專利名稱：亞洲玉米螟的轉(zhuǎn)錄組及功能基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及亞洲玉米螟的轉(zhuǎn)錄組信息、功能基因表達(dá)量及其注釋信息，以及它們的獲得方法。
背景技術(shù)：
亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guen6e)是重要世界性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，主要危害玉米、高粱、向日葵等重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物，目前對(duì)亞洲玉米螟的防治，仍然是以化學(xué)防治為主，對(duì)生態(tài)環(huán)境及糧食 安全生產(chǎn)造成了巨大的損害，而利用傳統(tǒng)抗蟲(chóng)育種的方法雖然能很好地降低生態(tài)壓力，但是其育種周期長(zhǎng)和植物抗性單一，容易產(chǎn)生害蟲(chóng)抗性。利用分子育種抗蟲(chóng)的方法是目前較好的解決方案。而目前對(duì)玉米螟分子機(jī)制的研究較少，基因信息十分匱乏，使得玉米螟基因?qū)用娴难芯窟M(jìn)展緩慢。因?yàn)闆](méi)有該物種的全基因組序列，一直以來(lái)對(duì)于該物種的研究還處于傳統(tǒng)生物學(xué)的階段，而分子生物學(xué)層面的研究相對(duì)較少，主要是基于近源物種的相似基因進(jìn)行研究。對(duì)于缺乏基因組序列的物種，新基因的發(fā)現(xiàn)和功能研究一直是困擾生物學(xué)家研究的主要問(wèn)題，傳統(tǒng)的基因發(fā)掘的方法一般利用構(gòu)建文庫(kù)，SAGE技術(shù)，MPSS技術(shù)，或者基因組測(cè)序的方法獲得，然而這些方法一般均存在成本高，工作量大，獲得大量的雜質(zhì)序列，而且在無(wú)參考基因組的情況下很難剔除冗余序列，這些問(wèn)題嚴(yán)重影響了對(duì)動(dòng)植物基因組水平的研究。因此，需要找到合適的發(fā)掘亞洲玉米螟基因組基因的方法，以期了解盡可能多的亞洲玉米螟基因，為從分子生物學(xué)層面開(kāi)發(fā)防治亞洲玉米螟的技術(shù)提供有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得亞洲玉米螟的全長(zhǎng)基因信息，基因的表達(dá)量及功能基因的發(fā)現(xiàn)和研究方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種獲得亞洲玉米螟的轉(zhuǎn)錄組及功能基因的方法，包括(Bi)獲得亞洲玉米螟全基因組中的各種基因轉(zhuǎn)錄本；(B2)對(duì)(Bi)獲得的基因轉(zhuǎn)錄本分別進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而獲得亞洲玉米螟的基因信息(包括基因表達(dá)量信息、基因注釋信息及基因功能信息)及功能基因。在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(Bi)包括(al)提取亞洲玉米螟的總RNA，分離出3’端帶有polyA的mRNA，隨機(jī)打斷mRNA回收200-700bp片段，反轉(zhuǎn)錄并合成雙鏈cDNA ；(bl)對(duì)(al)獲得的序列進(jìn)行測(cè)序；(cl)將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接與組裝，獲得Unigene，并確定其方向。在另一優(yōu)選例中，步驟(B2)中，所述的生物信息學(xué)分析包括(但不限于)基因注釋，CDS預(yù)測(cè)，差異表達(dá)基因篩選及代謝通路分析。
在另一優(yōu)選例中，所述的基因注釋包括表達(dá)量注釋，功能注釋。在另一優(yōu)選例中，所述的差異表達(dá)基因篩選包括G0功能顯著性富集分析， Pathway顯著性富集分析。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1、RNA-seq的樣品處理及測(cè)序流程示意圖。圖2、RNA-seq數(shù)據(jù)分析流程示意圖。
具體實(shí)施例方式針對(duì)目前難以從無(wú)基因組參考序列的物種中獲得基因信息的技術(shù)難題，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次采用RNA-seq技術(shù)發(fā)掘到很多亞洲玉米螟不同發(fā)育時(shí)期的基因信息、基因功能和表達(dá)情況。RNA-seq 技術(shù)RNA-seq技術(shù)是指將一定時(shí)期一定條件下一個(gè)細(xì)胞中所有轉(zhuǎn)錄本(包括:mRNA、 smallRNA和非編碼RNA)測(cè)序并進(jìn)行相對(duì)定量。RNA-seq技術(shù)可以獲得特定細(xì)胞、組織一定狀態(tài)下的總RNA，能夠快速地檢測(cè)到幾乎所有轉(zhuǎn)錄本，這一技術(shù)為研究某一物種的基因組的表達(dá)情況提供了技術(shù)支持。RNA-seq被用來(lái)在轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)(UTR區(qū)域鑒定、intron/exon鑒定、可變剪切、 promoter區(qū)域鑒定等)、非編碼區(qū)功能(non-coding RNA、microRNA等)、基因轉(zhuǎn)錄水平和新轉(zhuǎn)錄區(qū)域的研究。RNA-seq通過(guò)mRNA測(cè)序得到約75bp的序列，通過(guò)組裝拼接得到基因的全長(zhǎng)序列。