烏賊生長繁殖規(guī)委提供較準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101857901SQ201010196300
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者宋微微, 母昌考, 王春琳 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)