專利名稱：表達(dá)抗生素基因簇的載體宿主系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程或微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及表達(dá)抗生素基因簇的載體宿主系統(tǒng)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鏈霉菌是一類高GC含量革蘭氏陽性細(xì)菌，一半已知的微生物抗生素來源于這個(gè)類群。生長(zhǎng)緩慢的常溫鏈霉菌是眾多重要抗生素的來源菌株，但是快速生長(zhǎng)的高溫鏈霉菌資源卻被發(fā)掘得很少。由于鏈霉菌模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌對(duì)于來源于大腸桿菌雙鏈DNA轉(zhuǎn)化有很強(qiáng)的限制修飾，所以幾十年來，與天藍(lán)色鏈霉菌分類學(xué)很近的丟失了內(nèi)源質(zhì)粒的沒有強(qiáng)限制修飾系統(tǒng)的變鉛青鏈霉菌菌株被用來作為基因克隆和表達(dá)的異源宿主。然而，與大腸桿菌和芽孢桿菌相比，常溫鏈霉菌生長(zhǎng)緩慢(在條件下用SMM培養(yǎng)基，M145指數(shù)生長(zhǎng)期倍增時(shí)間是2. 2小時(shí))。這就使得一般工業(yè)上需要2-3周的時(shí)間來產(chǎn)生和累積抗生素產(chǎn)物?？焖偕L(zhǎng)的高溫鏈霉菌已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了很長(zhǎng)的時(shí)間了。一些最早被描述的高溫鏈霉菌菌株沒有被歸入到高溫鏈霉菌屬。高溫鏈霉菌數(shù)值分類研究表明有三個(gè)主分支，五個(gè)次分支和兩個(gè)單菌株分支。對(duì)16s rRNA基因以及形態(tài)學(xué)和化學(xué)特性暗示它們屬于鏈霉菌屬。 大部分高溫鏈霉菌生長(zhǎng)溫度在^_55°C，它們是中度嗜高溫鏈霉菌。然而一些高溫鏈霉菌可以生長(zhǎng)高達(dá)68 V，S. thermoautotrophicus合適的生長(zhǎng)溫度是65°C并且低于40 V就不能夠生長(zhǎng)。高溫鏈霉菌在高溫條件下生長(zhǎng)快速，例如S. thermoviolaceus的倍增時(shí)間在50°C 只要一個(gè)小時(shí)。高溫鏈霉菌可以產(chǎn)生熱穩(wěn)定的工業(yè)酶如木聚糖酶(xylanase)，α淀粉酶 (alpha-amylase)禾口抗生素檔菌素(granaticin)禾口氛茵毒素(anthramycin)。因?yàn)楦邷劓溍咕€沒有建立遺傳操作系統(tǒng)，常溫鏈霉菌被用來表達(dá)來自于高溫鏈霉菌來源的基因和抗生素基因簇。工業(yè)生產(chǎn)中生長(zhǎng)快速的宿主菌將縮短發(fā)酵周期提高生產(chǎn)效率。因此，本領(lǐng)域迫切需要建立高溫鏈霉菌遺傳操作系統(tǒng)，并且最好該系統(tǒng)生長(zhǎng)速度快， 生產(chǎn)效率高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供表達(dá)抗生素基因簇的載體宿主系統(tǒng)及其應(yīng)用，所述系統(tǒng)生長(zhǎng)速度快，生產(chǎn)效率高。在本發(fā)明的第一方面，提供一種鏈霉菌，該鏈霉菌是中度嗜溫的鏈霉菌，能在 30-500C (較佳地37-45°C )生長(zhǎng)，其在45°C的生長(zhǎng)代時(shí)為小于2小時(shí)(較佳地為小于1. 5 小時(shí)，更佳地為1.1小時(shí))。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述鏈霉菌在50°C的生長(zhǎng)代時(shí)為小于2. 5小時(shí)；較佳的為小于 2. 4小時(shí)；更佳地為2. 3小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，所述的鏈霉菌的16s rRNA序列如SEQ ID NO 1所示；或所述的鏈霉菌的染色體復(fù)制起始區(qū)(ori，位于基因dnaA與dnaN之間的一段序列)序列如SEQ IDNO 3所示。在另一優(yōu)選例中，所述的鏈霉菌在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是CCTCC M 2010092 (4F)。在另一優(yōu)選例中，所述的鏈霉菌的16s rRNA序列如SEQ ID NO 2所示；或所述的鏈霉菌的染色體復(fù)制起始區(qū)(ori，位于基因dnaA與dnaN之間的一段序列)ori序列如SEQ ID NO 4 所示。