利用該方法可以快速、高通量獲取物種生長(zhǎng)期內(nèi)基因組所有的轉(zhuǎn)錄本序列信息及其表達(dá)豐度，然后通過(guò)生物信息學(xué)軟件將其序列與現(xiàn)有近源物種數(shù)據(jù)庫(kù)(如歐洲玉米螟、家蠶以及果蠅)來(lái)進(jìn)行比較，得到基因的注釋信息，并進(jìn)行分類(lèi)和Pattway分析。對(duì)于比對(duì)不到的序列，可以進(jìn)行CDS掃描，然后對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。所述的RNA-seq主要包含以下步驟樣品總RNA的提取(包括對(duì)總RNA提取進(jìn)行純化，DNA酶處理，得到純度、質(zhì)量均能符合要求的樣品，須達(dá)到Agilent2100檢測(cè)要求) ’文庫(kù)制備及測(cè)序；mRNA的分離及RNA-seq的測(cè)序(較佳地利用第二代測(cè)序技術(shù))；數(shù)據(jù)分析， 剔除雜質(zhì)數(shù)據(jù)，對(duì)RNA-seq組裝后的結(jié)果進(jìn)行整合；生物信息學(xué)分析(Blast分析、GO注釋、 KEGG注釋，預(yù)測(cè)基因功能)。作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，采用所述的RNA-seq技術(shù)測(cè)定亞洲玉米螟生長(zhǎng)期內(nèi)基因組所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息及表達(dá)豐度信息，并且基于這些信息對(duì)亞洲玉米螟基因組轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了功能注釋和pattway分析，并且高通量地對(duì)基因表達(dá)量，表達(dá)差異等進(jìn)行分析。 通過(guò)RNA-seq的方法與傳統(tǒng)的基因功能研究相比，無(wú)論從得到數(shù)據(jù)的周期、數(shù)據(jù)的數(shù)量、質(zhì)量都得到顯著的優(yōu)化，同時(shí)節(jié)約了大量的工作量和試驗(yàn)成本。將所述的RNA-seq的方法運(yùn)用于亞洲玉米螟研究中，首先通過(guò)RNA-seq技術(shù)獲得了亞洲玉米螟全發(fā)育期的cDNA序列的信息，共得到了 97407個(gè)序列信息；46986條 Unigene ；包含RNA-seq名稱、序列長(zhǎng)度及表達(dá)數(shù)、COG預(yù)測(cè)、COG功能注釋、KEGG注釋、KEGG-pathway, GO注釋的共46884條信息；以及包括對(duì)獲得的序列信息進(jìn)行CDS核酸序列預(yù)測(cè)的蛋白功能注釋共16443條信息。采用所述的RNA-seq的方法，優(yōu)點(diǎn)如下(1)高通量獲得待測(cè)物種(如亞洲玉米螟)基因組所有轉(zhuǎn)錄本序列信息；(2)快速獲得待測(cè)物種(如亞洲玉米螟)基因表達(dá)豐度信息及表達(dá)差異；(3)快速大量獲得待測(cè)物種(如亞洲玉米螟)基因組轉(zhuǎn)錄本的注釋信息；(4)可對(duì)待測(cè)物種(如亞洲玉米螟)未知功能基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和功能分析。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、RNA-seq分析樣品處理及測(cè)序流程見(jiàn)圖1。具體方法如下1.亞洲玉米螟Total RNA的提取采用常規(guī)的Trizol法提取，純化，DNA酶處理，獲得濃度彡300ng/ul、總量彡6ug、 0D260/280 為 1. 8 2. 2 的 Total RNA 樣品(須達(dá)到 Agilent 2100 檢測(cè)要求)。2. mRNA的分離及隨機(jī)打斷用帶有oligo-dT的磁珠分離出帶有polyA的mRNA，然后利用超聲波隨機(jī)打斷，回收200-700bp的片段。3. cDNA第一鏈和第二鏈的合成cDNA第一鏈的合成是用隨機(jī)6聚物和hvitrogen的Superscript II reversetranscriptase 試劑盒進(jìn)行。cDNA 第二鏈?zhǔn)怯?RNase H(Invitrogen)和 DNA 聚合酶 I (New England BioLabs)完成。4.在cDNA片段上錨定上由Illumina/Solexa測(cè)序試劑盒中提供的接頭序列5' RNA Adapter(SEQ ID NO 1)5 ‘ P-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG ；3' RNA Adapter(SEQ ID NO :2)5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ；5. PCR 擴(kuò)增用上述接頭序列中的引物進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。6.文庫(kù)構(gòu)建及檢測(cè)利用上述步驟中得到的序列，按照Illumina公司sample prep kit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建及檢測(cè)。7. RNA-seq 的測(cè)序?qū)⒔ê玫奈膸?kù)以5_7pM的濃度加到Illumina測(cè)序儀(Genome Analyzer II)的相應(yīng)通道上，按照制造商提供的方法運(yùn)行36個(gè)循環(huán)。8.數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單流程見(jiàn)圖2。