專利名稱：檢測耐藥結(jié)核分支桿菌(mdr-tb)的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種一種微生物檢測醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，特別是涉及一種耐多藥結(jié)核 分枝桿菌感染的檢測方法，以及利用所述方法同時(shí)檢測多種與結(jié)核耐藥相關(guān)基因突變的試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)核病仍然是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，尤其是在發(fā)展中國家。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)世界人口 的1/3有結(jié)核分支桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染，是全世界感染性疾病中 的第二大殺手。并且近年來結(jié)核分支桿菌的耐藥性呈現(xiàn)顯著的增長趨勢。全球約有4. 3% 的新發(fā)病例和治療后的患者發(fā)生多重耐藥，部分高發(fā)地區(qū)的多重耐藥率高達(dá)10%以上。我 國是結(jié)核病疫情較重的國家之一，在全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中位居第二。中國、印度 和俄羅斯三個(gè)國家的結(jié)核耐藥患者總數(shù)約占全球的62%。近期中國傳染病監(jiān)測結(jié)果顯示， 結(jié)核病患者數(shù)一直居各種傳染病的首位，全國約有5. 5億人感染結(jié)核病菌，約450萬人患結(jié) 核病，200萬人為開放性結(jié)核病，每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)高達(dá)13萬?；仡櫺哉{(diào)查結(jié)果表 明，中國MTB的總耐藥率為27.8%，耐多藥率為10.7%。這已成為全球性的公共問題，并引 起了社會(huì)的普遍重視。然而結(jié)核病的快速診斷和最佳個(gè)體化治療方案的建立仍然是結(jié)核控制中的重要 挑戰(zhàn)之一。由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，如今廣泛應(yīng)用的耐藥測定方法均是建立在菌株的 基礎(chǔ)上，雖然使用了新的液體培養(yǎng)基，但仍然耗時(shí)較長，推遲了獲得菌株敏感型的時(shí)間。因 此，開發(fā)一種快速準(zhǔn)確診斷耐多藥結(jié)核病的檢測方法，對于早期發(fā)現(xiàn)、阻斷耐藥結(jié)核病的傳 播，規(guī)范指導(dǎo)用藥，提高耐藥結(jié)核病的治愈率具有非常重要的意義。近年來報(bào)道了許多檢 測結(jié)核耐藥突變的分子生物學(xué)方法，然而這些方法往往需要大量的人力和長勢良好的培養(yǎng) 基。最近，已經(jīng)成功建立了一些real-time PCR快速檢測結(jié)核分支桿菌臨床分離株耐藥突 變的方法。但是這些方法往往只可同時(shí)檢測很少幾種與結(jié)核耐藥相關(guān)的突變基因型，臨床 上及可能出現(xiàn)漏檢。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)發(fā)明至今已近20 年了，在這期間技術(shù)得到了不斷的發(fā)展，近年來出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重 復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。目前 real-time PCR (也稱Q-PCR)所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是DNA結(jié)合染色，水 解探針(TaqMan探針)，分子信標(biāo)(molecular beacon)，熒光標(biāo)記引物，雜交探針。它們又 可分為擴(kuò)增序列特異和非特異的檢測兩大類。擴(kuò)增序列非特異性檢測方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子，如SYBR GreenI等熒 光染料。Real-time PCR發(fā)展早期就是運(yùn)用這種最簡單的方法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過 量SYBR Green I熒光染料，SYBR Green I熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信 號。熒光染料的優(yōu)勢在于它能監(jiān)測任何dsDNA序列的擴(kuò)增，不需要探針的設(shè)計(jì)，使檢測方法變得簡便，同時(shí)也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它 也能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽性信號。擴(kuò)增序列特異性檢測方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷 酸探針來檢測產(chǎn)物，它又可分為直接法和間接法。間接的方法就是利用水解探針的策略。目 前在real-time PCR中最廣泛使用的TaqMan系統(tǒng)就是運(yùn)用了這個(gè)原理。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入 一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào) 告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，因此探針完整時(shí)，檢測不到該探針5’端熒光基團(tuán)發(fā)出的 熒光。但在PCR擴(kuò)增中，熔液中的模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在 引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，Taq酶的5’_3’外切酶活性(此活性是雙鏈 特異性的，游離的單鏈探針不受影響)將探針5’端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來，游 離于反應(yīng)體系中，從而脫離3’端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，而發(fā)出熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。