專利名稱：提高外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)水平的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，主要是一種提高外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)水平的核苷酸序列。
背景技術(shù)：
近來越來越多的研究表明，基因的3’ UTR可通過影響mRNA的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)基因表 達(dá)。已經(jīng)有實驗證實，在mRNA3’UTR中存在降解相關(guān)元件，在影響mRNA穩(wěn)定上起重要作用。 除此之外，3’UTR可以多種方式調(diào)控基因表達(dá)，如mRNA前體的加工過程及有效的poly (A)聚 合依賴于3’UTR中的加尾信號，而poly㈧尾巴與mRNA的穩(wěn)定與翻譯密切相關(guān)；另外3’UTR 序列中包含的一些元件、序列可以調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性。富含AU區(qū)(AU_rich region, ARE) 是在3’ UTR中發(fā)現(xiàn)得較早的一個元件，通常被認(rèn)為是一個導(dǎo)致mRNA穩(wěn)定性下降的元件，并 且3’ UTR中ARE越多越不穩(wěn)定。與此相反，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因和鐵蛋白基因的3’ UTR中含 有IRE元件，在缺乏鐵離子的時候可以阻止mRNA降解。這些元件可能通過與其結(jié)合的RNA 結(jié)合蛋白影響mRNA的穩(wěn)定性和正常的翻譯。鑒于3’UTR具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的特點，我們就 可以利用其特點來增加基因的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高基因表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種提高外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)水平 的核苷酸序列，本發(fā)明的序列能夠增加基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物提高基因表達(dá)。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案這種提高外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)水平 的核苷酸序列，它是SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，atttcttttt cttgtcaact ttattgcatt cattcatgataataattgtc ttagt。本發(fā)明提供一段核苷酸序列，將它連接到基因編碼區(qū)的下 游后再進(jìn)行常規(guī)的外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)過程，可提高外源基因表達(dá)水平1倍以上。1)序列的獲得以擬南芥總 DNA 為模板，用 Pl (ATTTCTTTTTCTTGTCAACT)禾口 P2 (ACTAAGACAATTATTATCATGAA)引物進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。擴(kuò)增體系如下10 X PCR buffer 5 μ 1， 15mM MgCl2IOy 1，IOmM dNTPs 2 μ 1，IOmM Pf 禾口 Pu 各 3 μ 1，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1，無菌水補 足50 μ 1。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min ；93°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lm，35個循 環(huán)；72°C延伸IOmin。目的PCR產(chǎn)物大小約65bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)Qiagen凝膠純化試劑盒純化 后,利用 Promega T-vector 進(jìn)行 PCR片段的 TA 克隆，條件如下2XPromega Iigasebuffer 5ul, T-vector Iul，PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul，無菌水 lul，混勻后 4°C反 應(yīng)16h。反應(yīng)完畢后，取IOul反應(yīng)液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，輕 輕混勻冰上放置30m后，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB液體培養(yǎng)基 890ul。將離心管放于37°C搖床上震動培養(yǎng)Ih后，取300ul培養(yǎng)液涂布于含有l(wèi)OOmmol/L 氨芐青霉素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固體LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)14h。之后選擇白色的 菌斑送上海Invitrogen公司測序。含有插入序列的克隆命名為T-I。
2)序列的應(yīng)用方法利用分子生物學(xué)實驗技術(shù)將獲得序列連到外源基因編碼區(qū)終止密碼子的下游，以融合片段作為一個整體進(jìn)行常規(guī)的植物表達(dá)載體構(gòu)建后進(jìn)行外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)， 即可提高外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)水平。本發(fā)明有益的效果是本發(fā)明的序列，可提高外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)水平。


圖1 本發(fā)明序列連接到GFP的末端后提高GFP在煙草葉片內(nèi)的表達(dá)水平示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實施例應(yīng)用本發(fā)明提高GFP在煙草葉片內(nèi)的表達(dá)水平①序列的克隆以擬南芥總 DNA 為模板，用 Pl (ATTTCTTTTTCTTGTCAACT)禾口 P2 (ACTAAGACAATTATTATCATGAA)引物進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。擴(kuò)增體系如下10 X PCR buffer 5 μ 1， 15mM MgC1210y 1, IOmM dNTPs 2μ 1, IOmM Pf 禾口 Pu 各 3 μ l，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1(購自大 連Takara公司)，無菌水補足50 μ 1。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min ；93°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸lm，35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。目的PCR產(chǎn)物大小約65bp，PCR產(chǎn)物經(jīng) Qiagen凝膠純化試劑盒(德國Qiagen公司)純化后，利用Promega T-vector (美國Promega 公司)進(jìn)行PCR片段的TA克隆，條件如下2XPromega ligase buffer 5ul,T-vector lul, PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul (美國 Promega 公司)，無菌水 lul，混勻后 4°C 反應(yīng)16h。