在另一優(yōu)選例中，所述的鏈霉菌在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是CCTCC M 2010091 (2C)。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的鏈霉菌的用途，用于作為宿主系統(tǒng)表達(dá)外源基因或基因簇。在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組的宿主系統(tǒng)，所述宿主系統(tǒng)包括所述的鏈霉菌，以及包含于所述鏈霉菌中的外源基因或基因簇。在另一優(yōu)選例中，所述的外源基因或基因簇整合于所述的鏈霉菌的基因組上；或者所述的外源基因或基因簇包含于重組載體中，所述重組載體包含于所述鏈霉菌中。在另一優(yōu)選例中，所述的外源基因或基因簇是常溫或高溫來源的。在另一優(yōu)選例中，所述的外源基因簇是抗生素基因簇。在另一優(yōu)選例中，所述的抗生素是由鏈霉菌或放線菌產(chǎn)生的抗生素。在另一優(yōu)選例中，所述的抗生素選自氨茴霉素，放線紫紅素，有效霉素，林可霉素，紅霉素，土霉素，金霉素，四環(huán)素，碳霉素，竹桃霉素，麥迪霉素，特曲霉素，制霉菌素，兩性霉素，博萊霉素，雷帕霉素，替考拉寧，萬古霉素，去甲金霉素，多黏菌素B，達(dá)托霉素，妥布霉素，鏈霉素，奈替米星，阿米卡星，慶大霉素，卡那霉素，鏈霉素，普那霉素，多拉菌素，阿維菌素。在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)外源基因或基因簇的方法，包括培養(yǎng)所述的重組的宿主系統(tǒng)，使之表達(dá)外源基因或基因簇。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了用分離得到16S rRNA構(gòu)建的一個(gè)基于鄰接法(neighbor-joining)模型的進(jìn)化樹。圖2顯示了掃描電鏡觀察在MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)2天的4F和2C菌株樣品的生長(zhǎng)情況， 可以看到形成了長(zhǎng)的光滑孢子鏈。圖3顯示了將各分離得到的菌株的孢子懸液進(jìn)行10倍系列稀釋后涂布在MS培養(yǎng)基上，分別于30，37，45°C進(jìn)行培養(yǎng)，并在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照記錄觀察。圖4顯示了同等數(shù)目的孢子接種到TSB液體培養(yǎng)基(配方0xoid tryptonesoya broth powder (CM129) 30 克，加蒸溜水到 1000ml ；或參見 T. Kieser.，M.J.Bibb.， M. J. Buttner. , K. F. Chater. , D. A. Hopwood, page412, Practical Streptomycesgenetics, The John Inns Foundation, Norwich, England. 2000)培養(yǎng)，在不同的時(shí)間點(diǎn)收菌取樣，觀察4F和M145在不同溫度的生長(zhǎng)速率。
圖5顯示了定量研究放線紫紅素的產(chǎn)生情況，同等數(shù)量的M145孢子和4F接合子在不加KH2POjP CaCl2的R2YE液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，Iml培養(yǎng)液在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量OD值。圖6顯示了 4F的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS分析，觀察氨茴霉素的質(zhì)量峰。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的研究和篩選，找到了一種快速生長(zhǎng)的中度嗜溫的高溫鏈霉菌，該鏈霉菌能夠進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，可以成功表達(dá)外源的基因或基因簇。所述的鏈霉菌的生長(zhǎng)速度約是天藍(lán)色鏈霉菌的2倍，且是中度嗜溫的高溫鏈霉菌，具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。如本文所用，所述的“基因簇”指多個(gè)基因排列(如串聯(lián))而成的基因組合，該多個(gè)基因在功能上密切相關(guān)，通常一個(gè)基因簇含有1-100個(gè)基因。