直接法指的是標(biāo)記熒光的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光，分子信標(biāo) (molecular beacon)就屬于這一類。它本質(zhì)上是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探 針，當(dāng)探針分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，標(biāo)記在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效 應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當(dāng)互補(bǔ)序列出現(xiàn)時(shí)，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個(gè)開放的結(jié)構(gòu)，呈線 性，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，報(bào)告基團(tuán)脫離了淬滅基 團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測到的熒光。熒光標(biāo)記引物是從分子信標(biāo)的概念衍生的一種聯(lián) 合分子探針系統(tǒng)，它把熒光基團(tuán)標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列直接與PCR引物相結(jié)合，從而使熒 光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中。目前主要有兩種日出引物(sunrise primes)和蝎 子引物(scorpion primes)。雜交探針(hybridization probe)使用兩個(gè)特異的探針，其 中上游的探針的3’端標(biāo)記有供體熒光素(donor)，而下游的探針的5’端標(biāo)記有受體熒光 素(acceptor)。在PCR中模板退火階段，兩探針同時(shí)與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，并形成頭尾結(jié)合的 形式，使供體和受體熒光素距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET，此作用與上 述水解探針的方式相反)，使得受體熒光基團(tuán)發(fā)出熒光；當(dāng)兩探針處于游離狀態(tài)時(shí)，無熒光 產(chǎn)生。由于反應(yīng)中運(yùn)用了兩個(gè)探針，因此增加了方法的特異性，但同時(shí)也大大提高了檢測成 本。另外也可利用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針熔解曲線(melting curve)對與寡核苷酸探針 結(jié)合的序列進(jìn)行分析，從中獲取有用的信息。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種耐多藥結(jié)核分枝桿菌感染的檢測方法，以及利用所述方 法同時(shí)檢測多種與結(jié)核耐藥相關(guān)基因突變的試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案首先，本發(fā)明涉及到一種檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的方法，包括在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增基因組區(qū)域，其中，所述基因組區(qū)域中的突變引起了結(jié)核 分枝桿菌的耐藥。擴(kuò)增反應(yīng)中的擴(kuò)增體系包括至少一條標(biāo)記的寡核苷酸探針，至少一對擴(kuò) 增引物(正向引物和反向引物)和一個(gè)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。標(biāo)記的寡核苷酸探針與擴(kuò)增的基因組區(qū)域雜交形成的熔解曲線分析中產(chǎn)生一個(gè)熔解譜。
所述寡核苷酸探針是雙標(biāo)記探針，它包括一個(gè)報(bào)告標(biāo)記和一個(gè)猝滅標(biāo)記。當(dāng)雙標(biāo)記寡核苷酸探針處于未與擴(kuò)增的基因組區(qū)域雜交的單鏈構(gòu)象時(shí)，猝滅標(biāo)記 能夠猝滅報(bào)告標(biāo)記所發(fā)出的熒光；當(dāng)雙標(biāo)記寡核苷酸探針與擴(kuò)增的基因組區(qū)域雜交時(shí)，形 成雙鏈結(jié)構(gòu)，報(bào)告標(biāo)記的熒光不能夠被猝滅，此時(shí)，報(bào)告標(biāo)記的熒光強(qiáng)度要遠(yuǎn)高于此雙標(biāo)記 寡核苷酸探針未與擴(kuò)增的基因組區(qū)域雜交而處于單鏈狀態(tài)時(shí)的熒光強(qiáng)度。所述擴(kuò)增是不對稱擴(kuò)增，擴(kuò)增中引物的濃度是不平衡的，即擴(kuò)增中一條引物的濃 度高于另外一條與之配對引物的濃度。優(yōu)選所述DNA聚合酶是不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。所述基因組區(qū)域選自以下的基因的一種或多種，其中包括與耐利福(RIF)平相關(guān) 的RpoB基因，與耐異煙胼(INH)相關(guān)的KatG基因、mabA(fabGl)_inhA啟動(dòng)子和oxyR-ahpC 基因間區(qū)域，與耐乙胺丁醇(EMB)相關(guān)的embB基因，與耐吡嗪酰胺(PZA)相關(guān)的pncA基因， 與耐鏈霉素(STR)相關(guān)的rpsL和rr s基因，與耐左氧氟沙星相關(guān)的gyrA基因；所述基因組 區(qū)域中的突變包括，rpoB 基因的 511、513、515、516、518、519、522、526、531 和 533 位點(diǎn)，embB 基因的306位點(diǎn)，katG基因的315位點(diǎn)，inhA基因的-15和-8位點(diǎn)，ahpC基因-6、-9、-10 和-12位點(diǎn)等18個(gè)或更多突變位點(diǎn)。猝滅標(biāo)記可以是非熒光猝滅基團(tuán)，它標(biāo)記在寡核苷酸探針的3’末端，所述報(bào)告標(biāo) 記可以是熒光染料標(biāo)記，它可以標(biāo)記在寡核苷酸探針內(nèi)部的核苷酸殘基上。所述報(bào)告標(biāo)記還可以標(biāo)記在寡核苷酸探針的5’末端。