反應(yīng)完畢后，取IOul反應(yīng)液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的離心管中， 輕輕混勻冰上放置30m后，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB液體培養(yǎng) 基890ul。將離心管放于37°C搖床上震動培養(yǎng)Ih后，取300ul培養(yǎng)液涂布于含有IOOmmol/ L氨芐青霉素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固體LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)14h。之后選擇白色 的菌斑送上海Invitrogen公司測序。含有插入序列的克隆命名為T-I。②序列與GFP的融合根據(jù)測得的序列，設(shè)計引物P3 (ACAAACATGACGAACTCTAAATTTCTTTTTCTTGTCAACT) 和P4(GAGCTCACTAAGACAATTATTATCATGA，下劃線為SacI識別位點)，以T-I載體為模板進(jìn) 行 PCR 反應(yīng)。擴(kuò)增體系如下10XPCR buffer 5 μ 1,15mM MgCl2IO μ 1，IOmM dNTPs 2μ 1, IOmM Pf和Pu各3μ l，Taq酶(5U/μ 1) 1 μ 1 (購自大連Takara公司)，無菌水補足50μ 1。 反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min ；93°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lm，35個循環(huán)；72°C延 伸lOmin。目的PCR產(chǎn)物大小約65bp，PCR產(chǎn)物(產(chǎn)物1)經(jīng)Qiagen凝膠純化試劑盒(德 國Qiagen公司)純化。根據(jù)pBinGFP中的GFP序列和本發(fā)明序列設(shè)計引物P5 (GAATTCATG AAGACTAATCTTTTTCTCTTT，下劃線為 BamHI 識別位點)和 P6 (GTTGACAAGAAAAAGAAATTTAGAG TTCGTCATGTTTGT)，以pBinGFP質(zhì)粒為模板擴(kuò)增GFP序列。擴(kuò)增體系如下10 X PCR buffer 5 μ 1,15mM MgCl2IOy 1, IOmM dNTPs 2 μ 1, IOmM Pf 禾口Pu各 3μ l，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1 (大 連Takara公司)，無菌水補足50 μ 1。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min ；93°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸lm，35個循環(huán)；72°C延伸IOmin。目的PCR產(chǎn)物大小約750bp，PCR產(chǎn)物(產(chǎn)物2)經(jīng)Qiagen凝膠純化試劑盒(德國Qiagen公司)純化。將產(chǎn)物1和產(chǎn)物2稀釋100 倍后混合，以此為模板，用P4和P5為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增體系如下10XPCR buffer 5 μ 1,15mM MgCl2IOy 1, IOmM dNTPs 2 μ 1, IOmM Pf 禾口Pu各 3μ l，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1 (大 連Takara公司)，無菌水補足50 μ 1。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min ；93°C變性30s，55°C 退火30s，72°C延伸lm，35個循環(huán)；72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)Qiagen凝膠純化試劑盒純 化后，利用Promega T-vector (美國Promega公司)進(jìn)行PCR片段的TA克隆，條件如下 2XPromega ligase buffer 5ul, T-vector Iul，PCR 回收片段 2ul，Promega T4-ligase Iul (美國Promega公司)，無菌水Iul，混勻后4°C反應(yīng)16h。反應(yīng)完畢后，取IOul反應(yīng)液加 入到含有IOOul大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，輕輕混勻冰上放置30m后，42°C熱激90s， 立即放置冰上2-3m，向離心管中加入LB液體培養(yǎng)基890ul。將離心管放于37°C搖床上震 動培養(yǎng)Ih后，取300ul培養(yǎng)液涂布于含有100mmol/L氨芐青霉素、lmmol/L IPTG和IOmg/ L的固體LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)14h。之后選擇白色的菌斑送上海Invitrogen公司測序。 測序正確的克隆命名為T-GFP-1。③融合GFP在煙草葉片內(nèi)的表達(dá)將T-GFP-I中的融合片斷經(jīng)BamHI和SacI酶切后連入同樣酶切的pCV1300中，構(gòu)建pCVGFP-Ι載體；同時，利用同樣的方法構(gòu)建只含有GFP序列、不含有本發(fā)明核苷酸序列的 PCVGFP載體。將兩個載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105后，應(yīng)用瞬時表達(dá)系統(tǒng)注射本氏煙草葉 片，3天后觀測煙草葉片GFP熒光變化，并通過real-time PCR檢測GFP表達(dá)情況，結(jié)果如圖 2所示。在表達(dá)有pCVGFP-Ι的區(qū)域，GFP熒光明顯較強，而在表達(dá)有pCVGFP的區(qū)域，GFP熒 光相對較弱(圖la)。real-time PCR的結(jié)果也表明，pCVGFP_l區(qū)域的GFP表達(dá)水平要高 出pCVGFP區(qū)域的GFP表達(dá)水平1倍以上(圖lb)。實施效果利用本發(fā)明序列，可提高實驗中GFP基因在植物體內(nèi)的表達(dá)水平。 除上述實施例外，本發(fā)明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形 成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種提高外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)水平的核苷酸序列，其特征是它是SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)水平的核苷酸序列，它是SEQ ID No1所示的核苷酸序列，本發(fā)明提供一段核苷酸序列，將它連接到基因編碼區(qū)的下游后再進(jìn)行常規(guī)的外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)過程，可提高外源基因表達(dá)水平1倍以上。本發(fā)明有益的效果是利用分子生物學(xué)實驗技術(shù)將本發(fā)明序列連到外源基因編碼區(qū)終止密碼子的下游，以融合片段作為一個整體進(jìn)行常規(guī)的植物表達(dá)載體構(gòu)建后進(jìn)行外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)，即可提高外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)水平。
文檔編號C12N15/113GK101870973SQ201010201208
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者和瓊姬, 彭杰軍, 林林, 燕飛, 程曄, 鄭紅英, 陳劍平, 魯宇文 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院