如本文所用，所述的“中度嗜溫的鏈霉菌”指能在30-50°C (較佳的37-50°C ；更佳地37-45 °C )生長(zhǎng)的鏈霉菌。如本文所用，所述的“代時(shí)”指鏈霉菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體量倍增一次所需要的平均時(shí)間，數(shù)值上與該鏈霉菌細(xì)胞復(fù)制周期的平均時(shí)間長(zhǎng)度相同。通常以小時(shí)為單位。如本文所用，所述的“抗生素”是具有抑制微生物生長(zhǎng)和繁殖，甚至殺死微生物功能的一種化學(xué)物質(zhì)?？股貞?yīng)用廣泛，除了用于抑制微生物，有的還可抑制腫瘤細(xì)胞、酶，或可降低膽固醇等?？股氐膩碓窗?xì)菌、放線菌、霉菌、真菌等微生物，植物，動(dòng)物。此外，也可用全化學(xué)或半化學(xué)的方法來生產(chǎn)抗生素。如本文所用，所述的“外源基因(簇)”與“異源基因(簇)”可互換使用，都是指非鏈霉菌本身自帶的基因(簇)。所述的外源基因或基因簇是常溫和高溫來源的。鏈霉菌鏈霉菌是微生物中抗生素產(chǎn)生的主要類群，但是常溫鏈霉菌常常生長(zhǎng)緩慢，工業(yè)生產(chǎn)過程中往往需要較長(zhǎng)的發(fā)酵周期周)，與大腸桿菌芽孢桿菌相比消耗更多的能量和材料。鑒于現(xiàn)有的常溫鏈霉菌生長(zhǎng)緩慢的問題，本發(fā)明人進(jìn)行了反復(fù)研究和篩選，從而獲得了快速生長(zhǎng)(兩倍快于天藍(lán)色鏈霉菌)的中度嗜溫的高溫鏈霉菌。利用所述的鏈霉菌可成功表達(dá)來自于高溫和常溫鏈霉菌的基因簇。因此，本發(fā)明提供了一種鏈霉菌，該鏈霉菌是中度嗜溫的鏈霉菌，能在30-50°C生長(zhǎng)，其在45°C的生長(zhǎng)代時(shí)為小于2小時(shí)；較佳地為小于1. 5小時(shí)；更佳地為1. 1小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，所述鏈霉菌在50°C的生長(zhǎng)代時(shí)為小于2. 5小時(shí)；較佳的為小于 2. 4小時(shí)；更佳地為2. 3小時(shí)。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)較佳的高溫鏈霉菌2C和4F。很多鏈霉菌的選擇標(biāo)記和載體都可以在這兩個(gè)菌株中使用。用鏈霉菌標(biāo)準(zhǔn)的原生質(zhì)體制備再生和轉(zhuǎn)化程序，發(fā)現(xiàn)2C具有很高的轉(zhuǎn)化效率。2C對(duì)于來源于鏈霉菌的外源雙鏈DNA幾乎沒有限制性，而4F 具有強(qiáng)的限制修飾作用。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的鏈霉菌在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是CCTCC M 2010092 GF)。更佳地，所述的鏈霉菌的16s rRNA序列如SEQ ID N0:1所示； 或所述的鏈霉菌的染色體復(fù)制起始區(qū)序列(ori序列)如SEQID NO 3所示。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述鏈霉菌4F具有下列生理特征可以在30_50°C的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，屬于中度嗜熱鏈霉菌。4F在37°C和45°C的MS培養(yǎng)基上可以在20小時(shí)就開始產(chǎn)孢，在MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度要比中溫鏈霉菌在30°C和37°C生長(zhǎng)得要快。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的鏈霉菌在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是2C CCTCC M 2010091 (2C)。更佳地，所述的鏈霉菌的16s rRNA序列如SEQID NO 2所示；或所述的鏈霉菌的染色體復(fù)制起始區(qū)序列(ori序列)如SEQ IDNO 4所示。所述的鏈霉菌可用于作為宿主系統(tǒng)，表達(dá)外源基因或基因簇。本發(fā)明對(duì)于外源基因沒有特別的限制，只要其能夠被鏈霉菌表達(dá)。此外，外源基因還包括其變體，該變體表達(dá)的蛋白與該外源基因表達(dá)的蛋白具有相同的功能。