在標(biāo)記寡核苷酸的熔解曲線分析中，產(chǎn)生熔解譜的步驟還包括當(dāng)探針與靶核酸序 列分離時(shí)，確定擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度變化負(fù)一次導(dǎo)數(shù)(-df/dT)最大值的步驟。靶核酸序列與探針的雜交區(qū)域至少要包含一個(gè)與結(jié)核耐藥相關(guān)的突變。其中，探 針與野生型序列匹配，或者探針與突變型序列匹配。所述擴(kuò)增是多重檢測反應(yīng)，反應(yīng)中至少存在兩條與不同基因組區(qū)域雜交的探針。所述至少兩條探針的每條可以都與野生型序列匹配，也可以每條都與突變型序列 匹配，還可以其中一條與野生型序列匹配，另外一條與突變型序列匹配。所述的兩條探針可以包含可以在單一信號檢測通道內(nèi)檢測的相同或相似的染料 標(biāo)記，或者也可以包含在不同信號檢測通道內(nèi)檢測的不同顏料標(biāo)記。本發(fā)明還可以設(shè)計(jì)成， 一個(gè)PCR反應(yīng)檢測所有的堿基突變，具有不同染料標(biāo)記的探針可以放在一個(gè)PCR反應(yīng)中，采 用多重PCR，不同染料標(biāo)記的探針可以在不同檢測通道內(nèi)同時(shí)檢測。其中探針可以包含不與擴(kuò)增序列互補(bǔ)的核苷酸，此探針與包含9bp回文結(jié)構(gòu)序列 的RpoB基因的81bp核心區(qū)域雜交，上述探針中所包含的不與擴(kuò)增序列互補(bǔ)的核苷酸阻止 了探針自身發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。此方法還包括以野生型樣本為對照，對臨床樣本所產(chǎn)生熔解譜的分析。熔解譜中 峰的位置如果與野生型相比出現(xiàn)至少0. 2°C的改變，這就標(biāo)志著樣本中突變的存在。此方法可以在一個(gè)反應(yīng)管中擴(kuò)增兩個(gè)或者更多的基因組區(qū)域。所述引物選自本說明書序列表中的SEQ ID NO 1 SEQ ID NO :16。所述探針選自本說明書序列表中的SEQ ID NO 17 SEQ ID NO :36。其次，本發(fā)明還涉及一種檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的探針其中，一條探針由25 50個(gè)核苷酸組成，在雜交的條件下，它能夠與結(jié)核分枝桿菌RpoB基因81bp的核心區(qū)域雜交。上述探針包括一個(gè)標(biāo)記在3’末端的猝滅標(biāo)記和一個(gè)標(biāo) 記在內(nèi)部核苷酸殘基上或5’末端的報(bào)告標(biāo)記。所述探針雜交在包含RpoB基因526、531和 533密碼子的區(qū)域，探針含有與擴(kuò)增序列不互補(bǔ)的核苷酸；所述探針與包含9bp回文結(jié)構(gòu)序 列的RpoB基因的81bp核心區(qū)域雜交，上述探針中所包含的不與擴(kuò)增序列互補(bǔ)的核苷酸阻 止了探針自身發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。所述探針選自序列表中的SEQ ID N0:17, SEQ ID NO :18， SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27。再次，本發(fā)明還提供一個(gè)從樣本中檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，包括至少一對擴(kuò)增引物和至少一條標(biāo)記的寡核苷酸探針。此寡核苷酸探針包括一個(gè)報(bào) 告標(biāo)記和一個(gè)猝滅標(biāo)記。當(dāng)標(biāo)記的寡核苷酸探針處于未與靶序列雜交的單鏈構(gòu)象時(shí)，猝滅 標(biāo)記能夠猝滅報(bào)告標(biāo)記所發(fā)出的熒光；當(dāng)寡核苷酸探針與靶序列雜交時(shí)，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，報(bào)告標(biāo)記的熒光不能夠被猝滅， 此時(shí)，報(bào)告標(biāo)記的熒光強(qiáng)度要遠(yuǎn)高于此寡核苷酸探針未與靶序列雜交而處于單鏈狀態(tài)時(shí)的 熒光強(qiáng)度；其中，猝滅標(biāo)記是非熒光猝滅基團(tuán)，它標(biāo)記在探針的3’末端。其中，報(bào)告標(biāo)記是熒光基團(tuán)，它標(biāo)記在在寡核苷酸探針的內(nèi)部核苷酸殘基上或標(biāo) 記在探針的5’末端。還包括熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶核酸及序列擴(kuò)增所需其它 常用各組分。其中，所述引物選自序列表中的SEQ ID NO 1 SEQ ID NO :16。其中，所述探針選自序列表中的SEQ ID NO 17 SEQ ID NO :36。“寡核苷酸”是指天然的或經(jīng)過修飾的單體或聚合物的線性寡聚物，它包括脫氧核 苷、核糖核苷、蛋白核酸核苷和通過堿基配對的相互作用與目標(biāo)多核苷酸特異結(jié)合的能力?！盁晒饣鶊F(tuán)”是指在一個(gè)確定的激發(fā)波長下吸收光能，在另一個(gè)確定的不同波 長下發(fā)射光能的部分。例如熒光標(biāo)記包括，也不僅限于此AleXa Fluor dyes(Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 633，Alexa Fluor 660 和 Alexa Fluor 680)，AMCA， AMCA-S, B0DIPY 染料(B0DIPY FL, B0DIPY R6G, B0DIPY TMR, B0DIPY TR, B0DIPY 530/550， B0DIPY 558/568， B0DIPY 564/570, B0DIPY 576/589， B0DIPY 581/591， B0DIPY 630/650, B0DIPY 650/665), Carboxyrhodamine 6G, carboxy-X-rhodamine (R0X), Cascade Blue, CascadeYellow, Cyanine 染 料(Cy3, Cy5, Cy3.5, Cy5.5), Dansyl, Dapoxyl, Dialkylaminocoumarin,4' ,5' -Dichloro-2' ,7' -dimethoxy-fluorescein, DM-NERF, Eosin, Erythrosin, Fluorescein, FAM, Hydroxycoumarin, IRDyes(IRD40, IRD 700, IRD 800),JOE,Lissamine rhodamine B,Marina Blue,Methoxycoumarin,Naphthofluorescein, Oregon Green 488,Oregon Green 500, Oregon Green 514,Pacific Blue, PyMPO,Pyrene, Rhodamine 6G, RhodamineGreen, Rhodamine Red, Rhodol Green,2' ,4' ,5' ,7' _Te tra-bromosulfone-fluorescein, Tetramethyl-rhodamine(TMR)， Carboxytetramethyl rhodamine(TAMRA), Texas Red and Texas Red-X。