專利名稱：基于PCR技術(shù)的100bpDNAladder制備用模板p111及其制備體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)屬于分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域中電泳耗材DNAmarkeH脫氧核 糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn))的制備方法的革新。具體地說，本發(fā)明以一種專有的PCR模板設(shè)計(jì)，建 立了一種全新的基于PCR技術(shù)的制備IOObp DNA ladder的新模式。
背景技術(shù)：
DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)是指一組分子量已知的DNA分子的混合物，電泳后按照其分子量 的大小和遷移率的不同，在凝膠上形成一個(gè)由DNA片段大小決定的分布梯度，用以指示電 泳過程實(shí)驗(yàn)DNA樣品的分子量。目前，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)多是購自生物公司；同時(shí)由于其應(yīng)用 的普遍性和必要性，為了節(jié)約開支，很多實(shí)驗(yàn)室都自己制備常用的分子量標(biāo)準(zhǔn)。按照DNA分 子量標(biāo)準(zhǔn)制備所涉及的關(guān)鍵技術(shù)(過程)，其制備方法可以分為限制性內(nèi)切酶酶切和PCR擴(kuò) 增兩種方法；其中限制性內(nèi)切酶酶切的DNA分子的來源又可以分為天然的基因組DNA和人 工構(gòu)建的質(zhì)粒載體；PCR擴(kuò)增又可分為單片段的擴(kuò)增和多片段的擴(kuò)增。1.通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)利用DNA分子中存在的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(天然的或人為加入的)，采用合 適的內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行消化，從而形成一組分子量各異的DNA片段，用來作為DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)。按照被消化DNA的來源可以分為兩種天然來源的特種DNA(如基因組)和人工構(gòu)建的 質(zhì)粒DNA。天然來源的基因組DNA的限制性內(nèi)切酶酶切是通過分離某種來源的基因組DNA 分子，然后用一種或幾種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，從而產(chǎn)生一系列的DNA片段組合，目前最 常見的此類DNA分子是Lamda噬菌體的基因組DNAU DNA)，由其產(chǎn)生的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)有 XDNA/Hindlll，λ DNA/EcoRI+HindIII等，也可以是某種具有多個(gè)常見酶切位點(diǎn)質(zhì)粒，如 pBR322DNA/AluI marker和pBR322DNA/BsuRI (HaeIII)marker,但是所用的內(nèi)切酶都是不常 用的，因而成本較高。人工構(gòu)建載體(質(zhì)粒)的限制性內(nèi)切酶酶切是通過一次性把所需要 的各種DNA片段克隆到高拷貝數(shù)的載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，通過發(fā)酵培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA的分離 純化，經(jīng)過適當(dāng)?shù)拿盖屑纯梢垣@得大量的目標(biāo)DNA片段。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于通過大腸桿 菌的發(fā)酵擴(kuò)增質(zhì)粒獲得目的DNA片段，其制備規(guī)模很容易放大，獲得的DNA片段片段在凝膠 上片段銳利，過程重復(fù)性好。但這種制備方法也存在明顯的缺點(diǎn)構(gòu)建含有多DNA片段的重 組載體技術(shù)要求較高，技術(shù)水平直接決定了所構(gòu)建載體產(chǎn)生的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量。同 時(shí)這種載體酶切的制備方式也不適用于DNA小片段的制備，目前DNA小片段主要是通過PCR 擴(kuò)增的方式進(jìn)行制備。2.通過PCR擴(kuò)增制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)由于PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)強(qiáng)大的DNA片段的擴(kuò)增能力，同時(shí)由 于目前Taq DNA聚合酶工程菌株的廣為流傳，目前利用PCR方法生產(chǎn)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)不存 在技術(shù)問題，成本主要是引物合成和購買dNTP的成本，其他PCR試劑如Taq DNA聚合酶，模 板DNA，反應(yīng)Buffer等均可自制。由于生產(chǎn)效率低，勞動(dòng)強(qiáng)度高，因而限制了其大規(guī)模的制備和應(yīng)用。由于上述的PCR技術(shù)制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的缺陷，很多人都嘗試采用新的PCR設(shè) 計(jì)以提高PCR技術(shù)制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的效率，但是技術(shù)水平改觀不大。長(zhǎng)期以來，分子生物學(xué)試劑與基因工程研究領(lǐng)域缺少作為PCR模板用的復(fù)合重組 載體設(shè)計(jì)方案和一種用于IOObp DNA ladder中片段擴(kuò)增的專用載體，以及與之相應(yīng)的制備 體系。利用本發(fā)明中的載體可以復(fù)合體的方式制備DNA小片段，然后通過PCR產(chǎn)物的酶切 得到所需的目標(biāo)DNA小片段；以克服普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)生DNA片段生產(chǎn)效率低，勞動(dòng)強(qiáng)度高等 缺陷；從而能夠快速、大規(guī)模的地生產(chǎn)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp ladder。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，我們?cè)O(shè)計(jì)和構(gòu)建了用作PCR擴(kuò)增模板的重組載體plll，并建立了相應(yīng)的 IOObp DNA ladder的制備體系，恰恰滿足了上述需求，其目的在于提供了一種IOObp DNA ladder類型DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)小片段PCR擴(kuò)增的重組載體pill。