其通過插入或刪除部分堿基，進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來獲得。質(zhì)粒本發(fā)明還包括從所述的高溫鏈霉菌中分離得到的線型質(zhì)?；颦h(huán)型質(zhì)粒。本發(fā)明人從分離得到多株高溫鏈霉菌中檢測(cè)到了多個(gè)線型質(zhì)?；颦h(huán)型質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序這些質(zhì)粒與常溫鏈霉菌已知的質(zhì)粒有較高的同源性。脈沖電泳檢測(cè)到了染色體條帶，顯示染色體為線型構(gòu)型。用保守的端粒復(fù)制相關(guān)基因擴(kuò)增顯示25個(gè)中的11個(gè)是保守的端粒， 這個(gè)比率與常溫鏈霉菌的情況類似。pTSCl復(fù)制子能夠在常溫鏈霉菌和高溫鏈霉菌中正常復(fù)制，而且來自于常溫鏈霉菌的質(zhì)粒PlJlOl，pFRL2，pFPl和pFPll也能夠很好的在高溫鏈霉菌中復(fù)制。重組的宿主系統(tǒng)及表達(dá)基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種重組的宿主系統(tǒng)，所述宿主系統(tǒng)包括本發(fā)明所述的鏈霉菌，以及包含于所述鏈霉菌中的外源基因或基因簇。所述的外源基因或基因簇整合于所述的鏈霉菌的基因組上；或者所述的外源基因或基因簇包含于重組載體中，所述重組載體包含于所述鏈霉菌中。較佳地，所述的重組的宿主系統(tǒng)可用于抗生素的生產(chǎn)。抗生素通常是一種化學(xué)物質(zhì)(次生代謝物質(zhì)，小分子化合物)，其可以通過生物工程方法進(jìn)行生產(chǎn)。采用培養(yǎng)微生物的方法生產(chǎn)抗生素一般需要微生物細(xì)胞表達(dá)出目的抗生素生物合成途徑相關(guān)的一系列酶， 通過酶的催化，將細(xì)胞內(nèi)特定代謝前體經(jīng)過相應(yīng)的抗生素代謝途徑合成目的抗生素。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的鏈霉菌在導(dǎo)入外源的抗生素生物合成基因簇后，可良好地表達(dá)合成目的抗生素所需要的生物合成酶，由于本發(fā)明的鏈霉菌生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn)，可以顯著的縮短抗生素的發(fā)酵周期，從而更快地、高效地生產(chǎn)抗生素。所述的抗生素可以是由鏈霉菌或放線菌發(fā)酵生產(chǎn)的各種抗生素。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的抗生素選自但不限于氨茴霉素，放線紫紅素，有效霉素，林可霉素，紅霉素， 土霉素，金霉素，四環(huán)素，碳霉素，竹桃霉素，麥迪霉素，特曲霉素，制霉菌素，兩性霉素，博萊霉素，雷帕霉素，替考拉寧，萬古霉素，去甲金霉素，多黏菌素B，達(dá)托霉素，妥布霉素，鏈霉素，奈替米星，阿米卡星，慶大霉素，卡那霉素，鏈霉素，普那霉素，多拉菌素，阿維菌素等。應(yīng)理解，盡管實(shí)施例列舉了利用本發(fā)明的鏈霉菌生產(chǎn)氨茴霉素、放線紫紅素的實(shí)例，然而本領(lǐng)域人員知道不同抗生素的形成機(jī)制和生產(chǎn)方法是類似的，因此很顯然本發(fā)明的鏈霉菌也可用于其它抗生素的生產(chǎn)。表達(dá)外源基因或基因簇培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主系統(tǒng)(重組鏈霉菌)，使之表達(dá)外源基因或外源基因簇的方法可以參照本領(lǐng)域鏈霉素培養(yǎng)(或發(fā)酵)的常規(guī)方法，本發(fā)明沒有特別的限制。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，提供一種生產(chǎn)抗生素的方法，包括將常溫和高溫來源的抗生素合成基因簇轉(zhuǎn)化進(jìn)入本發(fā)明的鏈霉菌，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)化的鏈霉菌。將該轉(zhuǎn)化的鏈霉菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再用培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化鏈霉菌發(fā)酵獲得目的抗生素。這為異源表達(dá)提供了一個(gè)可以在高溫下生長(zhǎng)的宿主菌平臺(tái)。在鏈霉菌中導(dǎo)入外源基因或基因簇的方法也是本領(lǐng)域人員了解的，本發(fā)明沒有特別的限制。