所述“猝滅基團(tuán)”與熒光標(biāo)記之間距離足夠近時(shí)，能夠吸收或消散激發(fā)的熒光標(biāo) 記的能量。一個(gè)猝滅基團(tuán)可以是熒光的猝滅基團(tuán)，也可以是非熒光的猝滅基團(tuán)。上面所列的熒光基團(tuán)如果與另外一個(gè)熒光基團(tuán)鄰近，也可以扮演一個(gè)猝滅基團(tuán)的角色，此時(shí)發(fā)生 FRET猝滅或者接觸猝滅。最好選擇不發(fā)出任何可見光的非熒光猝滅基團(tuán)。非熒光猝滅標(biāo) 記包括如下，也不僅限于此DABCYL(4-(4' -dimethylaminophenylazo)benzoic acid) succinimidyl ester, diarylrhodamine carboxylic acid, succinimidyl ester(QSY-7) 禾口 4 ' , 5 ' -dinitrofluorescein carboxylic acid, succinimidyl ester (QSY-33), quencherl，或"Black hole quenchers，，(BHQ-1，BHQ_2 禾口 BHQ-3)，Iowa BlackFQ，De印 Dark Quencher, Eclipse Dark Quencher核苷酸類似物，核苷酸G殘基，納米粒子和金微粒。例如，一個(gè)寡核苷酸探針5’末端標(biāo)記FAM，3’末端標(biāo)記BHQl，當(dāng)探針與靶核酸序列雜交時(shí)，F(xiàn)AM的熒光強(qiáng)度至少超過探針單鏈狀態(tài)時(shí)FAM熒光強(qiáng)度1. 5倍。例如，一個(gè)寡核苷酸探針5’末端標(biāo)記Texas Red，3’末端標(biāo)記BHQ2，當(dāng)探針與靶核 酸序列雜交時(shí)，Texas Red的熒光強(qiáng)度至少超過探針單鏈狀態(tài)時(shí)TexasRed熒光強(qiáng)度3倍。例如，一個(gè)寡核苷酸探針內(nèi)部核苷酸上標(biāo)記FAM，3’末端標(biāo)記BHQl，當(dāng)探針與靶核 酸序列雜交時(shí)，F(xiàn)AM的熒光強(qiáng)度至少超過探針單鏈狀態(tài)時(shí)FAM熒光強(qiáng)度1倍。在標(biāo)記寡核苷酸的熔解曲線分析中，產(chǎn)生熔解譜的步驟還包括，當(dāng)探針與靶核酸 序列分離時(shí)，確定擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度變化負(fù)一次導(dǎo)數(shù)(-df/dT)最大值的步驟?！叭劢庾V”是指寡(或多)核苷酸與其互補(bǔ)序列測量值的采集，它所表示的是寡(或 多)核苷酸由雙鏈成為單鏈的分子轉(zhuǎn)變(或者相反過程)。核酸由雙鏈成為單鏈的轉(zhuǎn)變在 學(xué)術(shù)術(shù)語中通常描述為核酸分子的“熔解”，這種轉(zhuǎn)變也可以描述成為核酸的“變性”或“解 離”。因此，本發(fā)明中的熔解譜也可以稱為“解離譜”、“變性譜”、“熔解曲線”、“解離曲線”、 “雜交/解離譜”等等。靶核酸序列與探針雜交區(qū)域至少要包含一個(gè)突變核苷酸、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、 缺失或插入，或包含兩個(gè)甚至更多的突變核苷酸、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、缺失或插入。探針 與靶核酸序列雜交區(qū)域可以包含兩個(gè)或更多的耐藥突變核苷酸。所述標(biāo)記的寡核苷酸探針與熱穩(wěn)定的DNA聚合酶配合使用，優(yōu)選使用的是不具有 5，核酸酶活性的DNA聚合酶。在已完成靶核酸序列擴(kuò)增后核酸序列的檢測和分析中，也可以使用本發(fā)明中的探 針；或者也可以用在目標(biāo)擴(kuò)增的獨(dú)立終點(diǎn)檢測試驗(yàn)中。雙標(biāo)記的寡核苷酸探針通常雜交在 擴(kuò)增靶序列所用弓丨物對之間的位置。在每個(gè)循環(huán)都實(shí)時(shí)檢測熒光信號的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，可以在擴(kuò)增期間進(jìn)行分析。當(dāng)然， 也可以通過擴(kuò)增結(jié)束后的熔解曲線分析，來研究靶核酸序列。探針可以是熒光標(biāo)記的，也可 以是非熒光標(biāo)記的，例如生物素。利福平和異煙胼是結(jié)核病治療方案中關(guān)鍵的一線藥物，也是最容易出現(xiàn)耐藥性的 抗結(jié)核藥物。研究表明，97%利福平耐藥株是由于rpoB基因突變所致，突變主要集中在一 段高度保守的81bp區(qū)域。異煙胼耐藥性主要與編碼過氧化氫酶_過氧化物酶的katG基 因、編碼還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性烯酰基載體蛋白還原酶的inhA基因和編碼 烷基過氧化氫酶的ahpC基因突變相關(guān)。embB306位點(diǎn)突變是一個(gè)高特異性的與結(jié)核耐多 藥相關(guān)的遺傳標(biāo)記。另外還有其它一些基因的突變也與結(jié)核耐藥相關(guān)，但其臨床檢出頻率 較低。臨床診斷需要一種簡單、快速、重復(fù)性好的方法，能夠同時(shí)對一系列的與結(jié)核耐藥相 關(guān)的基因突變進(jìn)行檢測。Real-time PCR技術(shù)結(jié)合PCR的靈敏性和DNA雜交的特異性等優(yōu)點(diǎn)，具有操作簡單、結(jié)果判斷直觀以及無污染等特點(diǎn)，在臨床診斷中已被廣泛用于多種微生 物病原體DNA的檢測。本發(fā)明特別涉及一種利用單重或多重不對稱PCR及熒光雜交探針技術(shù)，在一個(gè)PCR反應(yīng)管中快速、平行地同時(shí)檢測多個(gè)與結(jié)核耐藥相關(guān)基因突變的診斷方法，以及利用所 述方法同時(shí)檢測多個(gè)與結(jié)核耐藥相關(guān)基因突變的試劑盒。