本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供一種利用上述重組載體通過PCR擴(kuò)增和酶切相結(jié) 合的方法制備IOObp DNA ladder中所需的DNA分子的制備體系。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的重組載體pill是一種專門用于IOObpDNA ladder制備用的PCR重組載體；其圖譜中含有3個(gè)IOObp的重組DNA片段，每個(gè)IOObp片 段兩端均有兩個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E100E100E100E。本發(fā)明中IOObp DNA ladder的PCR擴(kuò)增用重組載體pill的構(gòu)建方法，包括如下 步驟分別以擬南芥基因組的DNA為模板，利用PCR的方法擴(kuò)增獲得了如下片段100E、 E100E、E100bp，其中IOObpE的3，末端、ElOObp的5，末端，E100E的兩個(gè)末端帶有EcoRI限 制向內(nèi)切酶的位點(diǎn)，三種DNA片段經(jīng)EcoRI酶切后，以一種順序連接的方式進(jìn)行連接，然后 以末端引物(DNA片段100E的正向引物+DNA片段ElOO的反向引物)對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增， 篩選獲得連接產(chǎn)物100-100-100bp。同時(shí)為其末端添加TA克隆中所需要的突出端A(腺嘌 呤核苷酸)；將上述連接產(chǎn)物TA克隆到克隆載體pGFM-T easy中，即得到所需的模板pill。其IOObp DNA ladder 制備體系為以重組載體pi 11為模板，在其核心序列(100-100-100bp)兩側(cè)選擇合適位點(diǎn)作為 引物序列，擴(kuò)增可以獲得如下類型的PCR產(chǎn)物復(fù)合體100/200/300/400/500-丨100-100-100丨-100/200/300/400/500，共 25 種復(fù)合體。經(jīng)
EcoRI酶切后，上述的復(fù)合體可被分解為各種IOObp DNA ladder中所需的DNA片段(100、 200、300、400、500bp)。本發(fā)明的有益效果在于設(shè)計(jì)了一種PCR擴(kuò)增重組載體plll，其中含有3條由4 個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)分隔的IOObp重組片段；以此重組載體為PCR擴(kuò)增模板能夠以復(fù)合體的 形式高效制備IOObp ladder中的DNA片段(通過EcoRI酶切)。與傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增方法 相比具有消耗少(如dNTP、DNA聚合酶、引物、反應(yīng)緩沖液、耗材等)、效率高(多片段的同 時(shí)擴(kuò)增)、省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)；其優(yōu)勢(shì)還在于通過引物位點(diǎn)的選擇可以靈活的調(diào)整所制備的 DNA片段的種類及其之間的數(shù)量關(guān)系。


圖1是生產(chǎn)IOObp DNA ladder用的重組載體pill圖譜。具體實(shí)施實(shí)例參照附圖，本發(fā)明提供的重組載體pill是一種專門用于IOObp DNAladder制備用 的PCR擴(kuò)增模板；其圖譜中含有3個(gè)IOObp的重組DNA片段，每個(gè)IOObp片段兩端均有兩個(gè) EcoRI酶切位點(diǎn)，三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E100E100E100E。其IOObp DNA ladder 制備體系為以重組載體pi 11為模板，在其核心序列(100-100-100bp)兩側(cè)選擇合適位點(diǎn)作為 引物序列，擴(kuò)增可以獲得如下類型的PCR產(chǎn)物復(fù)合體100/200/300/400/500- |l00-100-100|. -100/200/300/400/500，共 25 種復(fù)合體；經(jīng)EcoRI酶切后，上述的復(fù)合體可被分解為各種IOObp DNA ladder中所需的DNA 片段(100、200、300、400、500bp)。
權(quán)利要求
基于PCR技術(shù)的100bp DNA ladder重組載體p111，其特征在于其圖譜中含有3個(gè)100bp的重組DNA片段，每個(gè)100bp片段兩端均有兩個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E100E100E100E。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于PCR技術(shù)的IOObpDNA ladder重組載體pill的 制備體系為特征在于以重組載體Pl 11為模板，在其核心序列(100-100-100bp) 兩側(cè)選擇合適位點(diǎn)作為引物序列，擴(kuò)增可以獲得如下類型的PCR產(chǎn)物復(fù)合體 100/200/300/400/500-「100-100-1001 -100/200/300/400/500，共 25 種復(fù)合體；經(jīng)EcoRI酶切后，上述的復(fù)合體可被分解為各種IOObp DNA ladder中所需的DNA片段 (100、200、300、400、500bp)。
全文摘要
基于PCR技術(shù)的100bp DNA ladder重組載體p111，圖譜中含有3個(gè)100bp的重組DNA片段，每個(gè)100bp片段兩端均有兩個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E100E100E100E。制備體系為以重組載體p111為模板，在其核心序列(100-100-100bp)兩側(cè)選擇合適位點(diǎn)作為引物序列，擴(kuò)增可以獲得如下類型的PCR產(chǎn)物復(fù)合體100/200/300/400/500--100/200/300/400/500，共25種復(fù)合體；經(jīng)EcoRI酶切后，上述的復(fù)合體可被分解為各種100bp DNA ladder中所需的DNA片段。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101921746SQ20101019779
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者葉春和, 葉春江, 谷勁松 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)