較佳地，提供一種在鏈霉菌中轉(zhuǎn)化入外源基因或基因簇的方法，包括制備鏈霉菌的原生質(zhì)體，通過大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移的方法將含有所述外源基因或基因簇的載體轉(zhuǎn)入鏈霉菌中，使其能夠穩(wěn)定復(fù)制并且表達(dá)轉(zhuǎn)入的基因或基因簇。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)找到了一種快速生長(zhǎng)的中度嗜溫的高溫鏈霉菌，其生長(zhǎng)速度2倍快于天藍(lán)色鏈霉菌，可成功表達(dá)外源基因或基因簇；并且，當(dāng)用于表達(dá)外源基因或基因簇時(shí)，可有效縮短發(fā)酵周期。(2)本發(fā)明的高溫鏈霉菌可良好地、高效地生產(chǎn)抗生素，且可以在高溫下生產(chǎn)，具有極大的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I.材料和方法菌株、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)方法本發(fā)明涉及的菌株和質(zhì)粒列出于表1中。表 權(quán)利要求
1.一種鏈霉菌，其特征在于，該鏈霉菌是中度嗜溫的鏈霉菌，能在30-50°C生長(zhǎng)，其在 45°C的生長(zhǎng)代時(shí)為小于2小時(shí)。
2.如權(quán)利要求1所述的鏈霉菌，其特征在于，所述的鏈霉菌的16srRNA序列如SEQ ID NO :1所示；或所述的鏈霉菌的染色體復(fù)制起始區(qū)序列如SEQ ID N0:3所示。
3.如權(quán)利要求1所述的鏈霉菌，其特征在于，所述的鏈霉菌在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是CCTCC M 2010092。
4.如權(quán)利要求1所述的鏈霉菌，其特征在于，所述的鏈霉菌的16srRNA序列如SEQ ID N0:2所示；或所述的鏈霉菌的染色體復(fù)制起始區(qū)ori序列如SEQ ID N0:4所示。
5.如權(quán)利要求1所述的鏈霉菌，其特征在于，所述的鏈霉菌在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是CCTCC M 2010091。
6.權(quán)利要求1-5任一所述的鏈霉菌的用途，用于作為宿主系統(tǒng)表達(dá)外源基因或基因簇。
7.—種重組的宿主系統(tǒng)，其特征在于，所述宿主系統(tǒng)包括權(quán)利要求1-5任一所述的鏈霉菌，以及包含于所述鏈霉菌中的外源基因或基因簇。
8.如權(quán)利要求7所述的重組的宿主系統(tǒng)，其特征在于，所述的外源基因簇是抗生素基因簇。
9.如權(quán)利要求8所述的重組的宿主系統(tǒng)，其特征在于，所述的抗生素是由鏈霉菌或放線菌產(chǎn)生的抗生素。
10.如權(quán)利要求8所述的重組的宿主系統(tǒng)，其特征在于，所述的抗生素選自氨茴霉素， 放線紫紅素，有效霉素，林可霉素，紅霉素，土霉素，金霉素，四環(huán)素，碳霉素，竹桃霉素，麥迪霉素，特曲霉素，制霉菌素，兩性霉素，博萊霉素，雷帕霉素，替考拉寧，萬古霉素，去甲金霉素，多黏菌素B，達(dá)托霉素，妥布霉素，鏈霉素，奈替米星，阿米卡星，慶大霉素，卡那霉素，鏈霉素，普那霉素，多拉菌素，阿維菌素。
11.一種表達(dá)外源基因或基因簇的方法，其特征在于，包括培養(yǎng)權(quán)利要求7-10任一所述的重組的宿主系統(tǒng)，使之表達(dá)外源基因或基因簇。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)抗生素基因簇的載體宿主系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明人找到了一種快速生長(zhǎng)和中度嗜溫的高溫鏈霉菌，該鏈霉菌能夠進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，可以成功表達(dá)外源的基因或基因簇。所述的鏈霉菌的生長(zhǎng)速度顯著快于天藍(lán)色鏈霉菌，且是中度嗜溫的高溫鏈霉菌，具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/76GK102277310SQ20101020033
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者覃重軍, 陳威華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院