一般的PCR僅采用一對相同濃度的引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)雙鏈的核酸片段。 本發(fā)明則采用單重或多重不對稱PCR法(Multiplex Asymmetric PCR)，在同一個(gè)PCR反應(yīng) 體系中加入一對或兩對以上的引物，每對引物的上游引物和下游引物濃度不同，各對引物 針對各自特異的靶序列進(jìn)行擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中，還包括至少一條雙標(biāo)記的寡核苷酸 探針和一個(gè)熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。在PCR反應(yīng)的最初10 15個(gè) 循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引 物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA。通過分析比較特異的熒光標(biāo)記寡 核苷酸探針同與其互補(bǔ)單鏈PCR產(chǎn)物(野生型)以及存在突變的單鏈PCR產(chǎn)物(突變型) 結(jié)合所產(chǎn)生熔解曲線Tm值的變化，來檢測樣本DNA是否存在與結(jié)核耐藥相關(guān)的基因突變。本發(fā)明的方法步驟包括設(shè)計(jì)一對或兩對以上結(jié)核耐藥相關(guān)基因的特異性引物，并確保產(chǎn)生的靶序列擴(kuò)增 產(chǎn)物中含有待檢測的全部突變位點(diǎn)。設(shè)計(jì)一條或兩條以上的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。靶核酸序列與探針雜交區(qū)域至少 要包含一個(gè)突變核苷酸，或包含兩個(gè)甚至更多的突變核苷酸。并確保探針與野生型或突變 性靶核酸序列的突變位點(diǎn)互補(bǔ)，在突變位點(diǎn)以外的序列可以是完全互補(bǔ)，也可含有不互補(bǔ) 堿基，比如缺失，插入或不配對。通常探針的長度不超過35個(gè)核苷酸。當(dāng)探針的長度小于 25個(gè)核苷酸時(shí)，探針的5’末端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’末端標(biāo)記非熒光猝滅基團(tuán)。當(dāng)探針 長度大于25個(gè)核苷酸時(shí)，最好將熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記于探針內(nèi)部的核苷酸殘基上，非熒光猝 滅基團(tuán)標(biāo)記于探針的3’末端。報(bào)告標(biāo)記和猝滅標(biāo)記之間可以間隔小于20個(gè)核苷酸，或者 小于18個(gè)核苷酸，或者小于15個(gè)核苷酸，或者小于14個(gè)核苷酸，但是最好要大于8個(gè)核苷 酸。用于標(biāo)記探針的熒光報(bào)告基團(tuán)可以是FAM、ΤΕΤ、JOE、ViC、HEX、ROX、TAMPA、CY3、CY3. 5、 CY5、CY5. 5、OregonGreenTM, CALRedTM, Red640、Texas Red 中的一種或兩種以上，也不僅限 于此。用于標(biāo)記探針的非熒光猝滅基團(tuán)可以是DABCYL(4-(4' -dimethylaminophenylazo) benzoic acid)succinimidyl ester, diarylrhodamine carboxylic acid, succinimidyl ester (QSY-7)禾口 4 ' , 5 ' -dinitrof luorescein carboxylic acid, succinimidyl ester (QSY-33)，quencherl,或"Black hole quenchers，，(BHQ-1，BHQ-2 禾口 BHQ-3)，Iowa BlackFQ, Deep Dark Quencher, Eclipse Dark Quencher 核苷酸類似物，核苷酸 G 殘基，納 米粒子和金微粒，也不僅限于此。PCR反應(yīng)體系中，需要加入一種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，最好是不具有5’核酸酶活 性的DNA聚合酶，以便探針在反應(yīng)全過程中能夠保持完整。熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活 性的DNA聚合酶優(yōu)選是經(jīng)過修飾的、不具有5’核酸酶活性的Taq聚合酶，在反應(yīng)過程中，探 針不會(huì)被經(jīng)過修飾的Taq聚合酶所水解。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，采用經(jīng)過修飾的、不具有5’核酸酶 活性的Taq聚合酶會(huì)得到比采用具有5’核酸酶活性的Taq聚合酶更好的結(jié)果。另外，所加 各引物對的上游引物和下游引物濃度不同。擴(kuò)增同探針互補(bǔ)鏈的引物濃度要高于與之配對的另一條引物濃度，一對PCR引物的比例為不超過1 2，或者不超過1 3，或者不超過 1 4，或者不超過1 5，最佳的PCR引物比例取決于具體的實(shí)驗(yàn)，二者的濃度比例通常為 3 50 1。
由于探針不會(huì)被水解，也就不會(huì)被限制，所以可以設(shè)計(jì)成所希望的長度。在本發(fā)明 中，可以使用一個(gè)具有高Tm值的長探針。設(shè)計(jì)探針的Tm值可以比延伸溫度還高，例如72°C 或者更高。在反應(yīng)中，采用具有鏈置換活性的聚合酶效果會(huì)更好。PCR反應(yīng)開始后，在最初10 15個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限 制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大 量的單鏈DNA。在溶液中，雙標(biāo)記寡核苷酸探針處于未與靶序列雜交的單鏈構(gòu)象時(shí)通常呈 “線團(tuán)”狀，此時(shí)由于報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)距離很近，猝滅基團(tuán)能夠猝滅報(bào)告基團(tuán)所發(fā)出的 熒光。當(dāng)探針與單鏈PCR產(chǎn)物退火形成雙鏈時(shí)，由于報(bào)告基團(tuán)的熒光不能夠被猝滅，從而產(chǎn) 生可以檢測到的熒光信號，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線(Melting curve)檢測。