剔除雜質(zhì)數(shù)據(jù)，對(duì)RNA-seq組裝后的結(jié)果進(jìn)行整合。之前的步驟得到的是原始數(shù)據(jù)，其中含有步驟4中加入的接頭序列，將其去除后稱為Clean reads，就可以進(jìn)行拼接與組裝。具體方法是利用將得到的Cleanreads，利用組裝軟件SOAPdenovo， 按照Li等2010年發(fā)表在Genome Res.上第20卷第沈5_272頁(yè)上的方法進(jìn)行。SOAPdenovo 首先將具有一定長(zhǎng)度overlap的reads連成更長(zhǎng)的片段，這些通過(guò)reads overlap關(guān)系得到的不含N的組裝片段本發(fā)明人稱之為Contig。然后，將reads比對(duì)回Contig，通過(guò) paired-end reads能確定來(lái)自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig以及這些Contig之間的距離， SOAPdenovo將這些Contig連在一起，中間未知序列用N表示，這樣就得到kaffold。進(jìn)一步利用paired-end reads對(duì)kaffold做補(bǔ)洞處理，最后得到含N最少，兩端不能再延長(zhǎng)的序列,稱之為Unigene。9.生物信息學(xué)分析將上述得到的Unigene序列與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)nr、Swiss_Prot、KEGG和COG做blastx 比對(duì)(evalue < 0. 00001)，取比對(duì)結(jié)果最好的蛋白確定Unigene的序列方向。如果不同庫(kù)之間的比對(duì)結(jié)果有矛盾，則按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的優(yōu)先級(jí)確定Unigene的序列方向，跟以上四個(gè)庫(kù)皆比不上的Unigene，用軟件ESI^can(Iseli，Jongeneel等1999，Menlo Park ed. (AAAI Press),pp. 138-148.)預(yù)測(cè)其編碼區(qū)并確定序列的方向。對(duì)于能確定序列方向的Unigene，給出其從5 ’到3 ’方向的序列；對(duì)于無(wú)法確定序列方向的Unigene，給出組裝軟件得到的序列。實(shí)施例2、RNA-seq分析結(jié)果通過(guò)RNA-seq技術(shù)獲得了亞洲玉米螟全發(fā)育期的cDNA序列的信息，共得到了 97407個(gè)序列信息；46986條Unigene ；包含RNA-seq名稱、序列長(zhǎng)度及表達(dá)數(shù)、COG預(yù)測(cè)、COG 功能注釋、KEGG注釋、KEGG-pattiWay、G0注釋的共46884條信息；以及包括對(duì)獲得的序列信息進(jìn)行CDS核酸序列預(yù)測(cè)的蛋白功能注釋共16443條信息。部分序列列舉如下表1.亞洲玉米螟的部分Unigenes的表達(dá)量、功能注釋及其代謝通路分析
權(quán)利要求
1.一種獲得亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guenee)的轉(zhuǎn)錄組及功能基因的方法， 包括(Bi)獲得亞洲玉米螟全基因組中的各種基因轉(zhuǎn)錄本；(B2)對(duì)(Bi)獲得的基因轉(zhuǎn)錄本分別進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而獲得亞洲玉米螟的基因信息及功能基因。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(Bi)包括(al)提取亞洲玉米螟的總RNA，分離出3’端帶有polyA的mRNA，隨機(jī)打斷mRNA回收 200-700bp片段，反轉(zhuǎn)錄并合成雙鏈cDNA ； (bl)對(duì)(al)獲得的序列進(jìn)行測(cè)序；(cl)將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接與組裝，獲得Unigene，并確定其方向。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(B2)中，所述的生物信息學(xué)分析包括 基因注釋，CDS預(yù)測(cè)，差異表達(dá)基因篩選及代謝通路分析。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的基因注釋包括表達(dá)量注釋，功能注釋。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的差異表達(dá)基因篩選包括G0功能顯著性富集分析，Pathway顯著性富集分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及亞洲玉米螟的轉(zhuǎn)錄組及功能基因及其獲得方法。本發(fā)明所述的方法方便、快捷、準(zhǔn)確且成本低廉?？色@得全面的、準(zhǔn)確的亞洲玉米螟的全基因組轉(zhuǎn)錄本信息、功能基因表達(dá)量及其代謝通路信息。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102277416SQ20101019734
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者張 浩, 李海超, 王玉冰, 苗雪霞, 黃勇平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院