在熔解曲線分析中，當(dāng)基 因發(fā)生突變時(shí)，特異的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針與其不能完全互補(bǔ)，探針同突變型單鏈PCR 產(chǎn)物所產(chǎn)生熔解曲線的Tm值要低于探針同與之完全互補(bǔ)野生型單鏈PCR產(chǎn)物所產(chǎn)生熔解 曲線的Tm值?；蛘咴谌劢馇€分析中，當(dāng)基因發(fā)生突變時(shí)，特異的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針 與其互補(bǔ)，探針同突變型單鏈PCR產(chǎn)物所產(chǎn)生熔解曲線的Tm值要高于探針同與之不完全互 補(bǔ)野生型單鏈PCR產(chǎn)物所產(chǎn)生熔解曲線的Tm值。通過野生型和突變型PCR產(chǎn)物熔解曲線 Tm值的不同，即可以檢測樣本DNA是否存在與結(jié)核耐藥相關(guān)的基因突變。在檢測耐藥突變之前，還包括檢測是否存在結(jié)核分枝桿菌的步驟。此檢測是否存 在結(jié)核分枝桿菌的步驟包括擴(kuò)增16SRNA基因，并用探針檢測。本發(fā)明中試劑盒的制備過程在下述步驟中詳細(xì)描述。本發(fā)明在以下實(shí)施例中作 了進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的范圍并不受實(shí)施例的限制。特別是盡管實(shí)施例中制備的試劑盒 只帶有擴(kuò)增5種結(jié)核耐藥相關(guān)基因的引物和檢測包括rpoB基因的511、513、515、516、518、 519、522，526、531和533位點(diǎn)，embB基因的306位點(diǎn)，ka tG基因的315位點(diǎn)，inhA基因 的-15和-8位點(diǎn)，ahpC基因-6、-9、-10和-12位點(diǎn)等18個(gè)突變位點(diǎn)的雙標(biāo)記寡核苷酸 探針，但并不能理解為本發(fā)明就局限于這5種結(jié)核耐藥相關(guān)基因的18個(gè)突變位點(diǎn)的檢測。 凡是利用本發(fā)明中的方法對結(jié)核耐藥相關(guān)基因突變的檢測和試劑盒，均屬于本發(fā)明保護(hù)范 圍。本發(fā)明的有益技術(shù)效果本發(fā)明能夠在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測出多個(gè)與結(jié)核耐 藥相關(guān)的基因突變位點(diǎn)，可大大節(jié)省時(shí)間，降低成本，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息， 更貼近臨床檢驗(yàn)需求。


圖1是單重結(jié)核分枝桿菌RpoB基因野生型和突變型熔解曲線分析圖。圖2是單重結(jié)核分枝桿菌RpoB基因野生型和突變型熔解曲線分析報(bào)告。圖3是多重結(jié)核分枝桿菌ahpC&embB基因野生型和突變型熔解曲線分析圖。圖4是多重結(jié)核分枝桿菌ahpC&embB基因野生型和突變型熔解曲線分析報(bào)告。圖5是多重結(jié)核分枝桿菌KatG&inhA基因野生型和突變型熔解曲線分析圖。
圖6是多重結(jié)核分枝桿菌KatG&inhA基因野生型和突變型熔解曲線分析報(bào)告。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 利福平和異煙胼是結(jié)核病治療方案中關(guān)鍵的一線藥物，也是最容易出現(xiàn)耐藥性的 抗結(jié)核藥物。研究表明，97%利福平耐藥株是由于rpoB基因(511、513、515、516、518、519、 522,526,531和533位點(diǎn))突變所致，突變主要集中在一段高度保守的Slbp區(qū)域。異煙胼 耐藥性主要與編碼過氧化氫酶-過氧化物酶的katG基因(315位點(diǎn))、編碼還原型煙酰胺腺 嘌呤二核苷酸依賴性烯?；d體蛋白還原酶的inhA基因(-8，-15位點(diǎn))和編碼烷基過氧 化氫酶的ahpC基因(-6、-9、-10和-12位點(diǎn))突變相關(guān)。embB306位點(diǎn)突變是一個(gè)高特異 性的與結(jié)核耐多藥相關(guān)的遺傳標(biāo)記。根據(jù)上述5種與結(jié)核耐藥相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)引物和探 針，并確保產(chǎn)生的靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物中含有待檢測的全部突變位點(diǎn)；靶核酸序列擴(kuò)增產(chǎn)物與 探針的雜交區(qū)域至少要包含一個(gè)待檢的突變核苷酸。正向引物可以是序列表中的SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 9對應(yīng)的與結(jié)核耐藥相關(guān)5種基因的引物及其組合，反向引物可以是序 列表中SEQ ID NO. 10 SEQ ID NO. 16對應(yīng)的與結(jié)核耐藥相關(guān)5種基因的引物及其組合， 探針可以是序列表中SEQ ID N0. 17 SEQ ID N0. 36對應(yīng)的序列及其組合引物和探針均委托專業(yè)公司進(jìn)行合成，其中引物為PAGE純化，探針為HPLC純化。 除RpoB探針1的FAM熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在第16位堿基dT上，RpoB探針2的FAM熒光報(bào) 告基團(tuán)標(biāo)記在第17位堿基dT上，RpoB探針3的FAM熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在第14位堿基dT 上，RpoB探針4的FAM熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在第24位堿基dT和ahpc3探針3的FAM熒光報(bào) 告基團(tuán)標(biāo)記在第12位堿基dT上外，其余各探針均為5’末端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)。所有 探針的3’末端均標(biāo)記BHQl猝滅基團(tuán)。RpoB探針2與靶序列的結(jié)合區(qū)域含有一個(gè)9個(gè)堿 基對的倒轉(zhuǎn)重復(fù)順序，為了防止回文結(jié)構(gòu)的形成，RpoB探針2引入了不配對堿基，分別在11 位和22位堿基位置。RpoB探針3，RpoB探針4，inhA探針3也引入了不配對堿基以減小Tm 值。RpoB探針4，inhA探針4，inhA探針5，和Ahpc探針4也引入了不配對堿基，或相當(dāng)于 野生型順序有堿基缺失，引入缺失一方面可以擴(kuò)大覆蓋區(qū)域，另一方面縮短探針長度。以上探針可以用FAM標(biāo)記，也可以用HEX，或TexasRed標(biāo)記，或者一組探針用 FAM標(biāo)記，比如RpoB探針，另一組探針用Hex標(biāo)記，比如embB和ahpc探針，另一組探針用 TexasRed標(biāo)記，比如inhA和KatG探針。不同標(biāo)記的探針可以放在一個(gè)PCR反應(yīng)中，從而達(dá) 到一個(gè)PCR反應(yīng)檢測所有基因突變的目的。實(shí)施例2 樣本DNA的提取取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為結(jié)核分枝桿菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，再用商品化 的基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行樣本DNA的提取。將獲得的基因組DNA直接用于結(jié)核耐藥檢 測或-20°C儲(chǔ)存，待用。實(shí)施例3 樣本DNA的提取取痰液2ml，加入2. 5倍體積4% Na0H，37°C溫育30min。將液化后的痰液，離心， 去上清，所得沉淀用于樣本DNA的提取。用商品化的基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行樣本DNA 的提取。將獲得的基因組DNA直接用于結(jié)核耐藥檢測或_20°C儲(chǔ)存，待用。
實(shí)施例4 陽性對照品的選擇將來自于中國藥品生物制品檢定所的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株過夜搖菌，高溫滅活。 滅活后的菌液用商品化的基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。將獲得的DNA定量后，用 TE Buffer稀釋至IOng/μ 1，作為野生型的陽性對照品。實(shí)施例5 =PCR反應(yīng)組成按下表(表1 表3)配制PCR反應(yīng)液并加入TB DNA模板(每次實(shí)驗(yàn)必須包括陰 性對照和野生型陽性對照)。配制完成后旋渦振蕩混勻，離心后上機(jī)。表IPCR體系各成分組成(master MixI) 表2PCR體系各成分組成(master MixII) 表3PCR體系各成分組成(master MixIII) 實(shí)施例6 反應(yīng)程序設(shè)定設(shè)置收集FAM熒光信號的熒光檢測通道，將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀開始
擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下(以Rotor Gene Q為例)表4PCR程序設(shè)定 實(shí)施例7:結(jié)果判定當(dāng)熒光定量PCR儀運(yùn)行結(jié)束后，用其配套軟件對本次試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行熔解曲線分析。以陽性對照品反應(yīng)管(野生型)為參照，其熔解曲線與陽性對照品管峰型完全相同的 樣本為野生型菌株；其熔解曲線與陽性對照品管峰型有差異的為突變型菌株。當(dāng)菌株發(fā)生 突變后，其熔解曲線的Tm值與野生型菌株相比會(huì)有所降低或提高。實(shí)施例8 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)(表5)表5質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果(以Rotor Gene Q為例)
權(quán)利要求
一種檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的方法，包括在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增基因組區(qū)域，其中，所述基因組區(qū)域中的突變引起了結(jié)核分枝桿菌的耐藥；所述擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增體系包括至少一條標(biāo)記的寡核苷酸探針，至少一對擴(kuò)增引物和一個(gè)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶；標(biāo)記的寡核苷酸探針與擴(kuò)增的基因組區(qū)域雜交形成的熔解曲線分析中產(chǎn)生一個(gè)熔解譜；所述標(biāo)記的寡核苷酸探針與靶核苷酸序列雜交區(qū)域至少要包含一個(gè)突變核苷酸、或包含兩個(gè)甚至更多的突變核苷酸，且所述標(biāo)記的寡核苷酸探針與野生型或突變型靶核苷酸序列的突變位點(diǎn)互補(bǔ)；所述寡核苷酸探針是雙標(biāo)記探針，包括一個(gè)報(bào)告標(biāo)記和一個(gè)猝滅標(biāo)記；所述猝滅標(biāo)記是非熒光猝滅基團(tuán)，它標(biāo)記在寡核苷酸探針的3’末端；所述報(bào)告標(biāo)記是熒光基團(tuán)，它可以標(biāo)記在寡核苷酸探針內(nèi)部的核苷酸殘基上或5’末端；當(dāng)雙標(biāo)記寡核苷酸探針處于未與擴(kuò)增的基因組區(qū)域雜交的單鏈構(gòu)象時(shí)，猝滅標(biāo)記能夠猝滅報(bào)告標(biāo)記所發(fā)出的熒光；當(dāng)雙標(biāo)記寡核苷酸探針與擴(kuò)增的基因組區(qū)域雜交時(shí)，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，報(bào)告標(biāo)記的熒光不能夠被猝滅，此時(shí)，報(bào)告標(biāo)記的熒光強(qiáng)度要遠(yuǎn)高于此雙標(biāo)記寡核苷酸探針未與擴(kuò)增的基因組區(qū)域雜交而處于單鏈狀態(tài)時(shí)的熒光強(qiáng)度；所述擴(kuò)增是不對稱擴(kuò)增，擴(kuò)增中一條引物的濃度高于另外一條與之配對引物的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，所述基因組區(qū)域選自以下的基因的一種或多種其 中包括與耐利福(RIF)平相關(guān)的RpoB基因，與耐異煙胼(INH)相關(guān)的KatG基因、 mabA(fabGl)-inhA啟動(dòng)子和oxyR-ahpC基因間區(qū)域，與耐乙胺丁醇(EMB)相關(guān)的embB基 因，與耐吡嗪酰胺(PZA)相關(guān)的pncA基因，與耐鏈霉素(STR)相關(guān)的rpsL和rrs基因，與 耐左氧氟沙星相關(guān)的gyrA基因；所述基因組區(qū)域中的突變包括，rpoB基因的511、513、515、516、518、519、522、526、531 和533位點(diǎn)，embB基因的306位點(diǎn)，katG基因的315位點(diǎn)，inhA基因的-15和-8位點(diǎn)，ahpC 基因-6、-9、-10和-12位點(diǎn)等18個(gè)突變位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，在標(biāo)記寡核苷酸的熔解曲線分析中，產(chǎn)生熔解譜的步驟 還包括當(dāng)探針與靶核酸序列分離時(shí)，確定擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度變化負(fù)一次導(dǎo)數(shù)(-df/dT)最 大值的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，所述DNA聚合酶是不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，所述擴(kuò)增是多重檢測反應(yīng)，反應(yīng)中至少存在兩條與不同 基因組區(qū)域雜交的探針；所述的至少兩條探針的每條可以都與野生型序列匹配，也可以每 條都與突變型序列匹配，還可以其中一條與野生型序列匹配，另外一條與突變型序列匹配； 所述兩條探針可以包含在單一信號檢測通道內(nèi)檢測的相同或相似的染料標(biāo)記，或者也可以 包含在不同信號檢測通道內(nèi)檢測的不同顏料標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中一條探針包含不與擴(kuò)增序列互補(bǔ)的核苷酸，此探針 與包含9bp回文結(jié)構(gòu)序列的RpoB基因的81bp核心區(qū)域雜交，上述探針中所包含的不與擴(kuò) 增序列互補(bǔ)的核苷酸阻止了探針自身發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，所述引物選自序列表中的SEQID N0:1 SEQID NO :16，所述探針選自序列表中的SEQ ID N0:17 SEQ ID NO :36。
8. —種檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的探針，其特征在于此探針由25 50個(gè)核苷酸組成， 在雜交的條件下，它能夠與結(jié)核分枝桿菌RpoB基因81bp的核心區(qū)域雜交；上述探針包括一 個(gè)標(biāo)記在3’末端的猝滅標(biāo)記和一個(gè)標(biāo)記在內(nèi)部核苷酸殘基上或5’末端的報(bào)告標(biāo)記；所述 探針雜交在包含RpoB基因526、531和533密碼子的區(qū)域，探針含有與擴(kuò)增序列不互補(bǔ)的核 苷酸；所述探針與包含9bp回文結(jié)構(gòu)序列的RpoB基因的81bp核心區(qū)域雜交；上述探針中所 包含的不與擴(kuò)增序列互補(bǔ)的核苷酸阻止了探針自身發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。9.根據(jù)權(quán)利要求8中 的探針，所述探針選自本說明書序列表中的SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO :26， SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :31。
9.
10. 一個(gè)從樣本中檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括至少一對擴(kuò)增 引物和至少一條標(biāo)記的寡核苷酸探針，此寡核苷酸探針包括一個(gè)報(bào)告標(biāo)記和一個(gè)猝滅標(biāo) 記；當(dāng)標(biāo)記的寡核苷酸探針處于未與靶序列雜交的單鏈構(gòu)象時(shí)，猝滅標(biāo)記能夠猝滅報(bào)告標(biāo) 記所發(fā)出的熒光；當(dāng)寡核苷酸探針與靶序列雜交時(shí)，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，報(bào)告標(biāo)記的熒光不能夠被猝滅，此 時(shí)，報(bào)告標(biāo)記的熒光強(qiáng)度要遠(yuǎn)高于此寡核苷酸探針未與靶序列雜交而處于單鏈狀態(tài)時(shí)的熒 光強(qiáng)度；其中所述猝滅標(biāo)記是非熒光猝滅基團(tuán)，且標(biāo)記在探針的3’末端； 其中所述報(bào)告標(biāo)記是熒光基團(tuán)，且標(biāo)記在在寡核苷酸探針的內(nèi)部核苷酸殘基上或標(biāo)記 在探針的5’末端；還包括熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶及核酸序列擴(kuò)增所需其它常用 各組分；其中所述引物選自序列表中的SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 16 ； 其中所述探針選自序列表中的SEQ ID N0:17 SEQ ID NO :36。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于診斷耐多藥結(jié)核分枝桿菌感染的雙標(biāo)記探針檢測和熔解曲線分析的方法，以及利用所述方法同時(shí)檢測多種與結(jié)核耐藥相關(guān)基因突變的試劑盒，屬于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中的試劑盒包括針對多種與結(jié)核耐多藥相關(guān)基因設(shè)計(jì)的引物和能夠檢測多個(gè)常見的與結(jié)核耐多藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針，以及一種熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶，在合適的PCR反應(yīng)條件下，可以同時(shí)檢測至少16個(gè)常見的與結(jié)核耐多藥相關(guān)基因的突變位點(diǎn)。本發(fā)明中的檢測方法和試劑盒可以用于耐多藥結(jié)核病的早期診斷，克服了現(xiàn)有技術(shù)耗時(shí)長，需要大量人力物力，成本高等問題。
文檔編號C12N15/11GK101845503SQ20101019777
公開日2010年9月29日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者姜麗麗, 富國良, 羅濤, 高謙 申請人:無錫銳奇基因生物科技有限公司